Partie III: Récepteurs membranaires. RTK RTP Canaux Couplés R (RYK) (RYP) ioniques Prot G cytokines

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1 Partie III: Voies de signalisation des récepteurs Tyrosine kinases (RTK) Récepteurs membranaires À activité enzymatique Sans activité enzymatique RTK RTP Canaux Couplés R (RYK) (RYP) ioniques Prot G cytokines

2 Introduction Récepteurs enzymes rotéines transmembranaires monomériques ayant un domaine de liaison extracellulaire et un domaine catalytique intracellulaire activé par la liaison du ligand Par analogie, récepteurs binaires pour lesquels l activité catalytique est portée par une chaîne protéique différente de celle portant le site de liaison du ligand 2

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5 Partie III: Voies de signalisation des récepteurs Tyrosine kinases (RTK)

6 Rappel Les cellules fonctionnent en harmonie via des transferts d information, c est la signalisation. Le signal passe directement dans la cellule ou par un récepteur, entrainant une cascade de signalisation. Ceci aboutit à une réponse cellulaire variable en fonction des besoins, elle n est pas univoque mais dépend du contexte. Le devenir de la cellule repose sur la balance prolifération/apoptose : il existe de nombreuses voies de signalisation fonctionnant en parallèle et à bas débit, et à un moment donné l une d entre elle peut être activer entrainant la vie (prolifération) ou bien la mort (apoptose) de la cellule. 6

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8 Récepteurs-enzyme R tyrosine kinase (TK) qui sont 6 familles. Tous ont un domaine TK dans leur portion C- Terminale intra cytoplasmique. 1 seul domaine transmembranaire. Récepteurs TK se lient au ligand (noté L). * Soit les récepteurs existent sous forme de dimères. * Soit ils se dimérisent au moment de la liaison au L. Modification de conformation qui se transmet au domaine intra cellulaire activation du domaine catalytique et chaque récepteur phosphoryle une tyrosine de son partenaire. Recrutement de mol de signalisation qui se lient aux tyrosines phosphorylées. Activation d'autres molécules puis signal de dimérisation du ligand. 8

9 Etapes d action des RTK 9

10 Structure des RTK STRUCTURE TRIDIMENSIONNELLE : - Site actif (rond) = accueille ATP + substrat - Sites variables (triangles) = assurent la spécificité du récepteur pour son substrat (ces sites variables sont des insertions de 5 à 100 acides aminés). RTK : il en existe de très diverses familles, ce sont des molécules dimériques avec - une partie extracellulaire = très hétérogène ce qui permet une grande diversité de facteurs les activant. - une partie cytoplasmique = relativement homogène et contenant le domaine tyrosine kinase. ROLE : transfert d un phosphate à partir d ATP sur un résidu tyrosyl d une protéine. 10

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12 Signalisation via les RTK FONCTIONNEMENT : ces protéines fonctionnent comme des commutateurs (switch on/off) Le signal entre dans la cellule, la protéine cible est phosphorylée par une kinase et va avoir soit une activité accrue soit diminuée. Il existe un mode de régulation négatif par une phosphatase qui va dephosphoryler la protéine. À l état basal ce cycle fonctionne en permanence ce qui permet une grande souplesse de régulation. Plus le cycle est rapide plus la cellule va être réactive en changeant le statut de phosphorylation de toute une population cellulaire et donc mieux elle va s adapter au changement = réponse immédiate. 12

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14 DIFFERENTS MODE D ACTIVATION : - par un ligand dimérique - par double stimulation avec 2 ligands Ceci entraine une dimérisation du récepteur puis transphosphorylation (1 sous unité d une partie du récepteur phosphoryle une sous unité de l autre partie du récepteur et vice versa) = le récepteur est activé. Ensuite, il y a liaison des protéines cibles cytoplasmiques aux phosphotyrosines du récepteur activé via un domaine SH2 = propagation et amplification du signal. DOMAINE SH2 : module de branchement aux résidus phosphotyrosines. Il y a une certaine spécificité (n importe quel domaine SH2 ne va pas se lier à n importe quel résidu phosphotyrosine). GRB2 ( DOMAINE SH3 : permet à une protéine d intéragir avec une autre protéine présentant des sites riches en proline (séquence consensus : AA aliphatique - Proline p - AAa - P). 14

15 Les protéines adpatatrices Les protéines Ras Superfamille des proteines GTPase plus de 150 membre chez l home. 6 sous-famille : Ras, Rho, Ran, Rab, ARF 15

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18 REGULATION DES VOIES DE SIGNALISATION : Pour éviter l emballement des voies de signalisation : - Séquestration du récepteur dans le cytoplasme - Dégradation du récepteur (lysosome, protéasome) - Inhibition du récepteur - Inhibition des protéines avales de signalisation - Boucle de rétrocontrôle. 18

19 Arrêt du signal TKR 19

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21 Autres activités des RTKs 21

22 Récepteur au facteur de croissance épidermique (EGFR) Le récepteur à l EGF n est actif que sous forme dimérique, du coup on a diverses combinatoires possibles. Lorsque EGFR est activé on a activation de différentes voies qui concurrent à la prolifération cellulaire (voie des MAPK, voie PI3K, voie STAT et PLCγ) mais aussi l angiogénèse, la chimio et radiorésistance, et l invasion des métastases, notamment lors de surexpression de ErbB2. Remarque : on ne connaît pas de ligand propre à ErbB2 22

23 Prolifération cellulaire résulte d une réponse au RTK 23

24 Effets de ErbB2 ErbB2 peut s associer avec n importe quel autre membre de la famille et former des hétérodimères et lorsqu il y a une cela perturbe totalement la manière dont la cellule surexpression de ErbB2 répond aux facteurs de croissance épidermiques = hypersensibilité des cellules aux EGFR ( et donc angiogénèse, chimio/radiorésistance, invasion métastatique) Dans les cancers du sein, on recherche constamment la présence de ErbB2 (recherche via des Ac spécifiques par immunohistochimie) et on regarde si le gène de ErbB2 est amplifié car sa surexpression est de mauvais pronostic. A- Sans amplification de ErbB2 => traitement du cancer du sein par chirurgie puis hormonothérapie. EN CLINIQUE : B- avec amplification de ErbB2 => traitement du cancer du sein par chimiothérapie + thérapie ciblée (ciblant uniquement les cellules qui surexpriment ErbB2, comme trastuzumab qui empeche la dimérisation de l EGFR) 24

25 REMARQUE : *Les voies de signalisation sont toujours en action, le signal les accélère. *Une même voie n a pas toujours le même effet dans la cellule (dépend du contexte). 25

26 VOIE DES MAP KINASES : Activation du récepteur = Grb2 (protéine adaptatrice) facilite l accès de SOS au récepteur = activation de Ras (protéine G) = activation de Raf = cascade d activation de kinases avec amplification. En pathologie : Mutations activatrices de ces protéines entrainent des cancers (ce sont des protooncogènes) - Ras muté dans 90% des cancers pancréatiques - B-Raf muté dans 70% des mélanomes - EGFR muté dans 20% des glioblastomes Traitement: Industrie pharmaceutique découvre de plus en plus d inhibiteur spécifiques de ces protéines (ex PLX4032 qui bloque spécifiquement B-Raf et est donc utilisé spécifiquement chez les patients atteint de mélanome et présentant la mutation B-Raf). 26

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29 MAPK dans le cas normal et de tumeur 29

30 VOIE DE LA PI3 KINASE : VOIE DE LA PHOSPHOLIPASE C (PLC) : PI3 kinase phosphoryle PIP2 => PIP3 qui va activer Akt ce qui entraine l activation de différentes voies qui ont pour finalité : - inhibition de l apoptose. - survie cellulaire. VOIE STAT : Le facteur épidermique via EGFR va aller activer préférentiellement STAT3 Lorsque les STAT sont phosphorylées par les JAK ellles forment des homodimères qui vont dans le noyau pour activer/inhiber la transcription. 30

31 Etapes d activation des PLC et PI3K 31

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33 Protéine kinase SRC 1. PROTEINE KINASE SRC : protéine kinase cytoplasmique présente sur l EGFR 2. STRUCTURE : 3 domaines avec une courte région Nter et un court domaine Cter - domaine SH3 - domaine SH2 - domaine kinase 3. ACTIVATION : 1. Une phosphatase retire le phosphate inhibiteur 2. Une kinase phosphoryle un résidu tyrosine au niveau de la boucle d activation 3. Nef vient se fixer sur SH3 (modification tridimensionnelle) 3.1. Il faut donc 3 info différentes pour activer cette protéine SRC, cette activation dépend de l intégration de signaux spécifiques, c est à dire - le phosphate inhibiteur a t il été enlevé? oui = 1 ; non= 0 - le phosphate activateur a t il été ajouté? oui =1, non=0 - Nef est il présent? oui =1, non =0 seule la réponse 111 permet la transduction du signal 4. FONCTON : - Src vient se fixer au niveau du carboxyle terminal de l EGFR elle va phosphoryler la tyrosine 845 ce qui induit l activation des voies mitogènes (si src est mutée elle va promouvoir à qui mieux mieux l effet prolifératif de l EGF): - Src phosphoryle Cbl (importante pr induire la dégradation de l EGFR par le protéasome) ce qui entraine la dégradation de Cbl (donc pas de dégradation de EGFR) - Src peut induire ses propres signaux mitogènes et de survie 33

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35 TKR comme voie de cancer par mutation ou par l absence du ligands 35

36 RTK ET CANCERS STRATÉGIE D INHIBITION DES RTK ANTICORPS ANTI EGFR Il en existe plusieurs, qui agissent spécifiquement sur l EGFr en empêchant sa dimérisation, à savoir trastuzumab, pertuzumab On observe que la survie sans rechute chez des patientes atteintes de cancer du sain localisé avec surexpression de Erb2, traitées au trastuzumab + chimiothérapie est supérieur à la survie sans rechute des patientes traitées avec une chimiothérapie seulement. Il existe néanmoins des LIMITES : - il existe de nombreux récepteurs différents dans la famille de l EGF - la fixation d anticorps n entraine pas nécessairement une inhibition du récepteur (mutations!!!) - la cellule peut développer des mécanismes compensateurs (mutation hyperactivatrice des voies de signalisation sousjacentes) - l inhibition de l EGFR peut être toxique pour l organisme - traitement très cher (une perf = 1000 /sem)! 36

37 Les anticorps anti EGFR sont INEFFICACES s il y a mutation activatrice du gène KRAS (KRAS = protéine en aval du récepteur, si ce dernier est inactivé mais que KRAS est hyperactive, inhiber le récepteur ne sert à rien). L AMM impose donc de rechercher ces mutations somatiques fréquentes (il y en a 7 en tout) avant tout traitement par Ac antiegfr (si présence de la mutation pas de traitement) Après cela on applique la technique de Taqman avec une sonde qui va se fixer sur la sequence normale avec une fluorescence donné et avec une sonde qui va se fixer sur la séquence mutée (généralement on essaie de placer le fluorophore le plus puissant au niveau de la séquence mutée pr essayer d augmenter la détection des régions mutées). On regarde alors la fluorescence du signal à chaque cycle d amplification COMMENT RECHERCHER CES MUTATION? Pas par séquençage : car technique très peu sensible (il y a un mélange de tissu sain et de tumeur). Mais par PCR : à partir de pièces d exérèse incluses en paraffine puis colorées à l HES, la zone tumorale est ensuite délimitée par l anatomopathologiste, puis on extrait et quantifie l ADN. 37

38 INHIBITEURS DE TYROSINE KINASE Il en existe de différent types (naturels comme la curcumine, artificiels le gleevec). Un problème existe, il y a un manque de spécificité de ces inhibiteurs (spécificité dépend de la dose + présence d effets secondaires) 38

39 L intérieur de la cellule est encombré (de nombreux éléments sont présent dans le cytoplasme) c est pourquoi il existe des protéines échafaudages qui vont former des complexes multiprotéiques augmentant la probabilité de rencontres de protéines interagissant entre elles. Ces complexes multiprotéiques permettent également l embranchement avec une autre voie de signalisation (1 protéine d une voie peut aller activer une voie B), l amplification d une voie (1 protéine A peut activer plusieurs protéines B) 39

40 Site I Site II 40

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42 Récepteur canaux ionique 42

43 Récepteur canaux ionique-dépendants Peuvent être classés : I- Soit canal ionique et récepteur ne font qu un (A) : ce sont les récepteurs canaux ionique (RCI) ou récepteurs ionotropique, le ligand pouvant être extracellulaire ( le plus souvent neurotransmetteur ) ou intracellulaire ( un ion : Na +, k+ Ca++, ou une petite molécules p,ex, ATP), Ionotropique 43

44 Récepteur canaux ionique-dépendants II- Soit le canal ionique est couplé à un récepteur (B): ce sont les récepteurs couplés à des canaux ionique (RCCO) ou récepteurs métabotropique, la liaison au récepteur, le plus souvent un récepteur couplé aux protéines G ( ou RCPG), pouvant être : *Directe : par les P G elle-même o(gs, Gi et Gbg) *Indirecte : par un second messager ou une protéine kinase dépendent du RCPG ou d un récepteur membranaire (RM) Métabotropique N.B : Canal ionique = pore aqueux => Transport passif d ions (sens gradient électrochimique). 44

45 Récepteur canal ionique Ionotropique Métabotropique Acétylcholine Nicotinique Muscarinique (muscle squelettique) (muscle cardiaque) Glutamate NMDA, AMPA, kainate mglur GABA GABAA GABAB (Ac. -amino butyrique) Autres Sérotonine Adrénaline (β-adr.) 45

46 Récepteur canal ionique Récepteurs cholinergiques Ionotropique Type Métabotropique nicotinique Nom muscarinique rapide Conduction Lente SNC (10 %) + SNP Cell. Musc. Sq. Expression S.N. Expression périphérique SNC (90 %) + SNP Musc. card., Cell. Endo. 7 Sous-types 5 Excitateur Effet Excitateur / Inhibiteur 46

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48 Comparaison générale 48

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