CYTOMETRIE EN FLUX. Namur Mai Partim Roland Greimers Université de Liège. 1. Principes généraux et tri cellulaire 2.

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2 1 A. Généralités Fluorescence-2 Injection de cellules, une à une Miroirs dichroïques Liquide de gainage Fluorescence-1 Injecteur Echantillon Une cellule Filtres Lumière orthogonale réfractée (SSC, Texture) Liquide de gaine Laser Gicleur Impact laser (point d'analyse) Flux Barre d'arrêt Lumière axiale diffractée (FSC, Taille cellulaire) Première goutte (décision de tri) Champ électrique Lentille de focalisation Faisceau laser Flacons collecteurs Liquide de gaine (diamètre 70 µm) + = Flux Veine porteuse (diamètre 10 µm) Poubelle Figure 1: Principes de fonctionnement d'un cytomètre-trieur à flux. Fonction analytique: Les cellules injectées au centre d'une veine liquide indépendante (le liquide de gaine) adoptent une progression particulière en file indienne. Le flux tombe à l'air libre et croise un faisceau laser qui irradie une à une durant quelques µs toutes les cellules à la cadence moyenne de cellules / s. Durant cet instant, chaque cellule diffuse toujours une partie de la lumière incidente et émet simultanément une ou plusieurs lumières de fluorescences en fonction des sondes fluorescentes qu'elle porte. Les signaux lumineux captés par une optique appropriée sont transmis à des détecteurs photoélectriques puis à un ordinateur qui mémorise toutes les données individuelles et dans l'ordre de passage de chaque cellule. Fonction de tri: une fragmentation contrôlée du flux liquide en gouttes / s conduit à l'emprisonnement de chaque cellule dans une goutte peu après l'analyse dans un délai parfaitement connu par la machine durant lequel elle décidera de charger électrostatiquement chaque goutte contenant une seule cellule intacte et viable répondant à des critères désignés par le chercheur. Les gouttes chargées sont déviées de leur chute initiale par un champ électrique constant et dirigées vers des flacons récolteurs. La chambre de flux (Détail à droite). La suspension cellulaire est lentement injectée au centre d'un liquide de gaine dont l'écoulement est plus rapide. Le flux est laminaire, c est à dire que les deux liquides ne se mélangent pas et progressent chacun selon leur propre trajectoire. Il se crée une mince veine porteuse coaxiale au liquide de gaine qui contraint les cellules à s'aligner en file indienne dans le flux verticalement éjecté à l'air libre. 2

3 .. Laser Fluorescences SSC: REFRACTION, TEXTURE CELLULAIRE GRANULOSITE Une cellule FSC: REFLEXION DIFFRACTION, "OMBRE CELLULAIRE", TAILLE, AIRE DE SECTION. Diffusion orthogonale (SSC) Granulocytes Lymphocytes Monocytes Hématies, débris Diffusion axiale (FSC) Figure 2: Les paramètres de cytométrie en flux: Diffusions lumineuses et fluorescences. Emis dans toutes les directions de l'espace, les signaux sont captés dans deux directions privilégiées: diffusion aux petits angles (FSC) dans l'axe de la propagation laser; diffusion orthogonale (SSC) et fluorescences à 90 de cet axe. La fluorescence, 1000 fois plus faible qu'un signal de diffusion, ne peut pas être mesurée dans une autre direction sous peine d'être "noyée" par la lumière laser. Figure 3: Diffusions lumineuses et repérage des cellules. Par la seule mesure de l'intensité de la lumière réfléchie (FSC) ou réfractée (SSC) par un mélange hétérogène de cellules, il est souvent possible de repérer sans aucun autre artifice la présence de sous-populations cellulaires importantes. Chaque point représente une seule cellule classée selon les valeurs corrélées des deux paramètres cités. Ce type de graphique porte le nom de "diagramme de dispersion" ("dot plot") et constitue la représentation fondamentale des données de cytométrie Diagramme de dispersion Contours d'isodensité Fluorescence Nombre de cellules Diffusion axiale N Iodure de propidium R3 R2 R1 SSC R6 R5 R4 FSC FSC Diffusion axiale Fluorescence Histogrammes monoparamétriques Projection isométrique Figure 4 :Présentation des données. La figure montre les quatre types majeurs de représentation graphique des données de deux paramètres. Il s'agit ici de la diffusion lumineuse axiale, proportionnelle à l'aire de section apparente des cellules, et de la fluorescence verte induite par la fixation chimique d' hématies de poulet fixées au glutaraldéhyde Figure 5 Le diagramme d isodensités («density plot»). Il s agit d une présentation hybride entre les contours d isodensité et le diagramme de dispersion. L aire comprise entre deux courbes est coloriée en fonction du nombre de cellules présentes (vert:peu de cellules; orange: beaucoup de cellules). Les petits nombres de cellules sont représentés par de gros points isolés. L iodure de propidium est un fluorochrome rouge qui s intercale dans l ADN des cellules fixées ou mortes (membrane altérée).les cellules mortes diffractent aussi moins de lumière. R1 ou R4: cellules vivantes; R2 ou R5: cellules mortes; R3 ou R6: débris, corpuscules nucléaires denses non colorables. Le choix R4 est le plus fréquent; le choix R1 est néanmoins plus précis. FL1 Données brutes FL1 Données sélectionnées R1 FSC FSC R1 FSC FSC Figure 6: La sélection électronique des données. La séquence de gauche montre les mesures brutes (FSC, FL1) d'hématies de poulet autofluorescentes. La séquence de droite montre les distributions des données sélectionnées FL1 FL1 3

4 Passe-haut 100 Passe-bas % Transmission Bande passante 100 Filtre de densité λ Figure 7: les filtres optiques. Un filtre optique est une lame plane de verre, ou de matériau plus complexe, dont le rôle est fondamental puisqu'il sélectionne la frange du spectre lumineux à transmettre, atténuer, arrêter ou dévier afin que chaque détecteur ne capte que le signal lumineux qui lui est destiné. Cette figure montre les quatre types principaux de filtres caractérisés par un spectre de transmission (zone hachurée): le filtre passe-haut transmet toute lumière au delà d'une certaine longueur d'onde. Le filtre passe-bas réalise l'inverse. Le filtre à bande-passante est le plus utilisé et le plus sélectif d'une zone spectrale étroite; Le filtre de densité est un filtre neutre perméable à toute lumière mais qui en atténue fortement l'intensité. Il est indispensable pour atténuer les signaux de lumière diffusée, beaucoup plus intenses que les signaux de fluorescence. Des miroirs dichroïques semi-transparents (non repris sur la figure) combinants ces différentes propriétés sont également utilisés dans les systèmes optiques complexes devant discriminer plusieurs lumières de fluorescence de couleur différente et les transmettre chacune vers un détecteur particulier. Spectre FITC Spectre R-PE BP530/30 BP575/42 Emission totale de fluorescence FL1 Em530 = + Emission totale de fluorescence FL2 Em575 = + Fluorescence (intensité relative) Fluorescence propre captée de: FITC R-PE: Fi530 Contaminations: de FITC par R-PE, Pe530 Pe575 de R-PE par FITC Fi575 Longueur d'onde (nm) λ Figure 8: Le problème des fuites optiques; cas du couple FITC / R-PE. Les filtres à bande passante ne suffisent pas à discriminer les fluorescences propres des deux fluorochromes analysés simultanément. Une compensation électronique en temps réel ou par calcul en temps différé permet d'éliminer de façon optimale les contaminations transmises. 4

5 . Pas de compensation N FL1 FL2 Compensations optimales Trop de compensations Figure 9: Compensation électronique du couple FITC-PE. Des lymphocytes normaux isolés du sang périphérique sont marqués par un anticorps anti-cd4-fitc et un anticorps anti-cd8-pe. Les deux marqueurs de surface reconnus sont, pour la plupart des cellules, mutuellement exclusifs. Cette préparation est un témoin utile pour effectuer directement une double compensation afin d'optimaliser la réception des deux fluorescences, connaissant à l'avance la distribution à obtenir: lorsque la compensation des fuites optiques est réalisée (dot plot central),trois populations lymphocytaires doivent être détectées: les cellules CD4+ dans le quadrant numéro 1; les cellules CD8+ dans le quadrant numéro 4; les cellules négatives, n'exprimant aucun de ces deux récepteurs, dans le quadrant numéro 3. Il n'existe pas ou peu de cellules simultanément positives pour CD4 et CD8 (quadrant numéro 2). Si la compensation est sousestimée, des cellules CD4 ou CD8 positives sont faussement classées dans le quadrant 2. En surcompensation, ces mêmes cellules sont écrasées sur les axes. Tension PMT volts volts 10 Un photon Photocathode Anode intensité (Volts) Amplitude mesurée Dynode niveau de seuil niveau de bruit de fond Amplification: Gain X1 à X16, Log 10 6 électrons Temps de vol (microsec.) Mesure 10 Volts Seuil (Threshold) section du faisceau laser 0 Convertisseur Analogique => Digital 0 volts => canal volts => canal (ou 255) une cellule Direction du flux Figure 11 : La mesure des impulsions. La traversée du rayon laser par une cellule génère une impulsion électrique amplifiée par un PMT (à gauche) dont l'amplitude (à droite) est à chaque instant proportionnelle à l'énergie lumineuse incidente qui varie selon une loi normale le long du diamètre du faisceau parcouru, et dont la durée est fonction du temps de la traversée ("temps de vol"). Pour une valeur d'énergie incidente donnée à un instant donné du parcours, l'impulsion électrique est analogiquement proportionnelle à l'intensité du phénomène lumineux capté, à savoir un signal de diffusion ou de fluorescence. Afin d'obtenir des mesures homogènes, il faut donc réaliser celles-ci toujours au même instant choisi lorsque le signal est particulièrement net (distinct du bruit de fond): le cytomètre à flux conventionnel mesure l'amplitude maximale de l'impulsion, atteinte lorsque la cellule franchit le centre du faisceau lumineux. 5

6 Notion de temps mort du cytomètre : Tant que la cellule est dans le laser et traitée par le cytomètre, celui-ci ne sait pas analyser une autre cellule qui arriverait trop vite derrière la première ; il existe une durée incompressible, appelée «temps mort» durant laquelle l électronique est entièrement consacrée à l étude de la première cellule. Toute autre cellule arrivant dans le cytomètre alors que l analyse de la cellule en cours n est pas terminée ne sera NI détectée, NI a fortiori analysée : elle est en coïncidence et rejetée de l analyse. Conséquence : il existe des cellules (par ex. 2%) qui NE SONT JAMAIS VUES par le cytomètre : un cytomètre est un très mauvais moyen pour COMPTER directement des cellules en nombre absolu. Cette notion est fondamentale dans le tri cellulaire. Veine porteuse Une cellule 1,00 0,97 FL1 A B N a FSC 0,00 b Laser #1 FSC 0,95 C D c 0,56 d Laser #2 1,00 0,99 Laser #3 Figure 12: L'alignement géométrique du laser et du flux. L'impact d'un faisceau laser sur une cible (le flux) donne un spot lumineux dont l'intensité est variable dans toute sa section selon une loi approximativement normale: l'énergie lumineuse, pratiquement nulle à la circonférence du spot, augmente concentriquement jusqu'au centre de celui-ci. Le premier laser (#1) est orthogonal au flux qui traverse le faisceau par son diamètre: l'alignement est optimal et les différences d'irradiation lumineuse que subissent des cellules selon leur position relative dans la veine porteuse sont minimisées. Ce n'est plus le cas avec le second laser (#2) qui est décentré et responsable de mesures hétérogènes vides de sens. Le troisième faisceau laser (#3) est de section elliptique afin d'homogénéiser davantage les conditions d'illumination; il est rencontré sur les cytomètres les plus récents. Figure 13: L'incidence de l'alignement du flux sur les mesures. Diffusion lumineuse axiale (FSC) et autofluorescence (FL1) de hématies de poulet fixées au glutaraldéhyde. A-D: diagrammes de dispersion FSC/FL1; a-d: histogrammes correspondants de la distribution de FSC. A,a: flux parfaitement aligné; signaux de référence. B,b: faisceau laser légèrement décentré; C,c: le laser passe partiellement sous la barre d'arrêt (voir figure 1); D,d: laser fortement décentré. Les mesures réalisées dans les conditions B à D n'ont aucune valeur. Il faut noter que des déformations identiques peuvent être générées sous d'autres conditions expérimentales défavorables; par exemple, la situation B,b existe aussi lorsque la vitesse de passage des cellules dans le flux, même bien aligné, est trop grande ; la situation D,d peut aussi indiquer la présence d'un obstacle (un «bouchon») qui obstrue partiellement le gicleur et qui perturbe le flux. Remarquez que le cytomètre donne TOUJOURS des résultats quelque soient vos conditions de travail!!!! 6

7 . 4 B A B Intensité relative 3 2 B 1 A A Microscope Cytomètre à flux : Faisceau laser large Faisceau laser mince Cellule "A": diamètre 20 µm; contient molécules fluorescentes Cellule "B": diamètre 10 µm; contient molécules fluorescentes Figure 14: le cytomètre et le microscope. Brillance relative de deux cellules différentes par leur taille et par leur nombre de molécules fluorescentes internalisées, selon qu'elles sont observées au microscope à fluorescence ou mesurées au cytomètre à flux dans deux conditions d'irradiation lumineuse. Le cytomètre conventionnel à faisceau laser large (résolution "zéro") mesure l'amplitude des impulsions, proportionnelle à la quantité totale de fluorochrome présente par cellule. Lorsque le faisceau est plus mince que la cellule à mesurer, c'est l'aire de l'impulsion qui donne cette information, tandis que l'amplitude est maintenant proportionnelle à la densité en fluorochrome (ici, nombre de molécules par unité de volume) c'est à dire à la brillance de la cellule. On rejoint alors la situation observée au microscope qui, si le grandissement est suffisant pour discerner la taille des cellules, révèle également la brillance de chaque cellule: la cellule 'B' apparaîtra comme un petit objet très lumineux, tandis que la cellule 'A' semblera de grande taille mais de luminescence médiocre. Ce n'est que si le grandissement du microscope devient insuffisant et tel que les cellules ne révèlent plus aucun détail que la situation peut s'inverser et correspondre à ce qui est observé en résolution nulle. 7

8 . 1 B : Tri cellulaire Quartz ro Ao r Z λ Figure 14 : Instabilité du flux. Une veine liquide est soumise à une oscillation sinusoïdale entretenue mécaniquement par la vibration ultrasonique d'un quartz. Celle-ci engendre de petites variations périodiques du rayon de la section circulaire du jet. La valeur r de ce rayon en tout point Z de la progression longitudinale du liquide est donnée par la relation r= ro + Ao.sin (2 p.z/ λ), où ro est le rayon initial du jet non perturbé, Ao l'amplitude initiale de l'oscillation et λ la longueur de l'onde stationnaire résultante. La colonne liquide est instable dès que λ devient supérieure au périmètre (2 p.ro) du jet. A ce moment, l'amplitude de l'oscillation de la veine liquide croît exponentiellement le long de l'axe Z jusqu'à devenir supérieure au rayon du jet qui se rompt alors en gouttelettes. Il y a donc une partie du jet qui reste intacte avant de se rompre en gouttes. 0,25 mm Sommet du gicleur Impact laser Distance 'D' mesurée λ Distance 'D' reportée ==> Délai de charge = temps de formation de 11 gouttes. Figure 15: L'estimation pratique du délai de charge. La photographie du flux est réalisée à travers un microscope d'observation. Un quart de mm après l'orifice du gicleur, le flux est frappé par le rayon laser. On constate que le flux reste intact sur une certaine distance avant de se rompre en gouttelettes. Le délai de charge est le temps de transit d'une cellule pour aller de l'impact laser à la première gouttelette: c'est le temps d'attente qui sépare l'analyse d'une cellule du chargement électrostatique éventuel de la gouttelette qui contiendra cette cellule, c'est à dire son tri effectif. Ce temps doit être communiqué à la machine par l'expérimentateur de la manière suivante: La longueur D est donnée par la mesure du segment de liquide intact compris entre le centre de l'impact du laser et le point de formation de la première gouttelette. Cette longueur est fonction de l amplitude Ao de la vibration que l utilisateur impose au jet (figure 2.19). La longueur D est reportée dans la zone D des gouttelettes libres et le nombre de gouttelettes comprises dans cet intervalle est compté avec précision (au quart de goutte près). On dénombre içi 11,25 gouttes. Ce nombre est communiqué au cytomètre qui, connaissant le temps de formation d'une goutte, connaît à présent le délai de charge. λ : longueur d'onde de la formation des gouttes. 8

9 . Temps 0 Temps 1 A B Temps 0 Temps 1? Figure 16: L'incertitude de position d'une cellule. Les légères fluctuations des vitesses des cellules injectées aléatoirement dans le flux a pour conséquence une absence totale de synchronisme entre l'arrivée d'une cellule et la formation périodique d'une goutte. Il en résulte une incertitude quant à la désignation exacte de la goutte qui emprisonnera une cellule particulière. La situation (A) montre une cellule dont la destination est incertaine: trop proche d'une constriction du flux, elle pourra être incluse dans la goutte en formation ou dans la goutte suivante. La situation (B) montre le cas idéal d'une cellule positionnée dans un renflement du flux destiné à constituer une goutte que la cellule accompagnera sans ambiguïté. En pratique, l'expérimentateur choisira de dévier un train de plusieurs gouttes successives (généralement 3) associé au tri de chaque cellule. Une seule goutte du train contient idéalement une cellule désirée, les autres gouttes sont vides selon toutes probabilités. En effet, la fréquence de formation des gouttes est très supérieure au débit cellulaire et de très nombreuses gouttes vides séparent deux cellules successives. Le cas d'un train de gouttes contenant plus d'une cellule est une coïncidence que le cytomètre peut éliminer. A Volts λ B Amplitude temps Figure 17: L'impulsion de charge électrostatique d'un train de trois gouttes. Le signal (A) visualise l'impulsion électrique de charge. L'onde sinusoïdale (B) est la fonction de la vibration appliquée au flux et qui conduit à la formation périodique d'une goutte, visualisée en (A) par un petit trait vertical plaçé à intervalles de temps réguliers. Les trois gouttes d'un train sont soumises à une impulsion électrique croissante (A) de telle sorte que la charge électrique finale portée par chaque goutte (zones hachurées) soit identique. Une décharge électrique de signe opposé neutralise immédiatement le flux avant la formation de la quatrième goutte. Le flux est alors prêt pour un nouveau cycle de tri. Afin d'assurer un synchronisme parfait entre la formation des gouttes et leur chargement électrostatique, il est nécessaire que l'onde électrique de charge coïncide avec l'onde mécanique de formation d'une goutte. Ces deux ondes totalement indépendantes doivent être mises en phase par l'opérateur (figure 2.23). L'onde (B) complète est en phase avec l'onde de charge (A). L'onde (B) partielle est en déphasage: la goutte se forme trop tard après l'envoi de l'impulsion de charge qui sera mal distribuée. 9

10 Gicleur F l u x Champ électrique 3 jets cohérents: phase correcte Multitude de jets: déphasage important Figure18 : La phase de l impulsion de charge. L utilisateur doit ajuster la cohérence des jets latéraux induits par le champ électrique par une mise en phase de l onde de charge et de l onde de formation des gouttes. Voir aussi la figure précédente. C A B Temps 1: Charge nulle Temps 0 Charge négative Temps 1: Charge nulle 1 Satellite lent Satellite rapide Lien 1 Charges aléatoires Charges conservées Satellite lent il est rattrapé par la goutte suivante Figure 19: Gouttes satellites et tri. En (A), le lien unissant le jet parental à la goutte principale en formation va se briser et former une goutte satellite lent ou rapide, selon l endroit (1) de la première rupture. Dans un tri, l'absence de satellites ou l'apparition d'un satellite rapide est préférable. En effet, considérons une impulsion de charges électriques négatives envoyée au temps 0 au travers de tout le flux pour charger la goutte en formation, suivie au temps 1 d'une absence d'impulsion pour rejeter la goutte suivante dont le tri n'est pas désiré. Le satellite formé au temps 0 portera, dans tous les cas, également une charge négative. Si le satellite est rapide (B), il rattrapera la goutte précédente déjà chargée négativement et dont il modifiera peu ou pas la charge totale. Si le satellite est lent (C), il fusionnera avec la goutte suivante dont la charge initialement nulle va être contaminée, perturbant le tri. Figure du bas: photographie digitalisée du flux (agrandissement de la figure 2.20), révélant la présence de satellites. Diamètre du jet: 70 µm. 10

11 Première goutte Troisième goutte Analyse Temps (µs) A B C D E F Situation Détection Analyse Tri (Mode 1) Tri (Mode 2) A Cellule ignorée non non non non B Doublet Erreur Erreur Erreur Erreur C Coïncidences d'analyse oui non non non D Coïncidences de tri oui oui non non E Coïncidences de tri oui oui non oui F Hors coïncidences oui oui oui oui Pureté du tri Très élevée Modérée Recouvrement / Rendement du tri Modérés Très élevés Figure 20: Temps de coïncidences, analyse et tri cellulaire. Selon le moment considéré et la distance (le temps) qui sépare deux cellules successives, il existe des cellules qui ne sont jamais détectées (A), qui sont détectées mais pas analysées (C), ou qui sont analysées mais pas nécessairement triées, même si ces cellules sont désirées (D,E). Lorsqu'elles se suivent dans un délai supérieur au temps de formation d'un train de gouttes (3 gouttes dans cet exemple), les cellules sont toujours détectées, analysées et triées (F). Les cellules accolées (doublets), considérées comme particule unique, sont une source d'erreurs systématiques (B). Les coïncidences d'analyse et de tri sont, en principe, toujours reconnues (C, D, E). Echelle de temps: [- 10 à 0 µs]: temps mort du cytomètre (gestion interne); [0-10µs]: traversée du laser (mesures et analyses); 35 µs: formation d'une goutte; 105 µs: le train de 3 gouttes est achevé. Modes de tri: 1): Tri pur : seuls les trains constitués de 2 gouttes vides et d'une goutte contenant une cellule désirée sont déviés de leur trajectoire (F); 2) : Enrichissement : une cellule supplémentaire, bonne ou mauvaise, peut faire partie du convoi (E). 11

12 Ci 0,5 0,4 0,3 0,2 0, Figure 21 : Fréquence (Ci) des coïncidences. Elle est donnée par la relation Ci = 1 - exp (- t. U). Le débit cellulaire U indique le nombre total de cellules traversant le cytomètre à chaque seconde; les temps t = 10 à 110 µs sont différents intervalles de temps de coïncidence nécessaires au cytomètre pour traiter une seule cellule (10 µs = analyse; > 10 µs = analyse suivie du tri) Débit cellulaire, Ps 1,0 85 0, , , ,6 0, Figure 22: Le rendement théorique du tri. Le rendement du tri est égal à la probabilité Ps de trier effectivement une cellule désirée. Ps est une fonction du débit cellulaire total U, du temps T de formation d'une goutte, du nombre n de gouttes déviées par train, et de la fraction k que représente la population cellulaire que l'on désire trier par rapport à l'ensemble des cellules analysées. On a: Ps = exp (- (1-k) UTn). Les rendements ont été calculés pour k = 5 à 85 %; n = 3; T = 1 / ; et U variant de 1 à cellules /s U Rs U Figure 23: Le débit du tri. Le débit du tri est le nombre Rs de cellules déviées chaque seconde vers un flacon collecteur. Il augmente en fonction du débit cellulaire U total et est fonction de la fraction cellulaire k à trier ainsi que du rendement Ps de tri, deux paramètres définis à la figure On a: Rs = k. U. Ps (équation 4). Cette augmentation n est pas infinie. Si on augmente encore le débit cellulaire total U, le débit Rs des cellules triées passe par un maximum et diminue puis s'annule d'autant plus rapidement que la fraction k de la population cellulaire à trier est petite. 12

13 Lignée MP2 Lyt-2 (CD8) L3T4 (CD4) Clones Figure 24: Une expérience de clonage. Quatre clones sélectionnés sur la base de l'expression des marqueurs CD4 et CD8. 1: CD4-8-; 2: CD4+8+; 3: CD4+8-; 4: CD4-8+ (Greimers et al, 1986). La pureté du tri est de 100%, obtenue au débit de 500 cellules/s et un train d une seule goutte (Mode Counter) Ordonnée: nombre de cellules. A B C R1 R1 R1 R2 R2 R2 15% 85% 2% 98% 99% 1% Figure 25: Tri en masse de cellules. A: 85% des cellules expriment un récepteur détecté par un anticorps fluorescent. B: tri des cellules positives: pureté de 98 % C: tri des cellules négatives: pureté de 99 %. La pureté du tri des cellules non marquées est toujours supérieure à celle des cellulesmarquées : les tris par sélection négative sont toujours plus intéressants, d autant plus que l absence de marquage assure aussi une viabilité cellulaire meilleure. Train de 3 gouttes à la fréquence de Hz, débit inférieur à cellules / s. Gicleur 70 µm. 13

14 2. DNA A S C 1000 Nombre de cellules 0 G2 M 2C G1 G1 ADN B 2 1 S 4C Numéros de classes (unité arbitraire) G1 S G2M G1 G2M Temps Figure 1: La distribution de l'adn au cours d'un cycle de division cellulaire. A: Les cellules d'une population asynchrone en cycle parcourent les phases chronologiques G1, S, G2, M. B: Relation entre le contenu en ADN d'une cellule et sa position temporelle dans le cycle. C: Distribution de l'adn obtenue par la mesure d'un grand nombre de cellules de la population 'A'. En traits gras, l'histogramme idéal qui serait obtenu en l'absence d'erreurs de mesures. En hachuré, l'histogramme expérimental caractérisé par une distribution gaussienne des mesures qui est particulièrement visible de part et d'autre des pics G1 et G2M. La largeur du pic G1, ou sa dispersion donnée par le coefficient de variation CV% = 100.(écart-type / moyenne), est une estimation de la précision des mesures. Elle peut être inférieure à 2%. Nombre de cellules Loi normale ajustée à la phase G1... distribution expérimentale polynôme ajusté à la phase S Loi normale ajustée à la phase G2M Contenu en ADN Figure 2 : Le modèle de Dean et Jett. Ce modèle utilise des distributions normales pour estimer les phases G1 et G2M, ainsi que pour moduler l'allure du polynôme du second degré ajusté à la phase S. Remarquez que la phase S déborde beaucoup sur G1 et sur G2 : à cause des erreurs expérimentales et de la précision insuffisante du cytomètre, une cellule qui débute S reste confondue avec G1 et une cellule qui termine S est déjà classée en G2 : seuls des programmes mathématiques tels que celui-çi peuvent résoudre le problème. Alternative pour éviter les mathématiques : utiliser un marqueur de la phase S, par exemple la BrdU. 14

15 Cellules µl de tampon citrate et diméthylsulfoxyde stockage -80 C µl Solution A: Nonidet P40 Trypsine Spermine 10 minutes µl Solution B: Inhibiteur de trypsine Ribonucléase A 10 minutes µl Solution C: Iodure de propidium 15 minutes FACS Vindelov et al, 1983 Figure 3 La méthode de Vindelov. L'ajoute séquentielle de trois solutions A, B, C à un prélèvement cellulaire frais ou congelé conduit à l'isolement des noyaux et à l'analyse de leur ADN en moins de 40 minutes. Protocole : la méthode de Vindelov. Un kit est commercialisé par Becton Dickinson (cat n , CycleTEST ). Les tampons: Tampon citrate: Il est facultatif et utilisé si on désire conserver le prélèvement à -80 C avant l isolement des noyaux. 85,5 g de saccharose (250 mm) et 11,76 g de citrate trisodique.2h20 (40 mm) sont dissouts dans 800 ml d'eau distillée; 50 ml de diméthylsulfoxyde sont ajoutés; le volume est porté à ml avec de l'eau distillée puis le ph est ajusté à 7,6. Solution mère de A, B, C: 2 g (3,4 mm) de citrate trisodique.2h2o; 2 ml (0,1% v/v) de Nonidet P40 (Sigma N3516, St. Louis, MO, USA); 1,044 g (1,5 mm) de spermine tétrahydrochloride (Sigma S2876); et 121 mg (0,5 mm) de tris(hydroxymethyl-)aminomethane (Sigma T1378) sont dissouts dans un volume d'eau distillée porté à 2 litres après un ajustement du ph à 7,6. Cette solution mère constitue la base des solutions suivantes: Solution A: 15 mg de trypsine (Sigma T0134, Grünwalder, Allemagne Fédérale) sont dissouts dans 0,5 litre de solution mère. Le ph est réajusté à 7,6. Solution B: 250 mg d'inhibiteur de trypsine (Sigma T9253) et 50 mg de ribonucléase A (Sigma R4875) sont dissouts dans 0,5 litre de solution mère. Le ph est réajusté à 7,6. Solution C: 208 mg (416 µg/ml) d'iodure de propidium (3,8-diamino-5-diethylmethyl-aminopropyl-6- phenanthridinium diiodide; Sigma P4170) et 580 mg de spermine tétrahydrochloride (Sigma S2876) sont dissouts dans 0,5 litre de solution mère. Le ph est réajusté à 7,6. Les solutions A, B, C, ainsi que le tampon citrate sont aliquotés en tubes de polypropylène d'une contenance de 5 ml (Nunc , Intermed, Kamstrup, Danemark) et congelés à -80 C dans un mélange de neige carbonique et d'éthanol 99%. Le stockage au congélateur à - 80 C est d'une durée illimitée. La solution C doit être protégée de la lumière. Méthode: Les solutions A, B, C et le tampon citrate sont rapidement dégelés au bain-marie à 37 C. La solution C doit rester froide (4 à 8 C), tandis que les autres solutions s'utilisent à la température ambiante (20 C max.). Un à 2 millions de cellules sont traitées par un petit volume (200 µl max.) de tampon citrate auquel on ajoute 1,8 ml de la solution A. Dans certains cas, il est souhaitable d éviter le tampon citrate. Un retournement du tube assure l'homogénéisation du mélange. Après une incubation de 10 minutes à la température ambiante, on ajoute 1,5 ml de la solution B. Un retournement du tube homogénéisera à nouveau le mélange. Dix minutes plus tard, 1,5 ml de la solution C est ajouté. Le mélange final est homogénéisé par un léger mixage. L'analyse au cytofluoromètre à flux est réalisée après 10 minutes d'incubation sous une excitation laser bleue (488 nm) à la puissance de mw; la fluorescence des complexes ADN-iodure de propidium est sélectionnée par un filtre transmettant la lumière orange-rouge, au choix à 575, 620 ou 670 nm. 15

16 Bloc de paraffine Sections >50 µm Déparaffinage: 14 heures xylol éthanol eau : 1 nuit Digestion, coloration: < 1 heure PI, RNase filtration, centrifugation pepsine agitateur FACS Figure 4: La méthode de Hedley. Elle permet d'obtenir des noyaux isolés intacts analysables par cytométrie en flux à partir de matériel archivé déjà inclus dans la paraffine. La seule condition absolue de réussite est que ce matériel ait été fixé au formol, exclusivement. HEMATIES DE TRUITE ET DE POULET: 2 REFERENCES INTERNES P T 2C 4C G1 Tumeur Diploïde S G2M G1 Tumeur Hypotétraploïde G2M S ADN Figure 5: La nécessité de références internes.- L'introduction de cellules xénogéniques de contenu en ADN connu [poulet (P) et truite (T) ] dans le prélèvement permet de fixer deux points de références dans le but de pouvoir comparer les échelles de fluorescence (= de contenu en ADN) de deux échantillons analysés à des moments différents ou dans des laboratoires distincts. En effet, imaginez cette figure débarassée des références : il n'existe aucun moyen de connaître le degré de ploïdie de ces tumeurs à la distribution d'adn simple. Le fait que la seconde distribution soit déplacée à la droite de la première peut être le résultat d'un excès de colorant ou d'une configuration différente du cytomètre. 16

17 1000 GoG1 diploïde index ADN = 1. GoG1 aneuploïde, tumoral, index ADN = 1,4 Nombre de cellules Phase S tumorale G2M tumoral 2C 4C Contenu en ADN Figure6: Distribution de l'adn aneuploïde typique d'un grand nombre de tumeurs humaines. Cette métastase ganglionnaire d'un cancer du sein révèle deux pics G0/G1 majeurs; le plus à gauche est généré par l'adn normal des leucocytes infiltrants dont la position est arbitrairement considérée comme une auto-référence définissant une quantité 2C d'adn à laquelle tout autre pic pourra être comparé par le rapport de leur position respective. Ce rapport est l'index d'adn, qui vaut 1 pour la population 2C, par définition; le second pic à droite est généré par les cellules tumorales présentant un net excès d'adn qui peut être quantifié par un index d'adn supérieur à 1, ici de 1,4. Ce pic G0/G1 tumoral est immédiatement suivi par une phase S et G2M dont l'importance reflète l'intense prolifération de la métastase. C N G1, index 1,00 G1, index 1,62 référence externe cancer G2M S ADN 2C 4C Figure 7: Cancer de la vessie - Usage d'une référence externe : elle consiste à prélever une partie saine de la vessie chez le même patient. 17

18 DIPLOIDE ANEUPLOIDE TETRAPLOIDE Index = 1 Index quelconque Index = 2 2C 4C 2C 4C 2C 4C HYPERTETRAPLOIDE Index > 2 MULTI-ANEUPLOIDE (MOSAIQUE) Plusieurs index Différence visuelle minimale: 5% 2C 4C 2C 4C 2C Figure 8: Les tumeurs solides humaines.- Principales distributions. Cette illustration résume la plupart des distributions d'adn obtenues par cyrtométrie en flux de noyaux isolés de tumeurs selon la méthode de Vindelov. D'une manière très générale, à circonstancier selon l'organe touché, le pronostic de survie à long terme des patients atteints d'une tumeur cancéreuse diploïde est meilleur que lorsque la tumeur est aneuploïde. Parmi les tumeurs cancéreuses aneuploïdes, les tumeurs tétraploïdes occupent une position à part: il peut s'agir de tumeurs multiploïdes (chromosomes surnuméraires normaux) et non pas aneuploïdes (chromosomes altérés). Ces tumeurs évoluent souvent plus favorablement vers la guérison que les tumeurs aneuploïdes vraies. Les tumeurs cancéreuses hypertétraploïdes ou en mosaïque sont de très mauvais pronostic. Il s'agit là d'une échelle probabiliste qui permet de classer des groupes d'individus à risque et non pas de certitudes pour un individu en particulier. Remarquons enfin que des tumeurs bénignes (= non cancéreuses) peuvent aussi être aneuploïdes et se distribuer selon ces figures: le fait qu'une tumeur soit aneuploïde ne permet en aucun cas de poser un diagnostic de cancer. Par contre, lorsque le cancer est déclaré par d'autres observations, alors seulement la relation entre aneuploïdie et survie peut être tentée. 18

19 A B Injecteur Gicleur Laser Une cellule Veine porteuse: mince large Figure 9 : Importance de la veine porteuse. Le diamètre de la veine porteuse au niveau de l'impact laser conditionne de façon cruciale la précision et la fidélité des mesures. En effet, plus cette veine sera mince (situation A) et plus les cellules seront forçées de suivre une trajectoire identique au travers d'une région strictement contrôlée du faisceau laser. La situation 'B' montre une veine porteuse large induisant un comportement erratique des cellules dans le flux et augmentant considérablement la variabilité des mesures de cellules identiques. La morphologie et la taille de la veine porteuse ne dépend que des conditions hydrodynamiques du flux. La veine mince (A) est obtenue en injection cellulaire LENTE ; la veine large (B) est obtenue par les gens pressés (injection rapide) Le diamètre de la veine porteuse peut ainsi être inférieur au diamètre moyen des cellules transportées : les cellules sont alors guidées comme des perles le long du fil d un collier. Pour l analyse de l ADN on doit TOUJOURS travailler en vitesse faible (A) A: B: s2 D CV% > 10 s1 CV% = 2 Figure 10 : Précision des mesures : En injection rapide, les pics sont larges et caractérisés par un coefficient de variation (CV = écart-type s / moyenne x) supérieur à 10%, interdit dans les analyses d ADN : deux populations proches x1, x2 sont en effet confondues en une seule. En injection lente (moins de 100 noyaux/seconde), le CV% peut être inférieur à 2%. Il doit en tous cas descendre sous 5-8% pour que la distribution de l ADN soit valide. Dans ce cas, le cytomètre résoud les deux populations x1 et x2. X2 X1 19

20 . 1,08 1,05 1,06 Nombre de cellules A B C ADN Figure 11: l'importance du coefficient de variation (CV%). En haut: A: le CV% est important et conduit à l'impossibilité de distinguer les deux distributions qui seront confondues en une seule. B: l'augmentation de la précision des mesures de ces mêmes cellules induit une diminution du CV% qui permet la visualisation immédiate des deux populations séparées par une distance D nettement perceptible. Cette situation est atteinte dès que D = 2,5.s = 0,025.Xi.CV%. En bas: Les plus petits écarts à la diploïdie visuellement détectables. A: adénocarcinome du rein (hypernéphrome, grade II); CV%: 2,4 %: B: métastase ganglionnaire d'un cancer du sein; CV%: 1,8 %. C: carcinome du thymus; CV%: 2,1 %. Noyau G1 Noyau G2 ou M Doublet G1 Laser mince 2 Volts Impulsions 1 Temps de vol ("Pulse width", Largeur de l'impulsion), µs (Aire de l'impulsion) ADN 2 1 Doublet G1 G2M G1 Région d'analyse Diagramme de dispersion 1 2 Temps de vol (largeur de l'impulsion) Figure 12: L analyse fine des impulsiosns. («Pulse processing»). Chaque particule génère une impulsion de fluorescence dont on mesure classiquement l amplitude (figure xx.x, chapitre 2). Un cytomètre moderne peut aussi considérer l aire («pulse area») et la largeur («pulse width») de cette impulsion. L aire de l impulsion correspond à la meilleure mesure de l intensité totale de fluorescence émise par cellule (noyau). Dans le cas d un marquage à l iodure de propidium, l aire est analogue au contenu en ADN. La largeur de l impulsion correspond au temps mis par la cellule pour franchir complètement le laser. On parle du «temps de vol» de la cellule. Ces deux paramètres doivent être utilisés pour résoudre le problème des doublets de cellules G1, considérés, dans la mesure cla 20

21 . FL3- Area (ADN) R1 R2 Forward scatter FL3- Width 2 C 2 C Sur-estimation Elimination des de G2M doublets G1 4 C 4 C 4 C 2 C Figure13.:Le problème des doublets G1. A gauche: chaque cellule ou agrégat de cellule qui est détecté par le cytomètre est considéré comme UNE particule unique. Deux cellules G1 accolées sont erronément comptées comme UNE cellule G2M. La fenêtre R1 élimine uniquement les agrégats plus gros. A droite: le mesure du temps de vol (FL3-width) fait la différence entre une authentique cellule G2M et un doublet G1, la durée de traversée du laser de ce dernier étant allongée. La fenêtre R2 résoud le problème efficacement. On utilise aussi la fenêtre logique R3 = R1 AND R2: une cellule sera mesurée si elle appartient simultanément aux deux fenêtres FL3- Area (ADN) Débris Diplo G1,G2M Diplo S Aneu G1,G2M Aneu S Figure 14: Le programme ModFit (Verity Software, USA). A gauche: Tumeur du sein, préparée selon Vindelov à partir d une biopsie non fixée. Le programme évalue la distribution des débris selon une fonction monotone de type exponentielle négative basée ur la cassure aléatoire multiple d un certain nombre de noyaux. La tumeur présente un double cycle cellulaire imbriqué, diploide et aneuploide. Le programme calcule les fractions des phases G1, S et G2M dans chacun des cycles, l index ADN et les CV% des pics G1. A droite: Mélanome malin, préparé selon Hedley à partir d une biopsie incluse dans la paraffine. La distribution des débris est évaluée par une fonction beaucoup plus complexe tenant compte de la distribution statistique de noyaux brisés une seule fois en deux calottes inégale, générant un petit débris et un gros débrisvoisin de G1: on observe bien l allure en U de la distribution. L index ADN de la tumeur aneuploïde est de 1,10 : il s agit du plus petit index raisonnablement analysable au départ de la méthode de Hedley. Il importe aussi d acquérir les données après exclusion des doublets selon la méthode de la figure 12 21