Etude d un consortium synthétique pour la production de biohydrogène par fermentation Saida Benomar Laboratoire de Bioénergétique et Ingénierie des Protéines IMM.CNRS. Marseille EER 2010
Energie renouvelable & bioénergies Pourquoi??? Appauvrissement prochain des ressources pétrolières et gazières mondiales Emission grandissante des gaz à effet de serre (CO 2, ) & Le coût Recherche d énergies renouvelables & non polluantes (énergie éolienne, solaire, biocarburants et Hydrogène) & Substitution des énergies fossiles par les énergies renouvelables
Hydrogène C est l élément le plus abondant La molécule gazeuse la plus énergétique (120 MJ/Kg) Un gaz ni polluant ni toxique et dont la combustion ne génère que de l eau Mais; Des limites d inflammabilité dans l air Une mauvaise image de gaz dangereux Problème de production d hydrogène propre (par des méthodes rentables) Des problèmes de diffusion (c est le gaz le plus léger);problème de stockage et de distribution
Les voies de production: H 2 O + Charbon ou lignite ou résidus pétroliers lourds H 2 O + Electricité de centrale àcharbon + chaleur Electrolyse H 2 O + Electricité nucléaire ou renouvelable Hydrogène Gazéification Electrolyse CO 2 àpiéger H 2 H 2 O + CH 4 + Chaleur Reformage à la vapeur Thermolyse Reformage Gazéification H 2 O + Chaleur solaire H 2 O + CxHy (hydrocarbures légers) + chaleur Biomasse + Chaleur CO 2 ou nucléaire O 2 renouvelable Hydrocarbures et charbon génèrent du gaz carbonique lors de la production d H 2
BioHydrogène Le vivant, producteur d hydrogène Métabolisme répandu et très ancien Microorganismes anaérobies ( mésophiles et extrémophiles) Microorganismes photosynthétiques (micro-algues et cyanobactéries) Clostridies Desulfovibrio Les Hydrogénases (Hase) catalysent: H 2 2 H + + 2 e -
BioHydrogène Le vivant, producteur d hydrogène Photosynthèse Micro-algues Bactéries photosynthétiques H 2 Verrou majeur: Sensibilité des hydrogénases à l O 2
BioHydrogène Le vivant, producteur d hydrogène Dark Fermentation Glucose Sucres Voie Acétate Clostridies H 2 C 6 H 12 O 6 + 2 H 2 O 2 CH 3 COO - + 2H + + 2CO 2 + 4H 2 G= - 206 kj/mol Voie Butyrate C 6 H 12 O 6 C 3 H 7 COO - + H + + 2CO 2 + 2H 2 G= - 254 kj/mol
BioHydrogène Le vivant, producteur d hydrogène Utiliser la biomasse pour produire du BioH 2 Produire de l énergie à partir de la biomasse: bioénergie, consiste à récupérer l énergie libérée lors de la dégradation de la biomasse en CO 2 et H 2 O, (éléments qu elle avait adsorbés pour se constituer) et à la mettre à disposition sous une forme exploitable par l homme. La biomasse représente toute la matière non fossile issue du vivant, animal ou végétal. Elle est stockable et utilisable dans de nombreux moyens de production existants Elle est très largement disponible dans les régions les plus peuplées.
Biomasse BioHydrogène Le vivant, producteur d hydrogène Consortium bactérien H 2 CH 4
Production de biohydrogène par fermentation Dans un consortium bactérien: 1 Hydrolyse des molécules complexes par les clostridies 2 Fermentation des produits des ces derniers par des bactéries fermentaires ( clostridies,.) 3 Implication des bactéries telles que les bactéries sulfatoréductrices (BSR) pour la fermentation des acides organiques (lactate,..) 4 Production de H 2 dans différents étapes 5 Sa consommation par les acéthogènes (acétate) et les méthanogènes (méthane) 4 1 2 3 5 5
BioHydrogène Les verrous technologiques: Présence de plusieurs bactéries au sein d un consortium; qui fait quoi? La plupart des bactéries productrices d H 2 sont aussi capables de le consommer; comprendre le métabolisme
«la conception, la construction et l étude de consortiums microbiens afin d établir les paramètres régissant les réseaux d interactions métaboliques avec pour objectif d optimiser la production d hydrogène...» Construction d un consortium artificiel et simple Etude métabolique Etude dynamique Simplification d un consortium complexe Etude métabolique Etude dynamique
Choix des deux bactéries Bactéries sulfatoréductrices H 2? Clostridies Desulfovibrio vulgaris Hildenborough (DvH) Vibrion, Gram- Non sporulante Respiration sulfate (BSR) Habitat: Sédiment, boues et environnements marins Productrice de H 2 dans certaines conditions Anaérobies Mésophiles Mobiles Chimio organotrophes Génome séquencé Clostridium acetobutylicum ATTC824 (Cab) Bâtonnet, Gram+ Sporulante Fermentation ABE Habitat: Sol, vases, eaux et végétaux Productrice de H 2
Choix du milieu de culture Milieu économique Milieu «minimum» Croissance Coexistence Milieu sans sulfate et avec glucose Etude de la croissance et des produits métaboliques
Etude de la croissance Desulfovibrio vulgaris Hildenborough (DvH) Clostridium acetobutylicum (Cab) Desulfovibrio vulgaris Hildenborough + Clostridium acetobutylicum (mixte) 1,2 14 mm glucose et 1 g/l extrait de levure Suivi rapide des populations par PCR et RT-PCR 1,0 0,8 Mixte Cab DO 600 0,6 0,4 0,2 0,0 DvH 0 20 40 60 80 time (hours) Mixte DvH Cab Croissance du mixte en absence du lactate et sulfate
Viabilité; Unités Formatrices de Colonies Culture mixte Clostridium acetobuylicum (Cab)/Desulfovibrio vulgaris Hildenborough (Dvh) à 20h Milieu RCM ( Clostridium) Milieu Postgate E (BSR) Cab DvH 7.5*10 3 CFU 4*10 3 CFU Après 20h de croissance, DvH et Cab sont présentes et vivantes dans la culture mixte avec un ratio ½.
Voie de production de H 2 chez les clostridies Glucose Pyruvate Lactate Succinate 2,3 Butanediol Ethanol Propionate Acétone Isopropanol H 2 Acétate Butyrate Butanol
Produits métaboliques 16 14 12 10 Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 0 H 74 H mm 8 6 4 16 14 Mixte (DvH / Cab) 2 12 0 glucose lactate acetate butyrate + mm 10 8 6 16 14 Clostrdium acetbutylicum 4 2 12 10 0 glucose lactate acetate butyrate mm 8 6 4 2 0 glucose lactate acetate butyrate Production faible de butyrate par le mixte OU Consommation par les DvH? Autres métabolismes?
Production d H 2 2500 2000 1,2 1,0 0,8 Production H 2 (cumulé) DvH cab MC DO 600 0,6 0,4 H 2 (µmol/ml) 1500 1000 0,2 0,0 0 20 40 60 80 time (hours) 500 0-20 0 20 40 60 80 times (H) La production d hydrogène par la culture mixte comparée à celle de la souche pure de clostridies montre: 1- une production plus rapide 2- une production plus importante: x1,8
Voie de production de H 2 chez le consortium??? Glucose Pyruvate Lactate Succinate 2,3 Butanediol Ethanol Propionate Acétone Isopropanol Acétate H 2 Butyrate Butanol
Conclusion Définition du milieu de culture permettant la croissance des deux partenaires Coexistence et viabilité des DvH et des Cab sur le milieu défini Communication entre les deux partenaires (la présence de Desulfovibrio vulgaris modifie le métabolisme des Clostridies au niveau H 2 et butyrate) Production de H 2 plus importante par la culture mixte
Perspectives Définir un modèle métabolique expliquant le comportement des bactéries au sein du consortium: Comprendre le métabolisme des Clostridies en présence des Desulfovibrio en étudiant les enzymes clés de leurs métabolismes Déterminer les paramètres cinétiques de ces enzymes nécessaires pour la modélisation Identifier le ou les moyens de communication ( physiques ou chimiques) entre les deux partenaires
Equipe «Métabolisme énergétique de bactéries extrémophiles» M.T. Giudici-Orticoni Marianne Guiral Marianne Ilbert Gisèle Leroy Saida Benomar (PhD) Maria-Luz Cardenas Athel Cornish-Bowden J.P. Steyer Eric Latrille Eric Trably Jerome Hamelien Yann Rafrafi (PhD) Marianne Quémeneur (post doc) Isabelle Meynial-Salles Philippe Soucaille Chrisian Croux Veluzamy Senthickumar (post doc)