Comptage de Cellules avec une Hémacytomètre Utilisation élémentaire de lê hémacytomètre Introduction Malgré les développements technologiques qui ont eu lieu dans les laboratoires scientifiques durant ces dernières années, le comptage visuel avec un hémacytomètre reste la méthode de comptage la plus répandue depuis le ème siècle. Cet article est destiné à aider à lêutilisation des compteurs de cellules avec une hémacytomètre ou plaque de Neubauer aux novices, ainsi quêaux techniciens et chercheurs expérimentés qui souhaitent se remémoriser les bases dêutilisation. Premièrement, nous présenterons les parties et le fonctionnement de lêhémacytomètre. Deuxièmement, nous décrirons les étapes dêutilisation du comptage de cellules avec un hémacytomètre pour obtenir des résultats fiables. Matériaux Les éléments nécessaires pour réaliser un comptage de cellules avec un hémacytomètre sont les suivants: a) échantillon à mesurer b) hémacytomètre ou plaque de Neubauer c) microscope optique d) Couvre-objets e) pipette/micropipette avec pointe f) buffer-tampon pour dilution / PBS PLAQUE DE NEUBAUER OU HEMACYTOMETRE METRE. Il sêagit dêune grosse lamelle de verre en forme de porte-objet dêenviron 30x70 mm et 4 mm dêépaisseur. Dans une plaque simple, la partie centrale, où se réalise le compte, se divise en 3 zones a b d c e f Fig. Éléments nécessaires pour numération cellulaire avec hémacytomètre

Dans la partie centrale se trouve gravée une réticule. Dans le cas de plaques doubles, qui sont les plus communes, ils existent zones de comptages, une supérieure et une inférieure à lêaxe longitudinal de la plaque. Chambre supérieure La réticule complété mesure 3mm x 3mm de côté ; divisée en 9 carrés de mm de côté chacun. Fig 4. En cas de comptage sanguin, les carrés des coins/angles sont destinés aux comptages des leucocytes. En existant en moindre quantité par rapport aux hématites, il nêest pas nécessaire dêavoir autant de référence pour réaliser le comptage. Le carré central est destiné au comptage des hématites et des plaquettes. Il se divise en 5 carrés moyens de 0.mm de côté (Fig. 4 -) et chacun de ces carrés se divise en 6 carrés plus petits. Fig 4 3. Le carré central est formé de 400 petits carrés. Chambre inférieure Fig. Plaque de Neubauer commerciale COUVRE-OBJETS OBJETS. La plaque couvre-objet est une lamelle de verre dêenviron mm x mm. Elle doit se mettre sur la plaque de comptage de façon à ce quêelle recouvre la partie centrale de celle-ci, délimitant un espace entre la plaque et le couvre-objet de 0.mm. Il est normal que le couvre-objet se soulève légèrement quand nous mettons plus de liquide que prévu. Pour éviter ce désagrément, il existe des plaques avec pinces spéciales pour que le couvre-objet ne se soulève pas et la distance reste de 0.mm. PIPETTE Fig 3. Pile de couvre-objet et boîte. Il sêagit dêun instrument de laboratoire qui permet de mesurer une aliquote de liquide avec précision. Elle est principalement en verre, et actuellement, et utilisée des micropipettes avec une pointe stérile jetable. Les plus communes sont calibrées pour une capacité de 0, 00 et 000uL.

3 3 3 3 Fig 4. Détail de la grille de la plaque de Neubauer Improved. Comptage de cellules, étapes par étapes Au-dessous de 50.000 cellules/ml (.5x05 ), la quantité de cellules comptées nêest pas suffisante pour donner une estimation suffisamment fiable de la concentration cellulaire. ETAPE. Préparation de lêéchantillon. Selon le type dêéchantillon à mesurer, il faudra préparer un échantillon avec une concentration adéquate pour le comptage. Typiquement, la gamme de concentrations du permet le comptage dêhémacytomètre se situe entre 50 000 et,5 millions de cellules par ml de cellules. Au-dessus de.5 millions (,5 * 06), la probabilité dêerreurs de comptage augmente considérablement, ainsi que le temps et les La concentration optimum pour un comptage en hémacytomètre est de million de cellules/ml = 06 cellules /ml. Nous utiliserons un échantillon avec une concentration de 06 ( million) appliquant les dilutions correspondantes. efforts nécessaires pour réaliser un comptage Voir http:///fr/resources/docs/articles/co nteo-celular-con-concentraciones-bajas.htm, pour une démonstration statistique de pourquoi cela arrive.

4 fiable. Au-delà de cette concentration, il est convenable de diluer lêéchantillon pour quêil soit optimal. ETAPE. Introduction de lêéchantillon dans s la plaque de Neubauer. Mettez le couvre-objet sur la plaque de Neubauer, et mettez-le en position horizontale sur la table, à un endroit où il est facile de manipuler la pipette. ) Introduisez une pointe jetable à lêextrémité de la micropipette. ) Ajustez la micropipette pour aspirer 0 ul de liquide. Généralement cet ajustement se réalise en guidant le bouton du piston pour sélectionner le volume souhaité. 3) Introduisez la pointe de la micropipette dans lêéchantillon. 4) Appuyez le piston de la pipette doucement jusquêà ce que le piston arrive à la fin de son parcours. 5) Sortez la pointe de la pipette de lêéchantillon, et maintenez-la toujours en position verticale pour lêemmener jusquêà la plaque de Neubauer. 6) Mettez la pointe de la pipette au bord du couvre-objet, à lêextrémité de la plaque de Neubauer. Il sêagit de laisser le liquide pénétré entre la plaque et le couvre-objet depuis le côté, par capillarité. 7) Relâchez le piston doucement pendant que vous vérifiez que le liquide entre correctement et de manière uniforme dans la plaque (voir Fig 5). 8) Si apparaissent des bulles, ou le couvre-objet ait bougé ou toute autre anomalie, répétez lêopération. Nous avons la plaque de Neubauer chargée, prête pour le comptage de cellules.. Fig 5. Introduction de lêéchantillon sur la plaque de Neubauer. ETAPE 3. Préparation et réglage du microscope. Mettez la plaque de Neubauer dans le plateau du microscope. Si le microscope a des pinces de fixation, utilisez-les pour fixer la plaque. Allumez la lumière du microscope. 3. Réglez le microscope jusquêà ce que vous puissiez voir nettement les cellules en regardant par le binoculaire. 4. Cherchez le premier cadre où vous voulez réaliser le comptage. Pour cet exemple, nous allons compter 5 grands carrés de la plaque de Neubauer Improved de 0. mm de profondeur. Voir Fig. 8 Voir http:///fr/resources/ docs/articles/easy-formula-for-manualcell-counting.htm, pour voir les formules appliquées pour chacune des plaques de comptages les plus communes. 5. Réalisez le comptage des cellules dans le premier cadre. Il existe une convention indiquant que si les cellules touchent la partie supérieure ou la partie gauche du cadre, elles sont comptabilisées mais si elles touchent la partie inférieure et droite, elles ne le sont pas.

5 Fig. 6. Comptage dêun grand carré de la plaque de Neubauer. Fig. 8. Comptage de 5 grands carrés de la plaque de Neubauer Improved. ETAPE 4. Calcul de la concentration Nous appliquons la formule de calcul de la concentration cellulaire. quantité de cellules concentration (cel / ml) = ------------------- Volume (en ml) La quantité de cellules est la somme de toutes les cellules comptées dans toutes les cadres. Le volume est le volume total de tous les cadres où nous avons fait le comptage. Fig. 7. Comptage avec concentration cellulaire élevée. Si la concentration cellulaire est très élevée, il est facile de se perdre dans le comptage, il est utilisé un ordre de comptage en forme de zigzag comme décrit dans la Fig. 7. 6. Notez sur une feuille les résultats de la quantité de cellules comptées dans le premier cadre. 7. Renouvelez le processus pour les autres cadres que vous souhaitez compter, notez le résultat de chacun dêeux. Plus vous comptez de cadres et plus la mesure obtenue sera précise. Quand le volume dêun grand cadre est: 0, cm x 0, cm = 0,0 cm de superficie 0,0 cm * 0, mm (profondeur) = 0,0 cm * 0,0 cm = 0,000 cm3 = 0,000 ml La formule de comptage avec les grands cadres de la plaque de Neubauer est concentration = quantité de cellules x 0.000 quantité de cadres Si nous appliquons une dilution, nous devons transformer la concentration obtenue durant

6 le comptage cellulaire en une concentration de lêéchantillon original. Nous devrons diviser le résultat pour la dilution appliquée. La formule restera: concentration = quantité de cellules x 0.000 quantité de cadres x dilution Exemple: Pour une dilution de :0, Dilution = 0. Pour une dilution de :00, Dilution = 0.0 Erreur Les erreurs entre 0% et 30% sont communes avec cette méthode de comptage dûe à la manipulation de la pipette, aux erreurs statistiques pour avoir un échantillon peu représentatif, erreurs de volume de lêéchantillon réellement introduit sur la plaque, etc Pourtant, lêhémacytomètre reste une des méthodes la plus largement utilisée dans les laboratoires dans le monde entier. Pour accéder à une analyse détaillée de lêerreur qui a été commise dans un comptage déterminé, cliquez : http:///fr/resources/doc s/articles/cell-count-error.htm