DÉTECTION D AGENT DE CONTRASTE PAR ÉCHOGRAPHIE ET MICROSCOPIE CONFOCALE À FLUORESCENCE

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1 DÉTECTION D AGENT DE CONTRASTE PAR ÉCHOGRAPHIE ET MICROSCOPIE CONFOCALE À FLUORESCENCE Ingrid Leguerney, Muriel Abbaci, Jessie Thalmensi Valérie Rouffiac, Corinne Laplace-Builhé, Nathalie Lassau IR4M UMR 8081, Université Paris-Sud 11 Institut Gustave Roussy, Villejuif, France Veronica Salvatore, Marco Baron Toaldo, Fabio Piscaglia Université de Bologne, Bologne, Italie

2 Objectif du projet Les intégrines αvβ3 jouent un rôle important dans l adhésion cellulaire et sont exprimées dans les néo-vaisseaux au cours de l angiogénèse tumorale. Des agents de contraste ultrasonores o spécifiques de ces intégrines peuvent permettre d évaluer l efficacité d un traitement thérapeutique agissant sur ce type de protéines. L objectif de ce projet est de détecter et de quantifier des particules de contraste ciblées et la fixation de celles-ci par différents outils d imagerie tels que l échographie de contraste et la microscopie à fluorescence. Ce diaporama présente la mise au point de la méthodologie pour étudier le comportement des microbulles soumises à un champ ultrasonore et des réglages pour chacune des modalités.

3 Produits de contraste ultrasonore (PCUS) Les produits de contraste ultrasonores sont des microparticules de gaz encapsulées dans une paroi biocompatible. Ces agents sont purement intra-vasculaires et vont créer une différence d échogénicité permettant ainsi de rehausser le signal ultrasonore issu de la vascularisation d une région ou d un organe. Les microbulles sont excitées à une fréquence proche de la fréquence de résonance, qui dépend de leurs propriétés physiques. L imagerie harmonique permet d améliorer la résolution de l image, la sensibilité ainsi que le contraste. L index mécanique (IM) est un indicateur dépendant de la fréquence ultrasonore et de la puissance acoustique de la sonde. Celui-ci doit être adapté afin de ne pas provoquer la destruction des microbulles au cours de l examen.

4 Produits de contraste ultrasonore (PCUS) SonoVue (Bracco) Targestar TM (Targeson) Gaz hexafluorure de soufre perfluorocarbone Encapsulage Concentration de microbulles Taille moyenne des microbulles Fréquence de résonance membrane phospholipidique membrane lipidique particules/ml particules/ml 2.5 µm 2.5 µm 2 10 MHz 1 20 MHz Index mécanique Le Visistar TM Integrin a les mêmes caractéristiques que le Targestar mais est spécifique des intégrines

5 Dispositifs d imagerie: échographie et mode de détection Aplio -Toshiba Vascular Recognition Imaging : «VRI» (Aplio ), sonde 9 MHz Pulse Soustraction, sonde 12 MHz injection de PCUS (intra-vasculaire) en bolus enregistrement de la prise de contraste et numérisation des séquences quantification de paramètres morphologiques et fonctionnels logiciel CHI-Q : calcul de l intensité moyenne dans la ROI en fonction du temps modélisation mathématique des courbes

6 Dispositifs d imagerie: échographie et mode de détection Aplio -Toshiba Vascular Recognition Imaging : «VRI» (Aplio ) sonde 9 MHz Combinaison d une image morphologique en mode B et d une imagerie fonctionnelle (Pulse Inversion et Doppler large bande) Pulse Soustraction sonde 12 MHz Suppression de la réponse linéaire des structures pour ne visualiser que la réponse non-linéaire des microbulles

7 Dispositifs d imagerie: microscope confocal CellVizio Mauna Kea Technologies Fibre optique MiniO Le CellVizio est équipé d une sonde souple (MiniO) contenant des milliers de fibres optiques et véhiculant un faisceau laser, qui permet de visualiser en temps réel la structure microscopique pq de l échantillon analysé. Chaque fibre optique a un diamètre moyen de 1.4 µm qui correspond à la résolution de la sonde anatomiques Caractéristiques de la sonde mini O Profondeur de champ 60 µm Résolution latérale 1.5 µm Résolution axiale 15 µm Diamètre du champ visualisé 240 µm

8 Détection optique des microbulles soumises à un champ ultrasonore Les microbulles sont imagées à la fois en statique et en dynamique dans un circuit fermé contenant 1/5 de fluorescéine et 4/5 d eau Modes d acquisition VRI et PS Les microbulles (SonoVue et Targestar) sont bien détectées in vitro dans les 2 modes d acquisition et à différentes fréquences Nécessité de limiter le débit de circulation de la pompe et de réduire la cadence image (8.5 images/sec) du CellVizio afin de visualiser les microbulles en imagerie optique (champ de vue µm) Il n est pas possible de relier le nombre de microbulles observées avec le CellVizio avec l intensité des courbes de prise de contraste (rehaussement) obtenues par échographie

9 Marquage des microbulles et observation au microscope confocal Marquage des microbulles avec DiO (3,3-dioctadecyl-oxa-carbocyanine perchlorate) aux concentrations 3, 4 et 6 mmol/l DiO: agent lipophile fluorescent qui pénètre la membrane phospholipidique des microbulles DiO ajouté avant agitation pour reconstitution des microbulles (0.2 et 0.5 ml dans 5 ml de microbulles) Spectre de fluorescence: λémission 484 nm, λexcitation 501 nm Observation avec objectif à immersion 63 Peu de fluorescence observée avec 0.2 ml de DiO Meilleure visualisation et marquage fluorescent obtenus avec la concentration de 3 mmol/l, absence d agrégats de DiO

10 Protocole in vivo: marquage du SonoVue par le DiO et influence sur les courbes de prise de contraste Melanome B16F10 xenogreffé en sous-cutané à des souris Anesthésie gazeuse (isoflurane) Marquage des microbulles de SonoVue avec DiO (3 mmol/l) Injection de 0.1 ml de SonoVue via sinus rétro-orbital Enregistrement des prises de contraste pendant 3 minutes Intervalle de 20 minutes entre les 2 injections de SonoVue et SonoVue + DiO Même profil des courbes de prise de contraste avec ou sans marquage mais intensité du signal plus basse lorsque le SonoVue est marqué avec le DiO Possible altération de l élasticité des microbulles par le marquage fluorescent et donc de leur fréquence de résonance lorsqu elles sont soumises à un champ ultrasonore

11 Conclusion et perspectives Méthodologie implémentée sur les différentes techniques d imagerie, avec optimisation des paramètres d acquisition (doses de marqueur, mouvements de la souris, filtres) Imagerie sur macroscope avec marquage DiO + TRITC et optimisation des réglages Imagerie simultanée échographie et imagerie optique (CellVizio) in vivo sur des souris Comparaison des deux agents de contraste SonoVue et Visistar TM lors de l évaluation de la vascularisation au cours du développement tumoral et lors de l évaluation de traitements anti-angiogéniques Analyse histologique avec marquages spécifiques des intégrines

12 QCM 1) Quel est l agent de contraste spécifique des intégrines? SonoVue Targestar TM Visistar TM 2) Quel type d imagerie permet de détecter les microbulles? imagerie morphologique (mode B) imagerie harmonique 3) Quel est l agent permettant de marquer la membrane des microbulles? fluorescéine DiO

13 QCM: réponses 1) Quel est l agent de contraste spécifique des intégrines? SonoVue Targestar TM Visistari TM 2) Quel type d imagerie permet de détecter les microbulles? imagerie morphologique (mode B) imagerie harmonique 3) Quel est l agent permettant de marquer la membrane des microbulles? fluorescéine DiO