Microscopie de fluorescence

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1 Microscopie de fluorescence François MICHEL PhD La microscopie pour débutants (ou pas) Partie 2

2 Imagerie de fluorescence

3 Ce qui vous attend (encore) Fluorescence?? Microscopie à épi-fluorescence Résolution 3D Applications

4 Principes de la fluorescence Perte d énergie (potentielle, thermique, cinétique ) : relaxation ❷ État excité (S 1 ) e - Excitation = apport d énergie E1 ❶ Emission de fluorescence État stable (S 0 ) ❸ S 1 Excitation (10-15 s.) S 0 Relaxation (10-12 s.) Fluorescence (10-9 à 10-7 s.) Diagramme énergétique (très simplifié) de Jablonski

5 Principes de la fluorescence L excitation et l émission sont des phénomènes quantiques : la molécule accepte une certaine quantité d énergie, ni trop ni trop peu pour être excitée et réémet cette énergie autour d une valeur privilégiée (pic d émission). L énergie d un photon est : E γ = hc/λ Où h et c sont des constantes (Planck ; vitesse de la lumière dans le vide) L énergie d un photon décroit avec la longueur d onde E γ X UV Longueur d onde λ(en nm) IR radio

6 Intensité de fluorescence Principes de la fluorescence Chaque molécule fluorescente (fluorophore) a des spectres d excitation et d émission qui lui sont propres (influencés par la structure chimique de la molécule et les conditions physique (Ph, T )). Décalage vers le rouge : perte d énergie entre excitation et émission (Stokes shift) Excitation E1 E1>E2 Emission E2 Pic d émission Pic d excitation = efficacité d acceptation des photons maximale Plus assez d énergie pour exciter Exemple : DAPI λ (nm)

7 Principes de la fluorescence L intérêt majeur de la fluorescence réside dans son rapport signal sur bruit très favorable. On peut ajouter d autres avantages: - spécificité du marquage - compatible in vivo - simple d utilisation - non toxique

8 Protéines fluorescentes Issues de gènes extraient de méduses ou de coraux, les protéines fluo ont les avantages de la fluo et du génie génétique, d où leur intérêt dans l analyse des processus biologiques. Elles ont été optimisé pour différentes fonctions : brillance, stabilité, vitesse d expression, sensibilité au Ph, au Ca 2+, au Cl - Excitation Emission max.(nm) Max(nm) CFP GFP YFP Ds Red «Brainbow mouse»livet et al. Nature 2007

10 Microscope à épi-fluorescence On tire avantage du décalage vers le rouge afin de discriminer entre lumière d excitation et lumière d émission Caméra Détection Filtre d excitation Lumière d émission Miroir dichroïque Illumination Objectif

11 Différents types de filtres transmission longueur d onde passe-bas (p-bas) longueur d onde passe-bande (PB) longueur d onde passe-haut (P-haut)

12 Microscope à épi-fluorescence Cube à fluorescence Caméra Détection Filtre d excitation Filtre d émission Miroir dichroïque Illumination

13 Différents types de filtres DAPI Alexa 488 Alexa 555 Excitation Emission

14 Différents types de filtres Excitation Passe-bas BP BP Emission Passe-haut BP BP

16 Problème de la résolution en Z La fluorescence hors focus induit un effet de flou qui altère l image. On regarde tous les photons issus de la colonne (diabolo) d illumination. Il existe plusieurs techniques pour améliorer l image, la principale est la microscopie confocale.

17 Microscope à Illumination structurée Caméra Illumination "Grille" Réseau de lignes Détection Les lignes opaques de la grille couvrent 1/3 du champs et permettent d enlever, grâce au logiciel, les photons hors focus. La fusion de 3 images dont les lignes sont décalées permet la reconstruction d une image débruitée (coupe optique).

18 Microscopie confocale Dans un confocal, la détection est effectuée par un tube photomultiplicateur(pmt). Il mesure les photons (de toutes λ) en fonction du temps et donc de la coordonnée xydu point de scanning : en t1 (x1y1) la fluo est F1, au temps t2 (en x2y2) la fluo est F2. L image est représenté pixel par pixel avec les valeurs Fn (XnYn) Lasers PMT Détection Diaphragme (Pinehole) Miroir dichroïque Illumination Scanner XY

19 Microscopie confocale multidimensionnelle focal plane cell with probe X-Y scan Y X scanning mirror Y X-Y scans X Z laser Temps Les dimensions peuvent être : la profondeur Z, le temps T, la couleur λ On peut donc faire des images 3, 4 voir 5D

20 Microscopie Confocale

22 Comment décrire la structure fonctionnelle des réseaux en développement? Identifier et décrire les neurones et les connections qui soustendent la genèse des activités de réseau.

23 Comment décrire la structure fonctionnelle des réseaux en développement? Résolution tissulaire Approche intégrée Cortex visuel de chat (Tsodyks et al, Science 1999) Approches in vivo et/ou in vitro: EEG, Pet scan, VSD, multiélectrode area, potentiels de champs VSD : Voltage sensitive dyes: donne une image de l état de dépolarisation spontané du réseau (résolution de qlq100 µm 2 ). Peut fluorescent nécessite de long temps d enregistrement.

24 Comment décrire la structure fonctionnelle des réseaux en développement? Résolution tissulaire Approche intégrée Approches in vivo et/ou in vitro: EEG, Pet scan, VSD, multiélectrode area, potentiels de champs multi-électrode area : matrice d électrode pour le suivis rapide de l activité neuronale mais résolution spacialefaible

25 Comment décrire la structure fonctionnelle des réseaux en développement? Résolution cellulaire Approche unitaire Résolution cellulaire Approche multi-unitaire Multi-patch : en cours de développement à l INMED mais technique lourde et peu de cellules.

26 Structure-fonction des réseaux de neurones: de l unitaire à l integré Unitaire Intégré

27 Utilisons l imagerie pour "regarder" le cerveau en marche

28 Sondes optiques pour mesurer ou modifier l activité neuronale Scanziani & Hausser. NatRev Neuroscience. 2009

29 Sondes calciques 1) Sondes organiques synthétiques (Tsien 1980) 2) Protéines Caméléons (Miyawaki 1997) C O 2 - C O 2 - -O 2 C -O 2 C N N O O Fluorophore BAPTA (calcium chelator) Non perméables à la membrane si non estérifiés (AM form) Ex: Fura 2, Oregon-green, Fluo4, etc..

30 Le calcium comme indicateur de l activité neuronale Neurone inactif Ca 2+ Ca 2+ [Ca 2+ ] int ~ 100 nm-1 µm Neurone actif Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ [Ca 2+ ] ext ~ 1-2 mm Ca 2+ Canaux calciques dépendant du potentiel Emission de potentiel d action >Dépolarisation membranaire >ouverture des canaux Ca 2+ >augmentation de [Ca 2+ ] int mv = %DF/F Un potentiel d action = un événement calcium Le calcium extracellulaire est 10 4 fois plus important que le calcium intracellulaire (100 nm à 1 µm)

31 Il y a un correlation direct entre le signal calcique et le nombre de potentiels d'actions Signal électrophysiologique (potentiels d'action) Marqueursensible au Calcium (ex. Fura 2-AM) tranche de cerveauxrongeurs (300 à 400 µm) Faible grandissement: 20X forte ON = X ON = 0.3 Signal Calcique (%DF/F) mv mv ms ms Optical Signal signal optique (calcium (fluorescence fluorescence) calcique) Signal électrophysiologique (nb de potentiels d'actions) 5%DF/F

32 Limitations de la microscopie confocale Résolution temporelle inadaptée Photoblanchiment: dans et en dehors du plan focal limitation de la durée des expériences Phototoxicité: Problèmes avec les tissues vivants due à l'énergie issue de l'excitation en lumière UV Pénétration limitée dans la profondeur du tissu en tranche (< µm)

33 Principes physiques de la microscopie multiphoton Deux photons infrarouges (IR) se combinent pour exciter le fluorophore. Par contre, l'état excité, la relaxation et la fluorescence émise sont identique à une excitation monophoton Relaxation Relaxation S 1 Excitation γ S 0 Source Laser UV (continue) Fluorescence E γ =hc/λ S 1 γ Excitation γ S 0 LASER IR pulsé (femtoseconde) Fluorescence Les photons doivent arriver dans une fenêtre de l ordre de secondes (une attoseconde). Cette échelle de temps est compatible avec la durée de vie de cet état virtuel (10-17 secondes soit 0.01 femtoseconde). Ils doivent également interagirent avec le nuage électronique dans un espace de l ordre de cm 2. La probabilitéd excitationbiphotonest10-30 foisinférieureaumonophoton!! (théorie par Maria Goppert-Mayer 1930(prix nobel 1963))

34 Principes physiques de la microscopie multiphoton La densité de photon permettant d outrepasser cette probabilité quasi nulle n est atteignable qu avec des lasers pulsés (1980) et exclusivement au point focal (point de convergence). Chaque pulse extrêmement court (femtoseconde) contient énormément de photon (puissance par pulse (P crête) : plus de 100 kw) mais à l échelle temporelle reste rare : cinq ordres de grandeur entre la durée et l occurrence des pulses. Puissance moyenne de 1 à 50 mw Puissance moyenne de 1 à 3 W 1, s

35 L'excitation bi-photonique est restreinte au point focal 1 photon 2 photons 1 photon 2 photons Point focal Le balayage induit une coupe optique intrinsèquement confocale, inutile d enlever les photons hors focus (non générés).

36 Longueurs d onde d absorption optimales biphotonversus monophoton Le spectre d excitation biphotonn est pas forcement le double point à point du spectre d excitation monophoton(optique non-linéaire).

37 confocal -meilleure résolution Imageriebi-photon versus confocale Faibles profondeurs : objectif 63X à huile -meilleurrapport signal/bruit 20 µm 40 µm 60 µm 80 µm bi-photon -plus de bruit -coupes optiques plus épaisses 20 µm 40 µm 60 µm 80 µm

38 Imageriebi-photon versus confocale Pour des profondeurs plus importantes : objectif 63X à eau confocal -augmentation de la puissance du laser -augmentation du bruit bi-photon -augmentation de la puissance du laser -acquisition plus facile qu en confocal 100 µm 120 µm 100 µm 140 µm 170 µm 200 µm

39 Avantagesdu multiphoton AVANTAGES - Zone d excitation plus faible (intrinsèquement confocale) - Élimination quasi-totale de la fluorescence hors plan focal - Moindre photo-blanchiment général et photo-toxicité - Pénétration plus grande des IR dans les tissus (jusqu à 1 mm) - Excitation des fluorophores UV sans lumière UV - Bonne séparation des lumières d excitation et d émission INCONVENIENTS - Photo-blanchiment au point focal - Nécessité d un important flux de photons - Balance entre puissance et blanchiment délicate - Coût et maintenance de l appareillage lourd

40 Exemple d application Microscopie Multi-photon Multi-focale: TriMscope Permet une résolution temporelle accrue Balayage conventionnel mono-faisceau confocal ou multiphoton 1 2 Balayage Multi-faisceaux(64) en mode d excitation multiphoton exlusivement 1 2 N 1-2 s./ image (1024x1024) PMT N/ ms./ image (1380x1040) Camera CCD Synchronisée

41 Configuration du poste TriMscope Patch-clamp

42 Fonctionnement du TriMscope de l intérieur Télescope Cube polariseur M M i i i Multiplicateur de faisceau M M M M L M M M 2 faisceaux multiples alternés et de polarités opposées Atténuateur p M Lame λ/2 p Shutter 4 positions Microscope Faisceau laser IR M M M Compensateur Scanner Champs : 450 x 400 µm n=f(λ) 1380X1040 pixels c=f(n)

43 AnalyseOn-line : résolutioncellulaire 10% DF/F 30 sec

44 Analyse On-line : résolution du réseau Détectionautomatiquedu signal o onset ooffset Collaborateurs Principaux : D.Aronov (MIT, USA) Postdoctorant : Dr. P. Bonifazi 30s Cellule # Temps (s) Reconstruction automatique de l activité de réseau Exploration statistique (ex. Analyse de Cluster) Analyse de la connectivité

45 Enregistrementen patch-clamp de cellules cibles Localisationdes microcircuits actifs Patch clamp et analyses morphologiques

46 Quelques questions possibles Structure fonctionnelle des réseaux : Cartes de connectivité Description des patrons d activité spontané : - Identification des générateurs de rythmes Etudes de la dynamique des réseaux : Où ces activités commencent? Comment s arrêtent-elles, se propagentelles, évoluent-elles?

47 Sources et Ressources WEB divers Molecularexpressions Microscopy U (Nikon) : Microscopy resource system (Olympus): A whole world of microscopy knowledge (Zeiss): Wikipédia Plate-formes d imagerie PICSL : MICROSCOPIE OPTIQUE (PDF indisponible) BIC Microscopie à épi-fluorescence et microscopie confocale(pdf) Membres du GDR2588 CNRS (microscopie fonctionnelle des systèmes vivants) et du RTmfm(Réseau technique de microscopie de fluorescence multidimensionnelle). Cours Arnaud Sergé (université de la Méditerranée Marseille II) Yves Husson (Université Joseph Fourrier Grenoble) Serge Monneret (Institut Fresnel, Marseille) Maxime Dahan(Laboratoire Kastler Brossel, ENS) François Waharte(institut Curie, UMR144) Commentaires, remarques, améliorations : michel@inmed.univ-mrs.fr