Fluorochromes et protéines fluorescentes

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1 Fluorochromes et protéines fluorescentes Susanne Bolte Formation microscopie photonique CNRS 2010

2 Quelques rappels sur la fluorescence La fluorescence est l absorption moléculaire d énergie lumineuse à une longueur d onde et une émission presque instantanée à une autre longueur d onde La lumière émise a une longueur d onde plus importante que la lumière absorbé. Déplacement de Stoke s

3 phosphorescence absorption fluorescence quenching de fluorescence 10-9 à 10-7 s phosphorescence 10-8 à 10-2 s Niveaux d énergie Quelques rappels sur la fluorescence Diagramme de Jablonski S 2 T 1 S 1 cis ~ps ci transfert d énergie à 10-4 s S 1 cis T 1 S 0 Raman Stokes & anti-stokes ~fs ~ns S 0

4 Quelques rappels sur la fluorescence Rendement quantique f Rapport du nombre total de photons émis dans tout le spectre d'émission de fluorescence au nombre de photons reçus et absorbés dans la zone spectrale d'excitation rendement quantique, I f = f I a I f et I a = nombre de quanta par unité de temps et de surface recevant (a) et émettant (f) la lumière ( f 0,85 pour la fluorescéine )

5 Quelques rappels sur la fluorescence C, concentration du fluorophore I f, intensité d'émission Coefficient d'extinction,, ou absorbance spécifique = absorbtivité molaire Sa valeur peut constituer un critère pour le choix des colorants ; plus est grand, plus la fluorescence sera élevée à intensité lumineuse incidente égale. ( Pour la fluorescéine à 488 nm, = 8 x 10 4 M -1. cm -1 ) Avec une absorbance spécifique très réduite (.C.l < 0,02 ), on peut linéariser la fonction exponentielle, avec Log10 2,3 I f 2,3 f. I o..c.l

6 Quelques rappels sur la fluorescence «Brillance» La "brillance" est proportionnelle à et ( M -1. cm -1 ) «brillance» (u.a.) Fluorescéine , Cyanine , EYFP , B-phycoérythrine , Tryptophan ,1 600 Quantum Dot , Quantum Dot , (à 490 nm)

7 Quelques rappels sur la fluorescence Durée de vie du singulet excité le plus bas = la constante de temps de déclin de fluorescence, f f = f. N N, constante de temps intrinsèque de l'état excité (en considérant seulement la fluorescence). ( f 4 ns pour la fluorescéine dans l'eau) F, rendement quantique Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM

8 Intensité Intensité (UA, ) Intensité (UA, ) Quelques rappels sur la fluorescence Déplacement de Stokes: L émission est d une énergie plus basse que l excitation du à la relaxation de l'état excité 1,20 1,001 déplacement de Stokes OH O O 0,80 0,60 excitation émission COOH 0,400 N C S 0,20 0, Longueur d onde (nm) Longueur d'onde (nm)

9 Quelques fluorochromes - immunofluorescence : FITC, TRITC, lissamine rhodamine, Texas Red, Cy3.18, Cy5.18, Alexa Fluors - ADN : iodure de propidium, YOYO, YOPRO, Syto16, chromomycine, mithramycine; DAPI, Hoechst, DRAQ5, TOTO3, TOPRO3 - mitochondrie : sensible au potentiel membranaire Rhodamine 123, DiOC 6 (3), DiOC 7 (3), JC-1, MitoTracker Red CMXRos (post-fixation possible) ; NAO (peu sensible potentiel) - membranes : Styrenes FM1-43, FM4-64, fusions-gfp, divers anticorps de surface - Viabilité : FDA, exclusion d iodure de propidium, - réticulum endoplasmique: (non spécifique) DiOC 6 (5), GFP-HDEL - appareil de Golgi : GFP-taggée, anticorps, NBD-C 6 -ceramide - dépendance envers le ph : carboxy-snarf-1, BCECF - dépendance envers le calcium : Fluo-3 ou -4 (± FF), FuraRed, CalciGreen, Indo-1, Cameleon - divers : Acridine Orange, Neutral Red, Lucifer Yellow, chlorophylle, - Protéines (Auto)fluorescentes

10 Protéines fluorescentes GFP Green Fluorescent Protein (GFP) existe depuis 160 millions d années dans la méduse Aequorea victoria. La protéine se trouve dans des organes spécifiques au bord de l ombrelle.

11 Protéines fluorescentes GFP En 2008, le Prix Noble de Chimie a été attribué au japonais Osamu Shimomura et aux deux américains Martin Chalfie et Roger Tsien pour la découverte et le développement de la GFP

12 Protéines fluorescentes GFP La protéine GFP a été découverte en 1962 par Osamu Shimomura en extrayant la protéine ensemble avec son partenaire naturel Aequorin de la méduse Aequoria victoria. Le gène a été cloné en 1992 par Douglas Prasher. Martin Chalfie a démontré l utilité de la GFP en Roger Tsien a créé une large série de protéines fluorescentes avec des couleurs couvrant tout le spectre visible. La GFP a été introduit dans Arabidopsis après modification de codons et autres séquences. (Chiu et al., 1996; Haselhoff et al., 1997) La première protéine fluorescente rouge a été découverte dans un corail par Sergey Lukyanov.

13 Protéines fluorescentes GFP dans Aequorea victoria Aequorin émet une lumière bleue après liaison avec du calcium. Cette lumière bleue et absorbée complètement par la GFP qui en revanche fluoresce vert. Ca 2+ Aequorin hν 470nm GFP hν 510nm

14 Protéines fluorescentes GFP La GFP consiste de 238 acides aminées en 11 «β-feuillets» et une a-hélice centrale. L ensemble forme un protéine de 28 kda avec une structure appelé b- tonneau. N-terminus et C-terminus sont accessible à la liaison avec autres protéines N C

15 Protéines fluorescentes GFP Le chromophore se forme après cyclisation et oxydation de trois acides aminées de l hélice centrale. Le repliement de la protéine et l oxydation du chromophore se font en 20 min. Tyr 66 Gly 67 oxidation Ser 65 - H 2 O Ser - dehydrotyr - Gly

16 Protéines fluorescentes GFP La GFP est très stable: In vitro elle tolère: Elle est résistante à: -des températures jusqu à 65 C -un ph de 5,5 a 12,2 -traitement avec: -6 M guanidine chlorure - 8 M urée - 1% SDS -un traitement prolongé (2 jours) avec des protéases comme trypsin, papain et thermolysin La GFP conserve son chromophore après fixation aldéhydique Elle est dénaturée par l alcool, sauf si elle est préfixée aux aldéhydes La GFP dimérise La GFP et beaucoup moins stable in vivo!

17 Protéines fluorescentes GFP Le pic prédominant d excitation de la GFP sauvage est à 400 nm, avec un pic mineur à 475 nm. Dans la forme mutée EGFP, le pic prédominant d excitation est reporté à 488 nm. Ceci permet l excitation avec un laser bleu standard. Excitation GFP wt Excitation E-GFP Emission E-GFP : 509nm 400nm 500nm

18 Protéines fluorescentes GFP La luminosité des protéines fluorescentes est dépendant du coefficient d extinction et du rendement quantique! Un élevé permet d utiliser des niveaux de lumière d excitation plus bas et de réduire le dommage de l échantillon en raison de la photooxidation Un élevé permet de même l utilisation des niveaux de lumière bas.

19 Protéines fluorescentes vertes GFP Rendement quantique Coefficient d extinction Excitation 475nm Emission 509nm wtgfp EGFP mgfp4 S65TmGFP4 smgfp Turbo- Sapphire mwasabi Emerald mwasabi nd 0.66 nd nd nd pka nd nd nd Attention il y a beaucoup de variantes de le GFP dans vos tiroirs de labo comme mgfp4, mgfp5, S65TmGFP4 et smgfp! Protéines vertes améliorées comme mwasabi avec des spectre d excitation et d émission plus étroites a suivre! mwasabi 1,6 fois plus brillante que EGFP!

20 Protéines fluorescentes cyanes CFP Rendement quantique Coefficient d extinction ECFP Cerulean MiCy mtfp pka Excitation 433nm Emission 476nm Le rapport signal/bruit de la CFP est bas et elle montre un photoblanchiment élevé CERULEAN est plus brillant mais elle montre un photoblanchiment important MiCy utilisé pour FRET mtfp1 est la protéine cyan la plus lumineuse et photo stable

21 Protéines fluorescentes jaunes YFP Rendement quantique Coefficient d extinction EYFP Citrine VENUS pka Excitation 515nm Emission 529nm EYFP est très sensible au ph acide et Cl -, photoblanchiment élevé, utilisé comme biosenseur pour des halides Citrine and VENUS sont beaucoup moins sensibles a des ph acides, Insensibles au Cl - et montrent un photoblanchiment moins important. (Citrine utilisé dans le biosenseur pour Ca 2+ CAMGAROO)

22 Protéines fluorescentes rouges RFP Rendement quantique Coefficient d extinction DsRed mrfp1 mcherry Kathuska pka <4.5? 556/ / / /635 DsRed possède un temps de maturation important, forme des tétramères et montre un changement de spectre au cours de la maturation de vert au rouge. Elle est encore utilisé comme «Fluorescent Timer» pour des études d expression de promoteur de gènes. mrfp1 est monomérique, mais avec un rapport signal/bruit très bas. mcherry possède un temps de maturation court et elle est beaucoup plus lumineux que la mrfp1.

23 Protéines fluorescentes: la gamme de couleurs C est difficile le choix mais il existent des bonnes revues Par exemple Shaner et al., 2005, Nature Methods

24 Protéines fluorescentes insolites Protéines photoactivables Protéines photo-convertibles Biosenseurs

25 Protéines fluorescentes photo-activables PA-XFP Rendement quantique* Coefficient d extinction PA-GFP PS-CFP/PSCFP-2 PA-mRFP / / pka* nd 6.0/ Augmentation de fluorescence après PA *après activation 100x 300x/400x 70x PA-GFP photoactivation PA-GFP hν 510nm

26 Protéines fluorescentes photo-activables PA-XFP CFP Rendement quantique* Coefficient d extinction DRONPA KFP pka* 5.0 nd Augmentatio n de fluorescence après PA *après activation nd 70x Après irradiation avec une lumière ces protéines changent d une façon reversible d un état fluorescent à un état non-fluorescent. with blue light, these proteins shift reversibly from fluorescent to non fluorescent state, they may be switched on again with violet light. Susanne Bolte Formation microscopie photonique Susanne Bolte CNRS 2010 Formation microscopie photonique CNRS 2011

27 Protéines fluorescentes photo-convertibles Protéines fluorescentes photo-convertibles: PC-XFP CFP Rendement quantique* Coefficient d extinction Kaede EOS-FP KiKGR Dendra pka* 5.6 nd Augmentation de fluorescence après PA 800 nd nd nm Après irradiation avec une lumière violette, ces protéines changent leur spectre d émission de vert en rouge d une façon irréversible. Kaede forme des tétramères, Eos-FP et KiKGr existent dans une forme monomérique L efficacité de photoconversion de KiKGr est plus élevé que de la Kaede Dendra est la seule des protéines photoconvertibles qui peut être convertie avec la ligne laser bleue 488nm!

28 Protéines fluorescentes photo-convertibles Protéines fluorescentes photo-convertibles: PC-XFP CFP Suivi de la dynamique sub-cellulaire Brown SC, Bolte S, Gaudin M, Pereira C, Marion J, Soler MN Satiat-Jeunemaitre B, Plant Journal 2010

29 Protéines fluorescentes photo-convertibles Protéines fluorescentes photo-convertibles: PC-XFP CFP Dynamique intracellulaire Haute résolution/palm McKinney SA, Murphy CS, Hazelwood KL, Davidson MW, Looger LL., Nature Methods 2009

30 Biosenseurs sur la base de FRET Interactions de protéines CFP FRET: Forster Resonance Energy Transfer (ou Fluorescence Resonance Energy Transfer) CFP GFP Accepteur CFP GFP Donor Pas d interaction Pas de transfert d énergie Interaction et donc transfert d énergie

31 Biosenseurs sur la base de FRET CFP Calcium CFP Calmodulin M13 YFP +4Ca 2+ -Ca nm 480 nm FRET 530 nm CFP 4Ca nm

32 Biosenseurs sur la base de FRET Stress mécanique Liu B, Kim TJ, Wang Y, J R Soc Interface. 2010

33 Biosenseurs sur la base de ratiométrie ph et Chlorure ClopHensor Daniele Arosio, Fernanda Ricci, Laura Marchetti, Roberta Gualdani, Lorenzo Albertazzi & Fabio Beltram, Nature Methods 2010

34 Emission intensity at 508nm Biosenseurs sur la base de ratiométrie ph wtgfp GFP ratiométrique GFP écliptique Excitation wavelength (nm) Miesenböck et al., 1998

35 Biosenseurs Interactions de protéines CFP Deux hémi molécules non fluorescentes de la YFP seront fusionnées à des protéines d intérêt (A, B). Les hémi-molécules peuvent s associer pour former un complexe fluorescente si la Protéine A et la protéine B interagissent. A B Image modifiée de Ibraheem and Campbell, 2010, Current Opinion in Chemical Biology

36 Biosenseurs Mesure Protéines de ph avec fluorescentes des PHluorins: photo-convertibles: Mesure de l état redox avec des rogfps: Oxidation État redox Reduction Dooley, C. T. et al. J. Biol. Chem. 2004;279:

37 Expression combinatoire des XFP : des cerveaux multicolores, BRAINBOW Applications La stratégie Brainbow-1 permet l expression stochastique «mosaïque» de trois protéines fluorescentes. La recombinaison conduit à l expression de CFP ou YFP, tandis que RFP reste exprimée dans les cellules dont le transgène n a subi aucune recombinaison. La stratégie Brainbow-2 permet d obtenir l expression aléatoire de quatre XFP. Livet J, Weissman TA, Kang H, Draft RW, Lu J, Bennis RA, Sanes JR, Lichtman JW. Nature Nov 1;450(7166):56-62.

38 Cycle cellulaire : les protéins Fucci Applications Sakaue-Sawano et al., 2008, Cell Mechali and Lutzmann 2008, Cell

39 Les précautions Mesure Protéines de ph avec fluorescentes des PHluorins: photo-convertibles: La microscopie de fluorescence induit des phénomènes de stress dans la cellule par production des ROS! Cellules qui expriment des protéines fluorescentes contiennent encore plus de ROS! Si la concentration de radicaux libres excède la capacité de la cellule de tamponner ces radicaux libres, nous observons des dommages induit par la lumière comme l arrêt mitotique et mort cellulaire. Tenez vos cellules en forme: Plus la λ ex est importante moins elle est destructrice! Utilisez des Protéines fluorescentes avec des coefficients d extinction et des rendements quantiques importants, ils sont moins sensibles au photoblanchiment! (M -1 cm -1 ) QY Photobleaching time (% of GFP) EGFP ECFP EYFP DsRED Tableau modifié de: Dixit and Cyr, Plant Journal 36,

40 Merci pour votre attention