La fluorescence, les fluorophores

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1 La fluorescence, les fluorophores

2 Taille d observation et techniques de microscopies électron photon < nm Me Mb 4Pi STED PALM FPALM STORM TIRF. Champ plein Confocal Double photon Microscopie Corrélative

3 Quelques exemples d images en fluorescence

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9 I) Principe physique de la fluorescence : I.1) Diagramme de Jablonski I.2) Spectres d absorption et d émission de fluorescence I.3) Paramètres de la fluorescence I.3.1) Intensité de fluorescence I.3.2) Influence de la concentration sur l intensité de fluorescence I.3.3) Rendement quantique de fluorescence I.3.4) Temps de vie de fluorescence II) Les nouvelles familles de Fluorophores : II.1) Paramètres pour sélectionner un fluorophore II.2) La GFP et ses dérivés II.3) Les Fluorophores - modulables II.4) Les Alexa II.5) les quantum dots III) Les effets de l environnement sur les Fluorophores III.1) bleaching et Quenching de fluorescence III.2) Le rôle des antifading :

10 La luminescence?

11 Emission de lumière La luminescence C est la propriété de nombreuses substances d émettre de la lumière sous l effet d une excitation Excitation d origine lumineuse : La fluorescence (spath fluoré : Stockes) La phosphorescence Autres origines d excitations : La thermoluminescence La triboluminescence La chimioluminescence.

12 Rappels Les états d énergie d une molécule : Les états d énergie d une molécule sont quantifiés Chaque émission ou absorption d une quantité E d énergie lumineuse par un atome est liée à la fréquence de cette lumière par la relation (Principe de Planck) E = h = h. c/ h constante de Planck : J.s c célérité de la lumière : ms -1 la longueur d onde nm

13 Représentation des transitions énergétiques : Diagramme de Jablonski 2 S niveaux excités 2 S niveaux rotationnels niveaux vibrationnels niveau fondamental S

14 La répartition de ces différents niveaux est donnée par la loi De Boltzmann : N excité = N fond. exp(- E/kT) E : représente l énergie nécessaire pour peupler les états excités à Partir de l état fondamental L absorption d un photon par une molécule va se traduire par une Redistribution de ses électrons périphériques sur les orbitales (principalement et ) et en conséquence par le peuplement des états Excités.

15 La fluorescence - la phosphorescence Fluorescence S Conversion interne S T1 h F h p 2 S h a Diagramme de Jablonski

16 Temps caractéristiques pour l absorption, la fluorescence, la phosphorescence et les processus non radiatifs

17 Le processus d absorption est très rapide (<10-15 s) et la géométrie Du système reste inchangée, c est le principe de Franck-Condon Les autres transitions sont plus lentes et la duré de vie des états excités Est suffisante pour que la molécule puisse selon les cas : - Changer de conformation - Interagir avec le solvant - Se protoner ou se déprotoner - Entrer en collision avec d autres molécules - Se réorienter

18 D.O F Du Diagramme aux spectres S 2 E S 1 S Longueur d'onde (nm)

19 Coefficient d extinction molaire Spectres d absorption et d émission Intensité de fluorescence max Abs max Em (nm)

20 - Règle de l image en miroir : les deux spectres d excitation et d émission ne sont pas superposables. - Décalage de Stokes : on observe un déplacement vers les grandes longueurs d onde de la lumière d émission par rapport à celle d absorption. E = h = h. c/ E

21 - L intensité de fluorescence : la microscopie de fluorescence a une Sensibilité > la microscopie de transmission Absorption : loi de Beer Lambert : I=I cd c: concentration d : longueur traversée : coefficient d extinction (10 5 mol -1 L cm -1 ) Emission : I F = R c I 0 R : constante d appareil

22 Effet de la concentration sur l intensité de fluorescence L intensité du rayonnement fluorescent F est proportionnelle à la puissance du faisceau d excitation absorbé par le système F = K (I 0 I) (1) Pour relier F à la concentration c des fluorophores on utilise la loi de Beer lambert I=I cd (2) En combinant (1) et (2) on obtient : F = K I 0 ( cd ) Pour cd < 0.05, on a l approximation F = K cd I 0 Et si on considère I 0 constant on a : F = K c

23 Lorsque cd > 0.05 la relation cesse d être linéaire due au Phénomène d auto-désactivation

24 Rendement quantique de fluorescence Le rapport du nombre de photons émis sur le nombre de photons absorbés définit le rendement quantique Q de fluorescence d une espèce. Q = h émis h absorbés Q < 1

25 Temps de vie de fluorescence Bien faire la différence entre déclin de fluorescence et le déclin de l intensité stationnaire de fluorescence (photoblanchiement) Une molécule excitée après l absorption d un photon peut revenir À l état fondamental : - processus non radiatif, k nr - processus radiatif, k r, Temps de vie de fluorescence : T = 1/ k r

26 Processus bimoléculaire Le quenching de fluorescence Quenching dynamique (ou avec diffusion) : Dû à une espèce en solution M*+ Q M + Q + énergie en compétition avec la réaction M* M + fluorescence Se produit sans consommation du quencher Quenching statique (ou sans diffusion) : M + Q MQ Formation de complexes non fluorescents Le quenching est l effet du milieu d observation sur l émission de Fluorescence

27 Etat sombre des fluorochromes

28 LES FLUOROPHORES

29 Classification des fluorophores -Sondes organiques -Sondes inorganiques - Protéines fluorescentes - Sondes fluorescentes - Sondes non linéaires - Quantum dots - Type de modulabilité

30 Les protéines fluorescentes Critères de sélection d un fluorophore pour un mono-marquage - longueur d onde du pic d excitation (nm) - longueur d onde du pic d émission (nm) - coefficient d extinction maximal (M -1 cm -1 ) - rendement quantique de fluorescence - durée de vie de fluorescence (s) - luminosité relative (dérivés) - demi vie de maturation (h) - conditions physico-chimiques YFP

31 Critères de sélection de fluorophores pour un multi-marquage - Éviter d avoir des fluorochromes dont les spectres d excitation et d émission se recouvrent - Eviter d avoir le spectre d émission d un fluorophore qui recouvre le spectre excitation d un autre fluorophore

32 Nouvelles sondes biologiques (1ère génération) Coefficient D extinction (M -1 cm -1 ) Rendement quantique %Q FITC Pic D excitation (nm) Pic D émission (nm) PH dépendance (EC50) Bleaching Time (relatif) EBFP ECFP EGFP EYFP dsred ou RFP

33 Nouvelles sondes biologiques (2ème génération) Version amélior ée de Coefficient d extinction Pic excitation /Pic emission Rendeme nt quantiqu e ½ Temps de maturation Intensité relative/wt DsredT1 Dsred / DsredT3 Dsred / DsredT4 Dsred / Venus YFP / rapide 30 mrfp1 Dsred 584/ <1h RedStar DSred 544/590 >WT <WT 20

34 Version amélior ée de Coefficient d extinction Pic excitation /Pic emission Rendeme nt quantiqu e ½ Temps de maturation Intensité relative/wt mhoneydew Dsred / ND 3% Mbanana Dsred / h 7% morange Dsred / h 83% dtomato Dsred / h 80% mstrawberry Dsred 574/ min % mcherry DSred / min 27%

35 Spectres d émission et d excitation des variants RFP

36 GFP modulables Photo-activable Photo-switchable Timer Mesure d interactions : - du milieu : biosenseur - entre partenaires : «complémentation»

37 Les fluorophores photo-activables - PA-GFP (aequorea victoria) - Kaede (Trachyphyllia geoffroyi) - KFP1 (Anemonia sulcata) Changements des caractéristiques spectrales par application d un flux de photons

38 Photoactivation de la PA- GFP : Les Fluorophores activables photoactivé Après photoactivation absorbance à 475 nm x 100

39 Kaede : après photo-activation irréversible le ratio de fluorescence rouge / vert x 2000 Tétramère Photoactivée à nm Ex 470 em 510 apres photoactivation ex 540 emission 580 Application : mesure de vitesse de diffusion de protéines marquées

40 KFP1 : après photo-activation émission de fluorescence dans le rouge X 30 Photoactivée à 532 nm Tétramère osfp (lobophyllia hemprichii) etramère m 516nm hotoactivation nm, em 581 nm

41 Nat Methods Feb;6(2):124-5.david w piston

42 Photoconversion meilleure sous illumination prolongée à faible intensité Katushka, mkate, Hcred1, morange1 plus faible conversion que Kaede et Dendra2 Changement de contraste de morange1 comparable à Kaede Stabilité des espèces photoconverties morange plus stable

43 Les Fluorophores switchables Drompa dérivé de la GFP État 1 ex 503nm / em 518nm Forte excitation 488 nm Forte excitation 405 nm État 2 ex 380nm / em 518nm

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45 Les fluorophores Timer

46 Les GFPs : Biosenseurs GFP un indicateur intracellulaire de ph

47 La PHluorin : dérivé de la GFP - Pka =6,5 - Mesure du rapport d intensité de fluorescence ex475/ ex395 Permet le suivi de la variation de ph

48 Activation de la citrine par le ph : Citrine YFP / >WT =WT

49 YFP senseur des ions halogénures

50 BIFC : bimolecular fluorescence complementation Hu Kerpolla Nat. Biotech.(2003) 21: Hu et al. Mol. Cell (2002) 9:

51 Hu Kerpolla

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53 Les sondes fluorescentes : La famille des Alexa Avantages: - Photo-stabilité, pas de formation d agrégats - Faible sensibilité aux variations de ph - Conservation d une forte luminescence, conjugués à des protéines - Faible poids moléculaire - Large gamme spectrale :

54 Inconvénient : Ces fluorophores portent une charge négative nette et peuvent causer des interactions non spécifiques avec des structures chargées positivement Imagine-iT FX signal enhancer

55 Sondes non linéaires - Utilisées pour l imagerie multiphotonique - 2 p excited fluorecence 2 I 2 2 : section efficace à 2 photons - Il faut les fluorophores avec 2 la plus grande - GFP 2 = 10 Göppert Mayer 2 > 100

56 Les quantum dots (boite quantique) - Ce sont des cristaux de semi-conducteurs de forme sphérique et de quelques nanomètres de diamètre - La longueur d onde d émission est directement reliée à la taille - Avec la même longueur d excitation il est possible d émettre à différentes longueur d ondes 2 nm

57 Exemple de marquage avec QD Figure 4: Specific labeling of live cells expressing Pgp-GFP using QD bioconjugates. (A D) Orange-emitting QDs were conjugated to either (A) avidin or (B) anti-pgp antibody, using the recombinant protein G leucine zipper fusion protein (PG-zb). Confocal images of HeLa cells transiently transfected with Pgp-EGFP were taken after (C) pre-incubation with the biotinylated anti- Pgp antibody followed by a brief incubation with QD-avidin conjugates or (D) incubation with QDs conjugated to anti-pgp antibody via PG-zb. In both cases, the QD bioconjugates labeled the cell membrane, and although many cells are visible in the bright-field image, only those that are expressing detectable levels of Pgp-EGFP are labeled with QDs. Bar, 10 m. Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates pp Jyoti K. Jaiswal, Hedi Mattoussi, J. Matthew Mauro & Sanford M. Simon

58 Problèmes de ces marqueurs - Formation d agrégats - Problème : mauvaise solubilité en milieu aqueux. - taille - toxicité - pénétration dans les cellules - clignotement des QD (arrêt avec Le beta mercaptoéthanol)

59 Avantages - bandes passantes d émission étroite (largeur à mi-hauteur 20 nm) - opaques aux électrons, un même tissu peut être utilisé en microscopie photonique et électronique - une section efficace appropriée pour la microscopie biphotonique 2 > faible photoblanchiement - avec une seule longueur d onde d excitation on peut suivre différents marqueurs sur une large gamme spectrale (avantage avec le développement de l imagerie spectrale)

60 Sélection en pratique Couleur Bleu < > 460 nm Vert < > 520 nm Rouge < > 590 nm Proche Infrarouge 670nm Fluorophores conseillés Dapi, Hoechst, alexa 405, QD Alexa 488, Cy2, GFP, egfp, YFP,QD Alexa 568, Cy3, Propidium iodide, DsRed2,QD Alexa 633, Alexa 647, QD Fluorophores moins conseillés Cascade blue, Pacific blue, Fluoroblue FITC, Oregon Green, Bodipy. Rhodamine, Texas red, TRITC Cy5

61 Attention utilisation DAPI

62 La déperdition de la fluorescence Le Photobleaching ou Fading, correspond à la perte plus ou moins rapide de fluorescence au cours du temps par hyper-excitation lumineuse aboutissant à la destruction de la molécule. C est en relation avec les propriétés intrinsèques du fluorophore. Un fluorophore peut Émettre un nombre fini de photons <10 6

63 Retarder la perte de fluorescence Due au quenching et au photobleaching - Enlever l oxygène du milieu de montage - Augmenter la viscosité du milieu de montage (glycérol), limite diffusion de l oxygène et des radicaux libres. - Une fois le montage réalisé bien vernir les bords de la lamelle - Après une observation avec de l huile à immersion, enlever l huile. - Préserver les champs non observés en utilisant le diaphragme de champ - Utiliser les filtres de densité pour atténuer l excitation

64 Les milieux anti-fading Sur un fluorophore donné, les milieux ont des effets différents

65 Effets de différents milieux sur la photostabilité des Alexa A chaque fluorophore, on peut trouver un antifading le plus approprié

66 Le choix de l antifading dépend du résultat que l on désire Intensité de fluorescence Temps Une diminution progressive de l intensité de fluorescence : Slowfade light Vectashield, Prolong Une lente diminution de l intensité de fluorescence mais avec un quenching initial important : Slowfade

67 Probes.invitrogen.com sondes fluorescentes et spectre Clontech.com/gfp proteines autofluorescentes Mobitec.com sondes fluorescentes et technologies Mellesgriot.com cours d optique Omegafilters.com spectres de sondes fluorescentes Chroma.com spectres de sondes fluorescentes