5.5.5 Exemple d un essai immunologique

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1 5.5.5 Exemple d un essai immunologique Test de grossesse Test en forme de bâtonnet destiné à mettre en évidence l'hormone spécifique de la grossesse, la gonadotrophine chorionique humaine (hcg), une glycoprotéine. Cet hormone apparaît dans l'urine quelques jours après la conception et sa concentration augmente rapidement dans les premières semaines de grossesse. 219 Cet essai est effectué dans un format «sandwich» avec deux anticorps. Un anticorps, «l anticorps de capture» est immobilisé de façon covalente à la surface de la bandelette. Le 2 e anticorps, «l anticorps traceur» est marqué avec un colorant. L anticorps traceur est imprégné sur la surface de la bandelette, mais demeure mobile. La bandelette est composée d un matériau adsorbant. Lorsqu un échantillon d urine est déposé à la surface, le liquide se déplace à travers la bandelette par capillarité et les réactions de l essai ont lieu dans un flux. 220

2 bandelette dans un dispositif en plastique Une goutte d urine est appliquée dans la fenêtre d entrée. Le liquide (urine) se déplace au-dessus de la zone contenant les anticorps traceurs qui sont marqués avec un colorant. Si la hcg est présente dans l échantillon d urine, elle formera un complexe avec l anticorps traceur. (D après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 221 Le complexe hcg-anticorps traceur formé continue à se déplacer au long de la bandelette adsorbante et passe sur la région (fenêtre de test) contenant l anticorps de capture immobilisé. Un sandwich est formé entre l anticorps de capture immobilisé et l anticorps traceur avec la hcg entre les deux. L anticorps traceur mobile est immobilisé. La quantité de complexe sandwich formé est directement proportionnel au montant de hcg dans l échantillon d urine. Si la [hcg] excède une concentration minimale, la couleur du colorant (attaché à l anticorps traceur) devient visible à l œil. exhibe toujours la couleur du marqueur (colorant) (D après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 222

3 5.6 Radio-isotopes Les radio-isotopes sont les premiers marqueurs utilisés dans le méthodes immunologiques; il existe donc une vaste gamme d essais radio-immunologiques. Les radio-isotopes sont facilement détectés à très faibles intensités, les procédures de marquage sont simples et les marqueurs radioactifs n ont virtuellement pas d effet sur la liaison anticorpsantigène. Les radio-isotopes sont coûteux, dangereux et nécessitent un contrôle et des procédures de destruction strictes. La désintégration isotopique nécessite un remplacement régulier de l anticorps ou antigène marqué. 223 Les radio-isotopes utilisés: Iode-125: - Utilisé pour le marquage de grands antigènes - Émission de particules β et de radiation γ (faible énergie) -t 1/2 =60 jours - Marqueur externe qui requiert un attachement covalent à l antigène (ex. substitution sur la tyrosine par oxydation). Ceci peut engendrer une différence structurale entre l antigène et l antigène marqué Carbone-14 et Hydrogène-3 (tritium): - Utilisés pour le marquage d haptènes - Émetteurs de radiation β -t 1/2 =5730 ans (C-14) et 12.3 ans (H-3) - Marqueurs internes; les radio-isotopes remplacent des atomes existants Limite de détection pour les antigènes M. 224

4 5.7 Fluorophores Les fluorophores communément utilisés comme marqueurs: H + (H3 C) 2 N N(CH 3 ) 2 CH CH Fluorescein H Tetraméthylrhodamine Umbelliferone Une limite de détection pour l antigène de ~10-10 M est obtenue avec les marqueurs fluorescents (2 ordres de grandeur plus élevés que celle des essais avec radio-isotopes). Il y a plusieurs options d essais hétérogènes: indirect, compétitif et sandwich. 225 Essai indirect: pour la quantification d anticorps (sérum) : 1 + : 1 2 -F 2-F 2 -F 2 -F : 1 : 2 -F : 1 : 2 -F L intensité de la fluorescence augmente avec la [anticorps] dans l échantillon. Essai compétitif: pour la quantification d antigène ou d haptène + incubation -F + rinçage -F : : : -F : L intensité de la fluorescence diminue avec la [antigène] dans l échantillon. 226

5 Essai sandwich: pour la quantification d antigène ayant au moins deux épitopes distincts + : : : -F -F + -F -F -F -F -F incubation + rinçage : : -F : : -F : : -F L intensité de la fluorescence augmente linéairement avec la [antigène] dans l échantillon Dosage par la méthode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay enzyme substrat taux de roulement: ~1000 à 100,000/s produit détectable Les enzymes sont actuellement les marqueurs les plus utilisés pour les essais immunologiques. Un seul marqueur enzymatique catalyse la production de multiples copies d une espèce détectable (par absorption, fluorescence ou électrochimie) générant ainsi un grand signal (phénomène d amplification catalytique). Avantage d une méthode immunoenzymatique: une amplification du signal qui rend possible l analyse quantitative de faibles concentrations d échantillon (D après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) Désavantage d une méthode immunoenzymatique: besoin d ajouter un substrat et d avoir une autre étape de réaction 228

6 La méthode ELISA est un essai hétérogène sur phase solide dans lequel le complexe antigène:anticorps (: 1 ) est détecté par un antigène ou un deuxième anticorps (anti- 1 ) marqué avec une enzyme qui catalyse la conversion d un substrat incolore en produit coloré. (D après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) Les méthodes ELISA: emploient généralement un anticorps immobilisé dans les puits d un plateau de microtitration en polystyrène (analyse automatisée) sont effectuées dans le mode compétitif ou non compétitif ELISA - mode compétitif L antigène dans l échantillon (analyte, ) et l antigène marqué avec enzyme (-E) sont en compétition pour un nombre limité (et insuffisant) de sites anticorps. Après incubation, le support solide est rincé pour enlever les antigènes non-liées et une concentration saturante du substrat enzymatique est ajoutée. La conversion du substrat en produit peut être mesurée en mode cinétique. Dans ce cas, la vitesse de conversion du substrat diminue lorsque [ libre ] dans l échantillon augmente. (D après Mikkelsen & Cortòn, Bioanalytical Chemistry, 2004) 230

7 Plus souvent, une approche à temps fixe est utilisée. Courbe d étalonnage à temps fixe Après un certain temps d incubation avec le substrat, la réaction enzymatique est arrêtée par l addition d un acide ou d une base forte qui dénature l enzyme. La quantification du produit formé donne une courbe d étalonnage dans laquelle la [produit] diminue lorsque la [ libre ] dans l échantillon augmente. (D après Mikkelsen & Cortòn, Bioanalytical Chemistry, 2004) ELISA - mode non compétitif Les méthodes ELISA non compétitives sont basées sur la formation de «complexes sandwich». Un anticorps primaire ( 1 ) immobilisé est présent en excès et lie quantitativement tout l antigène (analyte). Un 2 e anticorps (anti- 1 ) avec marqueur enzymatique ( 2 -E) réagit avec l antigène lié, formant un complexe sandwich qui est détecté par une mesure de l activité de l enzyme liée à la surface du support solide. Une courbe de calibration est obtenue dans laquelle la [produit] augmente avec la [] dans l échantillon. (D après Mikkelsen & Cortòn, 232 Bioanalytical Chemistry, 2004)

8 5.8.3 Marqueurs enzymatiques pour les ELISAs Caractéristiques d un marqueur enzymatique idéal: un taux de roulement élevé un produit facilement détecté un substrat qui n interfère pas avec la mesure un faible coût une stabilité et résistance aux interférences possibles Normalement, l enzyme, substrat et produit ne doivent pas être présent dans les échantillons analysés. Il y a cinq enzymes qui sont communément utilisés comme marqueurs Horseradish peroxydase (EC , MM 40kDa) est l enzyme la plus utilisée dans les essais immuno-enzymatiques, due à sa grande activité spécifique (4500 U/mg à 37 C = taux de roulement de ~3000 molécules de substrat par seconde par molécule de HRP) et le fait que la HRP est relativement non spécifique vers le substrat secondaire. Une variété de colorants (forme réduite) peuvent être utilisés comme substrats qui sont convertis à leur forme oxydée colorée: H H H H H HRP 2 + H H 2 H H pyrogallol coloré 234

9 2. Phosphatase alcaline (EC , MM 100 kda) a un ph optimal autour de 9 et une activité spécifique de 1000 U/mg à 37 C (taux de roulement de ~1700/s): 2 N P H 2 AP 2 N H 2- + HP 4 p-nitrophénylphosphate p-nitrophénylphénol λ=450 nm 3. β-galactosidase (EC , MM 540 kda) a un ph optimal autour de 7 et une activité spécifique de 600 U/mg à 37 C (taux de roulement de ~5400/s): o-nitrophényl-β-d-galactose + H 2 H N 2 + D-Galactose coloré Glucose-6-phosphate déshydrogénase (EC , MM 104 kda) a un ph optimal autour de 7.8 et une activité spécifique de 400 U/mg à 37 C (taux de roulement de ~700/s): D-Glucose-6-phosphate + NADP + G-6-P D-Glucono-δ-lactone-6 phosphate + NADPH absorbance (λ=340 nm) ou fluorescence 5. Uréase (EC , MM 483 kda) a une activité spécifique de 10,000 U/mg à 37 C et ph 7.0 (taux de roulement de ~80,000/s): H 2 N C urée NH 2 uréase + + 3H 2 2NH HC3 + H - 236

10 5.8.4 Exemple d un essais ELISA Détection d anticorps au virus de l immunodéficience humaine (VIH) par ÉLISA La détection des anticorps VIH repose sur le fait que les anticorps VIH se lie spécifiquement au VIH (antigène). Étapes de l essai: Immobilisation du VIH dans un puit de plateau à microtitration > rinçage > ajout de l échantillon de sérum sanguin et incubation > rinçage > ajout d un 2e anticorps (anti-anticorps VIH) avec marqueur enzymatique > rinçage > ajout du substrat enzymatique > production d un produit coloré- lecture de l absorbance par spectrophotométrie UV-vis. 237 (D après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 5.9 Essais homogènes de type EMIT (Enzyme- Multiplied Immunoassay Technique) Le dosage par la méthode homogène EMIT est utilisé pour la quantification d haptènes (hormones, substances thérapeutiques et les drogues) Cette méthode est basée sur une compétition entre l haptène dans l échantillon (analyte) et un haptène marqué avec enzyme pour une quantité limitée d anticorps: (D après Mikkelsen & Cortòn, Bioanalytical Chemistry, 2004) 238

11 De l enzyme contenant de l haptène libre exhibe une activité enzymatique élevée, tandis que la liaison de l anticorps à l haptène diminue drastiquement l activité enzymatique due à l encombrement stérique ou à des changements structuraux au site actif de l enzyme. L activité enzymatique augmente avec la concentration haptène dans l échantillon. La limite de détection typique est d environ 1 ng/ml. 239