KIT ELISA dosage immunologique anti-bsa REF : ELISA A RECEPTION DU COLIS : Vérifier la composition du colis indiquée ci-dessous en pages 1 et 2

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1 KIT ELISA dosage immunologique anti-bsa REF : ELISA : 0033 (0) : 0033 (0) : : sordalab@wanadoo.fr A RECEPTION DU COLIS : Vérifier la composition du colis indiquée ci-dessous en pages 1 et 2 Stocker les articles du colis dans les bonnes conditions : Ouvrir le carton Placer les deux bouteilles de PBStween au réfrigérateur à +4 C Placer le sachet noté A au congélateur à - 20 C Placer le sachet noté M au réfrigérateur à + 4 C Attention : Ces conditions de stockage sont à respecter scrupuleusement pour permettre une conservation des produits du kit de 6 mois. Avant toute manipulation, étudier la fiche sécurité en pages 16 à 18 COMPOSITION DU COLIS POUR 40 élèves travaillant en binôme: 1 carton contenant : 1 sachet noté A contenant 3 microtubes bouchés : 1 microtube à bouchon bleu contenant 50 µl d anticorps anti- Immunoglobuline de lapin couplé à la peroxydase 1 microtube à bouchon rouge contenant 110 µl de sérum de lapin immunisé contre la BSA 1 microtube à bouchon naturel contenant 110 µl de sérum de lapin non immunisé 1 sachet noir de 20 barettes de micro-titration avec leurs supports ( ATTENTION : pour une longue conservation, garder les plaques à l abri de la lumière) Kit Test ELISA Page 1 sur 20

2 1 sachet noté M contenant : 1 tube à bouchon rouge contenant 10 ml d eau stérile 1 tube noir contenant 8 ml de TMB ( ATTENTION : le TMB doit être gardé à l abri de la lumière) 1 tube à fond conique de 12 ml de PBSx10 1 tube vide à fond conique de 50 ml 2 bouteilles de PBStween MATERIEL NECESSAIRE : - Micropipette de 10 à 100 µl (ref VVCS 100 dans la partie matériel de laboratoire du catalogue) ou compte-gouttes calibré en plastique (goutte de 40 µl) ( ref POI1 dans la partie matériel de laboratoire du catalogue) - Eau distillée (déminéraliseur et bidon ref DEMIN et BPHD5 dans la partie matériel de laboratoire du catalogue) - Tubes de 50 ml (ref TU50 dans la partie matériel de laboratoire du catalogue) - Eprouvette de 150 ml ou de 125 ml (ref ) - Papier aluminium (ref ALU dans la partie matériel de laboratoire du catalogue) - Pipettes de 2 et de 10 ml (ref PGV2 et PGV10 dans la partie matériel de laboratoire du catalogue) - Poire à pipeter (ref PSPU dans la partie matériel de laboratoire du catalogue) ou pipump (ref PIPUMP2 et PIPUMP10 dans la partie matériel de laboratoire) - Flacon de 250 ml (ref FGV250 dans la partie matériel de laboratoire du catalogue) MATERIEL CONSEILLE : Pour bloquer la réaction de révélation du test elisa :acide sulfurique ou chlorhydrique (ref ou dans la partie produits chimiques du catalogue) Pour aller plus loin : Spectrophotomètre pour mesurer l absorbance et cuve (ref SPECTRO ou BMS SPEC5000 ou PS-2642 et ref CUVSP1 dans la partie matériel de laboratoire du catalogue) ou bien appareil photo numérique (ref dans la partie observation du catalogue) et logiciel gratuit MESURIM (disponible sur le site de l Académie d Amiens) Kit Test ELISA Page 2 sur 20

3 FICHE PREPARATEUR 1) Préparation du tampon PBSx1: diluer d un facteur 10 le contenu du tube noté PBSx10 provenant du sachet noté M stocké au réfrigérateur (possibilité de réaliser cette étape quelques jours à l avance et de conserver le produit dilué à 4 C pendant 4 semaines) Verser le PBSx10 dans une éprouvette de 125 ml ou 150 ml Rincer le tube qui a contenu le PBSx10 une première fois avec un peu d eau déminéralisée Récupérer cette eau de lavage dans l éprouvette Renouveler l opération plusieurs fois en veillant à ne pas dépasser un volume total de 120 ml dans l éprouvette Complèter l éprouvette avec de l eau distillée jusqu à 120 ml Transférer dans un flacon marqué PBSx1 Conserver au réfrigérateur à +4 C sans excéder une durée d 1 mois. 2) Préparation de la solution d anticorps anti-bsa de concentration C1 : diluer au PBSx1 le contenu du microtube à bouchon rouge du sachet A stocké au congélateur (possibilité de réaliser cette étape quelques jours avant le TP et conserver 24 heures à 4 C ou 4 semaines à -20 C) ATTENTION : la dilution se fait avec le PBS x1 (dilué au point 1) et non avec le PBS tween Ajouter 1,5 ml de tampon PBS x1 (préparé au point 1) dans le microtube à bouchon rouge du sachet noté A conservé au congélateur Prélever grossièrement à la pipette le mélange et le placer dans un tube propre pouvant contenir au moins 15 ml ( conseil : utiliser un tube de 50 ml en plastique). Noter ce tube C1. Recommencer 4 fois l opération d ajout de 1,5 ml de PBSx1 dans le microtube et les opérations de prélèvement et de transfert dans le tube noté C1. Ajouter 7,5 ml de tampon PBSx1 dans le tube noté C1. On obtient 15 ml de solution de concentration C1. Si le TP a lieu dans moins de 24 heures, conserver à 4 C. Si le TP a lieu quelques jours plus tard, conserver à -20 C sans excéder 4 semaines. Kit Test ELISA Page 3 sur 20

4 3) Préparation de la gamme d anticorps anti-bsa à doser : à partir de la solution C1, réaliser une dilution en cascade d un facteur ½ à chaque étape (possibilité de faire cette étape quelques jours avant le TP et de conserver les dilutions à 4 C pour 24h ou à -20 C pour 4 semaines) ATTENTION : les dilutions se font avec le PBS x1 (dilué au point 1) et non avec le PBS tween - Préparation de la concentration C2 d anticorps anti-bsa : Prélever 7,5 ml dans le tube noté C1 et les mettre dans un tube propre pouvant contenir au moins 15 ml ( conseil : utiliser un tube à fond conique en plastique de 50 ml). Noter ce tube C2. Ajouter 7,5 ml de tampon PBS x1 dans le tube noté C2. On obtient 15 ml de solution de concentration C2. - Opérer de la même façon pour la préparation des concentrations C3, C4, C5, C6, C7 et C8 d anti-bsa : dilution en cascade d un facteur ½ à partir de la solution C1 Après avoir effectué les dilutions, il reste 7,5 ml des solutions C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7 et 15 ml de la solution C8. ATTENTION : Si le TP a lieu dans moins de 24 heures, conserver les 8 solutions ainsi obtenues à 4 C. Si le TP a lieu quelques jours plus tard, conserver à -20 C sans dépasser 1 mois. 4) Préparation de la solution d anticorps de détection : dilution au PBSx1 du contenu du microtube à bouchon bleu du sachet noté A stocké au congélateur (possibilité de préparer cette solution quelques jours à l avance et conserver à 4 C pendant 24h ou à -20 C pendant 4 semaines) ATTENTION : la dilution se fait avec le PBS x1 (dilué) et non avec le PBS tween Ajouter 1,5 ml de tampon PBS x1 (préparé au point 1) dans le microtube à bouchon bleu du sachet noté A conservé au congélateur Kit Test ELISA Page 4 sur 20

5 Prélever grossièrement à la pipette le mélange et le placer dans un tube propre pouvant contenir au moins 30 ml ( conseil : utiliser un tube à fond conique en plastique propre de 50 ml). Noter ce tube «Ac détection». Recommencer 4 fois l opération d ajout de 1,5 ml de PBSx1 dans le microtube et les opérations de prélèvement et de transfert dans le tube noté «Ac détection» Ajouter 22,5 ml de tampon PBSx1 dans le tube noté «Ac détection». On obtient 30 ml de solution d anticorps de détection. Si le TP a lieu dans moins de 24 heures, conserver à 4 C. Si le TP a lieu quelques jours plus tard, conserver à -20 C sans dépasser 1 mois. 5) Préparation de la solution révélatrice TMB : diluer au ½ le contenu du tube noir de TMB stocké dans le sachet M au réfrigérateur (étape à réaliser juste avant le TP sans exposer à la lumière ni à d éventuelles traces de détergeant) Entourer d aluminium le tube en plastique vide de 50 ml (fourni dans le sachet M au réfrigérateur) de manière à protéger le contenu de la lumière Verser, dans ce tube le contenu du tube noir de TMB stocké dans le sachet M placé au réfrigérateur Ajouter 8 ml d eau stérile (tube à bouchon rouge dans le sachet M stocké au réfrigérateur) Boucher et bien agiter Conserver à l abri de la lumière à 4 C (pas plus d une journée) ATTENTION : Pour éviter toute dégradation du TMB, il est nécessaire d utiliser un tube neuf sans trace de détergeant : le tube en plastique de 50 ml fourni est à usage unique et parfaitement adapté pour la dilution du TMB. De plus, le TMB est très sensible à la lumière : il ne faut en aucun cas le préparer dans un tube sans protection d aluminium 6) Préparation du sérum non-immunisé, le témoin négatif (possibilité de réaliser cette étape quelques jours avant le TP et conserver 24h à 4 C ou 4 semaines à -20 C) : diluer, dans 10 ml de PBS x1, le contenu du microtube à bouchon blanc stocké dans le sachet A au congélateur. Kit Test ELISA Page 5 sur 20

6 Ajouter 1,5 ml de tampon PBS x1 (préparé au point 1) dans le microtube à bouchon blanc du sachet noté A conservé au congélateur Prélever grossièrement à la pipette le mélange et le placer dans un tube propre pouvant contenir au moins 10 ml ( conseil : utiliser un tube à fond conique en plastique propre de 50 ml). Noter ce tube «sérum non immunisé» Recommencer 4 fois l opération d ajout de 1,5 ml de PBSx1 dans le microtube et les opérations de prélèvement et de transfert dans le tube noté «sérum non immunisé» Ajouter 2,5 ml de tampon PBSx1 dans le tube noté «sérum non immunisé». On obtient 10 ml de témoin négatif. Si le TP a lieu dans moins de 24 heures, conserver à 4 C. Si le TP a lieu quelques jours plus tard, conserver à -20 C sans dépasser 1 mois. NOTE : Les quantités d anticorps et de sérum sont faibles, pour vous assurer de récupérer la totalité du volume contenu dans les tubes fournis, nous vous conseillons de procéder comme il est préconisé dans la notice en rinçant plusieurs fois le tube au lieu de directement pipeter dans le tube. 7) Préparation de la salle : Disposer une barette de 8 puits par binôme Préparer des compte gouttes (calibrés à 40 µl) ou des micropipettes pour prélever les solutions d anticorps de concentration C1, C2, C3, C4, C6, C8, la solution de PBSx1, la solution de sérum non immunisé, la solution d anticorps de détection et la solution de TMB révélatrice (conservée dans le papier aluminium). ATTENTION : veillez à ce que les compte gouttes de prélèvement ne se mélangent pas. NB : On peut éventuellement répartir les solutions d anticorps de concentration C1, C2, C3, C4, C6, C8 dans des tubes pour chaque binôme. A ce moment là, le binôme peut utiliser le même compte goutte pour faire tous les prélèvements de solution d anticorps en commençant par prélever et déposer la solution la moins concentrée, à savoir C8 puis des solutions de plus en plus concentrées jusqu à C1. Préparer des pipettes et des poires pour les lavages au PBS tween Kit Test ELISA Page 6 sur 20

7 PRINCIPE ET INTERET PEDAGOGIQUE: Définition et vocabulaire : Le test E.L.I.S.A. ( Enzym Linked ImmunoSorbent Assay) est un test immunologique classiquement utilisé pour la détection et le dosage protéique. Note : Le dosage de protéines par ELISA concerne généralement les antigènes. Pour les anticorps, étant donné l'hétérogénéité de la réponse anticorps, on parle plutôt de titrage (titre: inverse de la dernière dilution positive) => tests semiquantitatifs. Contexte d utilisation du test ELISA : Le test ELISA est utilisé lors du test de dépistage du virus du SIDA : Ce test de dépistage s effectue en deux étapes dont la première est un test E.L.I.S.A. permettant de détecter les anticorps produits par l organisme et dirigés contre le virus. Les tests ELISA HIV permettent de déterminer la présence ou l'absence de l'ag P24 et/ou des anticorps anti HIV1/HIV2, par comparaison à une valeur seuil (résultats qualitatifs). La deuxième étape est un test de confirmation par immuno-transfert (Western blot). Intérêt pédagogique : L intérêt général de la manipulation est de montrer (en une séance de TP) que l on peut non seulement détecter mais aussi doser une protéine (ici un anticorps) dans une solution ou un sérum (un anticorps anti-hiv dans le cas du test du SIDA) grâce à la technique ELISA. But du test ELISA que nous proposons: Le test consiste à doser un anticorps de lapin anti-bsa à l aide d un support tapissé de BSA (Bovine Serum Albumin) et d un anticorps antiimmunoglobuline de lapin couplé à la peroxydase. Les anticorps sont généralement coûteux, les barettes ou plaques de microtitration permettent de travailler avec de petits volumes. Kit Test ELISA Page 7 sur 20

8 Description des étapes du kit : La première étape (réalisée par nos soins) est nommée Coating, durant cette étape la BSA va se fixer au fond des cupules (par effet électrostatique). Nous utilisons une solution très concentrée de BSA qui va tapisser le fond des cupules et occuper tous les sites de fixation protéique. Les cupules sont ensuite lavées à l aide d un tampon et sont alors prêtes à l emploi. BSA Rebord de la cupule Pour mieux comprendre le Coating : 200µL d une solution de BSA à 20g/L ont été distribués dans chacune des cupules. Les barrettes ont ensuite été incubées à 4 C durant 24 heures puis lavées pour enlever l excès de BSA. Cette étape permet la fixation des protéines au fond des cupules. L anticorps à doser (anti-bsa) pourra ensuite se fixer à la BSA. La fixation de la BSA au fond des cupules est un phénomène électrostatique propre à n importe quel type de protéine (donc également aux anticorps). Il est primordial pour réaliser un bon dosage que la cupule soit tapissée de BSA afin d éviter que des anticorps se fixent au fond de la cupule et non à la protéine. C est la raison pour laquelle nous utilisons une solution très concentrée de BSA. La deuxième étape correspond à la fixation de l anticorps à doser. On incube dans les cupules 80µL de la solution à doser durant 15 minutes. Puis les cupules sont lavées avec un tampon pour enlever les quelques anticorps non fixés. Anticorps à doser = Anti-BSA Lors de la troisième étape, l anticorps de détection (ou conjugué) se fixe à l anticorps anti-bsa. Il est couplé à une enzyme : la peroxydase. Une solution d anticorps de détection est incubée dans les cupules durant 15 minutes. Puis les cupules sont lavées pour enlever les quelques anticorps non fixés. Anticorps de détection couplé à la peroxydase = Conjugué POD = Peroxydase Kit Test ELISA Page 8 sur 20

9 La dernière étape est la détection des anticorps fixés. On incube dans les cupules une solution révélatrice contenant un substrat de la peroxydase : le TMB (tétra-méthyl-benzidine) qui se colore en bleu en présence de l enzyme. L intensité de la coloration est directement proportionnelle à la quantité de peroxydase présente dans la cupule, donc directement proportionnelle à la concentration d anticorps à doser. TMB (incolore) TMB oxydé (bleu) Dans la composition de barette proposée, nous utiliserons une gamme de concentration de l anticorps à doser pour montrer que plus sa concentration en solution est importante, plus la coloration est visible. Nous lirons les intensités contre deux témoins. Nous vous proposons de réaliser d autres témoins (facultatifs) pour vérifier toutes les étapes du test et avoir une réelle démarche de laboratoire. Kit Test ELISA Page 9 sur 20

10 FICHE DE MANIPULATION PAR LES BINOMES : Les barettes fournies ont déjà subi l étape de «coating», c'est-à-dire qu elle sont prêtes à l emploi : la BSA est fixée au fond des puits NB : Les barrettes de huit puits ne sont pas totalement symétriques, un coté possède une encoche ce qui permet de repérer le puit N 1 et le N 8. Le puit 1 sera le témoin positif, les puits 2 à 7 seront les différentes concentrations de la gamme étalon et le puit 8 sera le témoin négatif. 1) Incubation de l anticorps ou du sérum non-immunisé dans les cupules et lavage A. Remplissage des cupules Dans le puit 1, mettre 80 µl (ou 2 gouttes de 40µL avec un compte-gouttes calibré) de la solution de PBSx1 Dans le puit 2, mettre 80 µl (ou 2 gouttes de 40µL avec un compte-gouttes calibré) de la solution d anticorps anti-bsa C1 Dans le puit 3, mettre 80 µl (ou 2 gouttes de 40µL avec un compte-gouttes calibré) de la solution d anticorps anti-bsa C2 Dans le puit 4, mettre 80 µl (ou 2 gouttes de 40µL avec un compte-gouttes calibré) de la solution d anticorps anti-bsa C3 Dans le puit 5, mettre 80 µl (ou 2 gouttes de 40µL avec un compte-gouttes calibré) de la solution d anticorps anti-bsa C4 Dans le puit 6, mettre 80 µl (ou 2 gouttes de 40µL avec un compte-gouttes calibré) de la solution d anticorps anti-bsa C6 Dans le puit 7, mettre 80 µl (ou 2 gouttes de 40µL avec un compte-gouttes calibré) de la solution d anticorps anti-bsa C8 Dans le puit 8, mettre 80 µl (ou 2 gouttes de 40µL avec un compte-gouttes calibré) de la solution de sérum non immunisé B. Incubation Incuber 15 minutes à température ambiante Kit Test ELISA Page 10 sur 20

11 C. Lavage Vider les cupules par retournement (voir schéma suivant en page 11) en prenant garde à ce que les contenus des cupules des puits 1 à 7 ne contaminent pas le contenu de la cupule du témoin négatif du puit 8. Sens du retournement T+ C1 C2 C3 C4 C6 C8 T- Laver deux fois au PBS tween en remplissant à la pipette les cupules sans les faire déborder. Vider les cupules par retournement en prenant à nouveau garde à ne pas contaminer le puit 8 du témoin négatif (respecter le sens de retournement) 2) Incubation de l anticorps conjugué et lavage Déposer 80µL (ou 2 gouttes de 40µL) de la solution d anticorps de détection dans toutes les cupules Incuber 15 minutes à température ambiante Vider les cupules en prenant garde à ne pas contaminer le puit 8 (voir le schéma de retournement dans le point 1 de la manipulation ci-dessus en page 11) Laver deux fois au PBS tween en remplissant à la pipette les cupules sans les faire déborder. Vider les cupules par retournement en prenant à nouveau garde à ne pas contaminer le puit 8 du témoin négatif (respecter le sens de retournement) 3) Révélation A. Enlever l aluminium protégeant le tube de TMB de la lumière pour vérifier que le TMB n est pas bleu B. Dépôt de la solution de révélation : Pour les puits 2 à 8 : Déposer 80 µl (ou 2 gouttes de 40µL au compte-gouttes calibré) de la solution de TMB substrat de la peroxydase. Pour le puit 1 : Déposer 40 µl (ou 1 goutte de 40µL au compte-gouttes calibré) de la solution d anticorps de détection et 40 µl (ou 1 goutte de 40µL au compte-gouttes calibré) de la solution de TMB substrat de la peroxydase Kit Test ELISA Page 11 sur 20

12 C. Incubation Incuber 5 minutes à température ambiante 4) Interpréter les résultats (assez rapidement) Dès le dépôt du TMB, la réaction de révélation commence : la coloration bleue apparaît. Vous disposez d environ 5 minutes pour observer les colorations de tous les puits. ATTENTION : Au-delà de 5 minutes, les puits 1 à 7 présenteront tous la même intensité de bleu. En effet, la réaction enzymatique de révélation continue car le TMB est en excès. Une fois une molécule de TMB oxydée, le site actif de l enzyme est libéré. Une nouvelle molécule de TMB se fixe à l enzyme et est oxydée à son tour. Conseil pour quantifier l intensité des différentes colorations : Vous pouvez prendre une photographie des barettes avec un appareil numérique en veillant à ce que les colorations des puits soient bien visibles. A l aide du logiciel MESURIM disponible gratuitement sur le site de l Académie d Amiens, vous pouvez mesurer les intensités lumineuses des puits. 5) Possibilité de stopper la réaction de coloration ( dans le cas où les résultats ne sont pas exploités tout de suite) Ajouter dans les puits 80 µl de 1N HCL ou 0,0625N d acide sulfurique (l acide bloque l enzyme) : le TMB vire au jaune. Conseils pour quantifier l intensité des différentes colorations : Vous pouvez lire la mesure d absorbance en spectrophotométrie à 450 nm. Il suffit de transvaser à la pipette, dans une cuve adaptée, le contenu de puits identiques issus de plusieurs barettes. Vous pouvez prendre une photographie des barettes avec un appareil numérique en veillant à ce que les colorations des puits soient bien visibles. A l aide du logiciel MESURIM disponible gratuitement sur le site de l Académie d Amiens, vous pouvez mesurer les intensités lumineuses des puits. Kit Test ELISA Page 12 sur 20

13 ATTENTION : Les volumes sont très petits et s évaporent rapidement (une barette laissée la nuit sur la paillasse est vide le lendemain). Scotcher hermétiquement les barrettes et conserver au réfrigérateur. INTERPRETATIONS ET CONCLUSIONS 1) Dans le cas d une faible concentration en anticorps anti-bsa TMB (incolore) TMB oxydé (bleu) FAIBLE COLORATION 2) Dans le cas d une forte concentration en anticorps anti-bsa COLORATION INTENSE Kit Test ELISA Page 13 sur 20

14 L intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration d anticorps à doser, plus la concentration est élevée, plus la coloration est visible. En effet, la BSA est en excès puisqu elle tapisse le fond de la cupule donc si on augmente la concentration d anticorps à doser, il y aura augmentation du nombre d anticorps fixés. Lorsque l on ajoute le conjugué, celui ci va reconnaître les anticorps anti-bsa fixés précédemment. Ainsi la quantité de peroxydase présente dans la cupule après lavage sera directement proportionnelle à la quantité d anticorps à doser. Lorsque l on ajoute le substrat de la peroxydase (le TMB) en excès, la concentration enzymatique dans la cupule déterminera la quantité de substrat transformé et, par conséquent, l intensité de la coloration. Limites du test : Ceci n est pas valable si la concentration de l anticorps de détection est inférieure à la concentration de l anticorps à doser. La concentration en substrat ne doit pas être inférieure à la concentration enzymatique. Si la BSA n est pas en excès, des anticorps peuvent se fixer aux rebords de la cupule et fausser les résultats. Pour aller plus loin : Pour compléter la manipulation, vous pouvez réaliser d autres témoins : Pour montrer que le TMB est responsable de la coloration bleue : Dans un puit, faire l étape d incubation d ancticorps avec la concentration C1 ou C2, l étape d incubation de l anticorps conjugué, l étape de lavage mais ne pas réaliser l étape de révélation au TMB. Pour montrer que l anticorps est nécessaire à la coloration bleue : Dans un puit, ne pas faire l étape d incubation d anticorps mais réaliser les étapes d incubation de l anticorps conjugué, l étape de lavage et l étape de révélation au TMB. (il est normal que la coloration bleue apparaisse au bout d un certain temps : c est le TMB qui est dégradé à la lumière) Pour montrer que l anticorps de détection est nécessaire à la coloration bleue : Dans un puit, effectuer l étape d incubation d anticorps avec la concentration C1 ou C2, sans faire l étape d incubation de l anticorps conjugué, mais effectuer l étape de lavage et l étape de révélation au TMB. (il est normal que la coloration bleue apparaisse au bout d un certain temps : c est le TMB qui est dégradé à la lumière) Pour montrer que le TMB vire au bleu au bout d un certain temps : Dans un puit, ne faire ni l étape d incubation d anticorps, ni l étape d incubation de l anticorps conjugué ni l étape de lavage mais seulement l étape de révélation au TMB. Pour montrer que le PBS n est pas responsable de la coloration bleue : Dans un puit, faire l étape d incubation d anticorps avec une solution de PBS sans Kit Test ELISA Page 14 sur 20

15 anticorps, effectuer l étape d incubation de l anticorps conjugué, l étape de lavage et l étape de révélation au TMB. (il est normal que la coloration bleue apparaisse au bout d un certain temps : c est le TMB qui est dégradé à la lumière) Pour montrer que le lavage est nécessaire pour enlever les anticorps conjugués qui ne sont pas fixés et donc non spécifiques du dosage : Dans un puit, ne pas faire l étape d incubation de l anticorps, effectuer l étape d incubation de l anticorps conjugué, ne pas procéder au lavage mais révéler au TMB normalement. Pour voir plus de caractéristiques du test ELISA, vous pouvez déterminer le point d extinction, c est à dire la concentration minimale d anti-bsa détectée par la technique. Pour ce faire, il suffit de diluer la solution C8 (page 3) en cascade, on peut faire une barrette avec des concentrations C9, C10, C11 Le point d extinction doit apparaître en C10 ou C11 si on a réalisé des dilutions au 1/2. On montre ainsi que le test ELISA est une technique très sensible puisqu elle permet de détecter des concentrations infimes d anticorps. C10 = 0,033µg d AC/ml C11 = 0,0166µg d AC/ml Remerciements à Brigitte Maurel (lycée de Decazeville) qui a élaboré et mis au point ce protocole. Kit Test ELISA Page 15 sur 20

16 FICHE SECURITE Le TMB est un produit dangereux qui nécessite le port de gants, de lunettes et d une blouse. Le PBS tween et le PBS doivent de préférence être manipulés avec gants, lunettes et blouse. Les anticorps ne sont pas dangereux en eux-mêmes mais étant donné qu ils sont dilués dans le PBS, il faut respecter les mêmes consignes de sécurité que vis-à-vis du PBS. Produit Pictogramme et risques normalisés TMB T. Toxique R 61 Risque pendant la grossesse d'effets néfastes pour l'enfant. R 20/21 Nocif par inhalation et par contact avec la peau. R 36 Irritant pour les yeux. Ne s enflamme pas spontanément et n est pas explosif De contact avec la peau En règle générale, le produit n'irrite pas la peau. Actions à mener en cas d inhalation de d ingestion projection dans les yeux Donner de Lavage Si les troubles l air frais. avec de persistent, Assistance l'eau en consulter un respiratoire écartant médecin. si les nécessaire. paupières Tenir le plusieurs malade au minutes. chaud. Si les Si les troubles troubles persistent, persistent, consulter consulter un un médecin. médecin. Remarques générales: Les symptômes d'empoisonnement peuvent apparaître après de nombreuses heures seulement ; une surveillance médicale est donc nécessaire au moins 48 heures après un accident. En cas d'inconscience, coucher et transporter la personne en position latérale stable Kit Test ELISA Page 16 sur 20

17 Produit Pictogramme et risques normalisés PBS Ne s enflamme pas spontanémen t et n est pas explosif de contact avec la peau Laver immédiateme nt la peau avec une grande quantité d eau savonneuse pendant au moins 15 minutes. Laver les vêtements contaminés avant réutilisation. Consulter un médecin si des symptômes se développent (rougeurs, démangeai -sons) Actions à mener en cas d inhalation de projection dans les yeux Emmener la Rincer personne à immédiatem l air frais. Si ent les yeux elle ne respire à grande pas, la mettre eau pendant sous au moins 15 respirateur minutes en artificiel. Si la séparant personne les respire avec paupières. difficulté, lui administrer de l oxygène et appeler un médecin. d ingestion Si la personne est consciente, lui rincer imméditement la bouche avec de l eau puis lui faire boire une grande quantité d eau. Appeler un médecin. Kit Test ELISA Page 17 sur 20

18 Produit Pictogramme et risques normalisés PBS tween Ne s enflamme pas spontanémen t et n est pas explosif de contact avec la peau Laver immédiate -ment la peau avec une grande quantité d eau savonneuse pendant au moins 15 minutes. Laver les vêtements contaminés avant de les utiliser. Actions à mener en cas d inhalation De projection dans les yeux Emmener la Rincer personne à immédiatem l air frais. Si ent les yeux elle ne respire à grande pas, la mettre eau pendant sous au moins 15 respirateur minutes en artificiel. Si la séparant personne les respire avec paupières. difficulté, lui administrer de l oxygène et appeler un médecin. d ingestion Si la personne est consciente, lui rincer immédite -ment la bouche avec de l eau puis lui faire boire une grande quantité d eau. Appeler un médecin. Kit Test ELISA Page 18 sur 20

19 FICHE CONSERVATION Les flacons de PBSx10 se conservent à +4 C La solution diluée se garde à +4 C pendant 1 mois au plus. 2 bouteilles de PBStween se conservent à +4 C Le sachet A contenant 3 microtubes est conservé à -20 C : 1 microtube à bouchon rouge contenant 110µL de sérum de lapin immunisé contre la BSA -20 C 1 microtube à bouchon bleu contenant 50 µl d anticorps anti- Immunoglobuline de lapin couplé à la peroxydase -20 C 1 microtube à bouchon naturel contenant 110µL de sérum de lapin non immunisé -20 C Le contenu du sachet A peut être conservé 6 mois dans les conditions décrites ci-dessus. Les solutions diluées à partir des tubes du sachet A se conservent 24 heures à 4 C ou bien 4 semaines à -20 C Le sachet M contenant plusieurs tubes est conservé à +4 C : 1 tube en plastique vide de 50 ml à fond conique : il doit rester propre et sans trace de détergeant pour la préparation du TMB ( ATTENTION : pour une longue conservation, garder les plaques à l abri de la lumière) 1 tube à bouchon rouge contenant 10 ml d eau stérile +4 C 1 tube noir contenant 8 ml de TMB +4 C ( ATTENTION : le TMB doit être gardé à l abri de la lumière) 1 tube à fond conique de 12 ml de PBSx10 +4 C 1 sachet noir de 20 barettes de micro-titration avec leurs supports +4 C Le contenu du sachet M peut être conservé 6 mois dans les conditions décrites ci-dessus (à part le tube vide de 50 ml qui se conserve aussi longtemps que nécessaire) La solution diluée de PBS (PBSx1) se conserve 4 semaines à 4 C mais la solution de TMB diluée (conservée à l abri de la lumière) ne se garde que 24 heures à 4 C. Kit Test ELISA Page 19 sur 20

20 FICHE TRI ET RECUPERATION Le TMB, le PBS, le PBS tween doivent être récupérés dans un récipient adapté ou à défaut dilués dans une grande quantité d eau. Les barettes de plastique peuvent être jetées dans les bacs de récupération du plastique. Elles sont recyclables. Kit Test ELISA Page 20 sur 20