Etude de performance des bifidobactéries isolées d un yaourt fabriqué en Algérie

Transcription

1 République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche scientifique Université d'oran Es-Senia Faculté des Sciences Département de Biologie MEMOIRE DE MAGISTER Option: Microbiologie Alimentaire Thème Etude de performance des bifidobactéries isolées d un yaourt fabriqué en Algérie Devant le jury: Présenté par Mademoiselle ABDELMALEK ASMAA Soutenu le: / /2008 Président : Pr. BELKHOUDJA Moulay Université d'oran Examinateur : Pr. SLIMANI Miloud Examinateur : Dr. CHEKROUNE Abdallah Examinateur : Dr. HADADJI Miloud Rapporteur : Pr. BENSOLTANE Ahmed Université d'oran Université d'oran Université d'oran Université d'oran Année universitaire

2 Remerciements J adresse mes sincères remerciements au Pr BENSOLTANE Ahmed qui m a offert par ses compétences scientifiques et pédagogiques et ses qualités humaines, les moyens de mener à bien ce travail. Je tiens également à le remercier pour la confiance et le soutien permanent. J adresse toute ma reconnaissance au Pr BELKHODJA Moulay d avoir accepter de présider le jury de soutenance. Je remercie Pr SLIMANI Miloud, Dr CHEKROUN Abdallah et Dr HADADJI Miloud d avoir accepter de juger mon travail. Je remercie Dr REZEILE médecin chef du laboratoire d hygiène de la wilaya d Oran de m avoir accueilli au cours d un stage dans son laboratoire ainsi que tout le personnel du laboratoire. Des remerciements chaleureux vont à ma famille. Enfin je remercie aussi tous ceux qui ont de prés ou de loin contribué à la réalisation de ce travail.

3 A ma famille

4 Résumé Nous avons isolé des bifidobactéries à partir du yaourt fabriqué et commercialisé en Algérie. L étude macroscopique montre que ces bactéries forment des petites colonies blanchâtres, l étude microscopique montre la présence des formes typiques au genre Bifidobacterium, de Gram positif et ne possèdent pas de catalase. Les souches isolées poussent au température 37 et 45 C et au ph 6.5 et 7. Les souches étudiées ont montré un pouvoir acidifiant important, un taux de croissance qui dépasse 0.4 h -1 et un temps de génération important qui confirme ses aptitudes technologiques et ses caractères probiotiques. L étude de la viabilité sur milieu lait pendant 21 jours à un ph initial égale à 4.5 a montré la résistance des souches étudiées à l acidité et à une température de conservation égale 4 C avec une létalité moyenne égale à 2.5 Log UFC/ml. Le dénombrement des bifidobactéries à partir du produit commercialisé a montré la présence d un nombre Log 4.2 UFC/ml pour le yaourt aromatisé et un nombre Log 5.5 UFC/ml pour le yaourt fruité. Par contre le nombre de Strepfococcus thermophilus est supérieur à 10 7 pour les deux produits le jour d expiration et le nombre de Lactobacillus bulgaricus est supérieur à 10 6 pour tous les échantillons le jour d expiration. Les analyses microbiologiques des échantillons utilisés dans notre travail ont démontrés qu ils sont de bonne qualité. Mots clés : Bifidobacterium, yaourt, probiotique, viabilité.

5 الملخص قمنا بعزل Bifidobacteria من یاغورت مصنع و مسوق في الجزاي ر. الدراسة الماكروسكوبیة تبین أن البكتیریا المعزولة تكون مستعمرات صغیرة بیضاء اللون. الدراسة المیكروسكوبیة تبین وجود أشكال خاصة بنوع Bifidobacterium موجبة الغرام (Gram) بدون كاتالاز. السلالات المعزولة تنمو عند درجة حرارة 37 و 45 درجة مي ویة. السلالات المدروسة أظھرت قدرة على تكوین درجة حموضة ھامة درجة النمو تفوق 0.4 التكنولوجیة و قدراتھا العلاجیة. وقت تناسل مھم یو كد كفاءتھا دراسة إمكانیة العیش في وسط الحلیب لمد ة 21 یوم ph ابتداي ي یعادل 4.5 أظھرت السلالات مع المدروسة مقاومة للحموضة و لدرجة التخزین التي تعادل 4 درجات مي ویة مع نقص للبكتیریا بمعدل Log 2.5ufc/ml تعداد Bifidobacteria مباشرة من المنتج یاغورت المسوق بی نت وجود Log 4.2 ufc/ml للیاغورت المعطر و Log 5.5 ufc/ml للیاغورت المثمر ) الفواكھ ). على العكس عدد Strepfococcus thermophilus یفوق 7 10 لكل یاغورت یوم انتھاء الصلاحیة و عدد Lactobacillus bulgaricus یفوق 6 10 لكل العینات المدروسة. التحالیل المیكروبیولوجیة للعینات المستعملة في دراستنا بی نت المنتوج جید الجودة. الكلمات المفتاحیة : Bifidobacterium الیاغورت قدرات علاجیة إمكانیة العیش.

6 Summary We isolated the bifidobacteria from yoghurt manufactured and marketed in Algeria. The macroscopic study shows that the bacteria form small white colony, the microscopic study shows the presence of the typical forms to Bifidobacterium genus, positive Gram and do not have catalase. The strains push at the temperature 37 and 45 C and to ph 6.5 and 7. The strains show an important acidifying capacity, a growth rate exceeds 0.4 h -1 and important generation time witch confirm these technological qualification and probiotics characters. The viability in milks during 21 days with initial ph=4.5 shows that the strains isolated resist to acidity and to temperature of conservation= 4 C with rate of lethality = 2.4 Log ufc/ml. The enumeration of bifidobacteria from marketed yoghurt showed the presence Log 4.2 ufc/ml in aromatized yoghurt and Log 5.5 ufc/ml in fruity yoghurt. On the other hand the number of Strepfococcus thermophilus is higher than 10 7 in all yoghurts on day of expiry and the number of Lactobacillus bulgaricus is higher than 10 6 in all yoghurts on day of expiry. The microbiological analyses of the yoghurts used in our work showed that it is of good quality. Key words: Bifidobacterium, yoghurt, viability, probiotic.

7 Liste des abreviations ADN Acide désoxyribonucleique. ARN Acide ribonucleique ribosomale. B1 Bifidobactérie isolée du yaourt Danone aromatise. B2 Bifidobactérie isolée du yaourt Danone fruité. B3 Bifidobactérie isolée du yaourt Soummam aromatisé. B4 Bifidobactérie isolée du yaourt Soummam fruité. Bif Bifidobacterium C Degrée celsius CO2 Gaz carbonique CF Coliformes fécaux CT Coliformes totaux cys Cystéine D degrée dornic E,M,P Embden Meyerhof parnas Fig Figure g/l Gramme par litre GT Gélose témoin h Heure Hcl chlohydrate Kcal Kilocalorie Lb Lactobacillus LHWO Laboratoire d Hygiène de la Wilaya d Oran NYA National Youghurt Asotiation (Etats unies) Ox Oxydase P1 Yaourt Danone aromatisé P2 Yaourt Danone fruité

8 P3 P4 ph St Tab Ufc Yaourt Soummam aromatisé Yaourt Soummam fruité Potentiel d hydrogène Streptococcus Tableau Unité formant colonies

9 Liste des figures figure1 :Schéma du métabolisme complémentaire de Streptococcus thermophilus et Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus dans le lait...11 figure 2 :Procédure de fabrication du yaourt...13 Figure 3 : Schéma simplifié décrivant les compartiments de l appareil digestif de l homme et leurs microflores...22 Figure 4 : la voie du fructose 6-phosphate ou bifid(us) shunt.30 Figure 5 : Les principaux effets bénéfiques attribués aux probiotiques.. 45 Figure6 Technique d isolement des bifidobactéries...51 Figure 7 Tests de fermentation des sucres..55 Figure8Technique de dénombrement des lactobacilles et streptococcus..58 Figure 9 Technique de recherche des coliformes fécaux et totaux.60 Figure 10 Recherche Staphyloccocus aureus.61 Figure 11 Recherche d E. coli.. 62 Figure 12 Recherche Salmonnelles...63 Figure 13 Recherche des levure et moisissures..63 Figure 14: Aspect macroscopique de la souche B1 sur milieu MRScys après 48 h à 37º 65 Figure 15:Aspect microscopiques de la souches B Figure 16: Aspect macroscopiques de la souche B2 sur milieu MRScys après 48 h à 37º 66 Figure 17 : Aspect microscopiques de la souche B Figure 18 : Aspect macroscopiques de la souche B3 sur milieu MRScys après 48 h à 37º 67 Figure 19 : Aspect microscopique de la souchesb Figure 20: Aspect macroscopique de la souche B4 sur milieu

10 MRScys après 48 h à 37º...68 Figure 21 : Aspect microscopique de la souche B Figure 22 : Aspect microscopiques de la souche B2 après plusieurs repiquages..69 Figure 23 : Aspect microscopique de la souche B3 après plusieurs repiquages...69 Figure 24 : les sucres dégradés par la souche de la souche B Fig 25: la sensibilité des bifidobactéries a la Ery, Sulp, Pénn, Chlo, Amp, amox.73 Fig 26 : cinétique d évolution de l acidité Dornic produite par les souches B1, B2,B3 et B4 à 42 C.. 74 Fig 27 : Variation du ph des souches B1,B2,B3 et B4 lors du suivie de l acidité titrable Fig 28 : La survie des souches B1,B2, B3 et B4 dans milieu lait a ph 4.5 Pendant 21 jours..76 Fig 29 : Viabilité des bifidobactéries et les bactéries lactiques dans P1 Aromatisées de Danone..77 Fig 30 : Viabilité des bifidobactéries et les bactéries lactiques dans P2 Fruité de Dannone..77 Fig 31 : Viabilité de bifidobactéries et les bactéries lactiques dans P3 aromatisé de Soummam..78 Fig 32 : Viabilité de bifidobactéries et les bactéries lactiques dans P4 fruité de Soummam.78

11 Liste des tableaux Tableau 1 : nombre de microorganismes retrouvés dans un yaourt répondent à la norme de qualité 6 Tableau 2 : Apports des différents yaourts pour un pot de 125 g 15 Tableau 3 : Principales bactéries lactiques associées aux produits laitiers fermentés et leurs rôles 20 Tableau 4 : Les différentes espèces de bifidobacterium et leur origines.25 Tableau 5 : Quelques produit laitiers commercialisés contiennent de Bifidobacterium...33 Tableau 6 : les microorganismes considérés comme probiotiques...46 Tableau 7 : Différents aspects macroscopiques et microscopiques 64 Tableau 8 :Mise en évidence de certaines activités enzymatiques chez les souches étudiées. 70 Tableau9 :Type fermentaire des souches des bifidobactéries 70 Tableau 10: Effets Température, ph, oxygène sur la croissance des béfidobactéries.72 Tableau 11 :Résultat de l antibiogramme des souches isolées 72 Tableau 12 :Taux de croissance spécifiques et temps de génération des souches B1, B2,B3,B4. 73 Tableau 13 : contrôle de qualité des yaourts utilisés.79

12 Sommaire page Introduction 3 Etude bibliographique I- Laits fermentés et yaourt 4 1. Les laits fermentés Divers laits fermentés. 4 2.Le yaourt Définition Les micro-organismes retrouvés dans le yaourt La microflore essentielle La microflore non essentielle La microflore contaminantes Le métabolisme et fonction des bactéries du yaourt Procédure de fabrication du yaourt Les modifications du yaourt La composition chimique du yaourt Les glucides Les protéines Les lipides Les minéraux Les vitamines Apports nutritionnels du yaourt Les effets bénéfiques du yaourt 16 II- Les bactéries lactiques et bifidobactéries Les bactéries lactiques Définition Principales caractéristiques Taxonomie et classification...18

13 1.4. Bactéries lactiques et produit alimentaires fermentés Les bactéries lactiques dans les produits laitiers 19 2.LES BIFIDOBACTERIES Définition Ecologique des bifidobactéries Taxonomie et les différents espèces Caractéristiques morphologiques,physiologiques et biochimiques des bifidobactéries Morphologie Physiologies des bifidobacteries Température L Oxygène Le ph la sensibilité aux antibiotiques Les besoins nutritionnels des bifidobactéries Biochimie des bifidobactéries Le Métabolisme Métabolisme des vitamines Production des substances antimicrobiennes Les bifidobactéries en tant qu'agents aromatisants L utilisation des bifidobactéries dans les produits laitiers La viabilité des bifidobacteries dans les produits laitiers Milieux sélectifs utilisés pour la détection des bifidobactéries dans les produits laitiers Génétique des bifidobactéries Pourcentage en base cytosine guanine de l ADN Les plasmides des bifidobactéries L étude de la séquence d ADN.. 40

14 III-Les probiotiques et les prébiotiques Définition des probiotiques Définition des prébiotiques Définition des symbiotiques les propriétés fonctionnelles des Probiotiques Survie des probiotiques dans le tube digestif chez l Homme Mécanismes d action des probiotiques Les probiotiques et leurs effets bénéfiques sur la santé Les probiotiques en pathologie digestive Probiotiques et immunité Probiotiques et maladies métaboliques Les principales souches microbiennes à potentiel probiotique Effets probiotiques des bifidobactéries.47 Matériel et méthodes 49 1.Echantillons Milieux de cultures utilisées dans notre étude Milieux de cultures pour isoler les bifidobactéries Milieux de culture pour les bactéries lactiques Milieu lait 49 3.Isolement des bifidobactéries Purification des souches Pré-identification des souches Coloration de Gram Recherche de catalase Recherche de l oxydase L antibiogramme Caractérisation des espèces Croissance en anaérobiose Production de gaz à partir du glucose..52

15 3.3.3Production d indole Production d une gélatinase Test de fermentation des sucres Coagulation du lait écrémé stérile cystéiné Préparation de l innoculum Effets d oxygène, température et ph sur la croissance l effet d oxygène L effet du ph L effet de température 54 4.Taux de croissance spécifiques et temps de génération des isolats Préparation des cultures Suivie de l acidité titrable Suivi du ph 56 6.Résistance des souches isolé a l acidité et la survie en milieu lait a 4 C Dénombrement des Bifidobactéries et bactéries lactiques avant la date d expiration Controle de qualité des yaourts utilisés dans notre travail Recherche des coliformes fécaux et totaux Recherche d E. coli Recherche des Staphyloccocus aureus Recherche des Salmonnelles Recherche des levures et moisissures 61 Résultats 1.Pré-identification des souches Aspect macroscopiques Aspect microscopiques Caractérisation du genre Fermentation des sucres Effets d oxygène, température et ph sur la croissance 71

16 2.3. L antibiogramme Caractérisation du coagulum Taux de croissance spécifiques et temps de génération des souches L acidification du lait.74 5.La survie de bifidobatérie dans milieu lait Dénombrement des bifidobactéries et les bactéries lactiques dans le produit commercialisé Contrôle de qualité des échantillons des yaourts utilisés dans notre travail..79 Discussion 1.Les conditions et les milieux d isolement Identification des souches Les aptitudes biotechnologiques Dénombrement et viabilité des bifidobactéries et les bactéries lactiques dans un yaourt fabriqué et commercialisé en Algérie Contrôle de qualité des échantillons des yaourts utilisés dans notre travail 90 Conclusion et perspectives Références bibliographiques...93 Annexe

17 Introduction L histoire des laits fermentés est étroitement liée à la consommation du lait et à sa conservation. Elle est également liée au nomadisme et aux habitudes alimentaires des différentes régions du monde. Les produits eux-mêmes sont très différents d un pays à l autre et en dehors des produits classiques, proches de ceux que nous consommons, on peut trouver des produits pétillants, très acides ou encore plus ou moins alcoolisés (Bourlioux,2007). L industrialisation des laits fermentés n a démarré qu au xx e siècle. En effet, c est en 1919 qu Isaac Carasso commence à produire du yaourt à Barcelone selon des procédés industriels. De nombreuses recherches scientifiques permettent aujourd hui, à la fois de donner des caractéristiques de texture ou de goût, mais surtout de justifier l utilisation des allégations santé pour des produits contenant des probiotiques. Que ce soit pour un produit standard («plaisir») ou un produit probiotique «santé» et «plaisir».(pelletier et al 2007). Le produit yaourt est appelé aussi yoghurt, yogurt, yaourti, yourt, yahourth, yogur or yoghourt et parfois on peut trouver le «Y» remplacée par un «J» (Nilson, 1973). Depuis quelques années, les produits laitiers contenant des bactéries probiotiques ont connu un gain de popularité auprès des consommateurs. Les bifidobactéries d intérêt laitier sont déjà employées dans une grande variété de produits laitiers probiotiques comme le lait, le fromage, le yaourt et la crème glacée (Tamime et al., 1995). Les bifidobactéries, hôtes naturels des intestins de l homme et des animaux à sang chaud, ont des propriétés nutritionnelles et thérapeutiques aujourd hui reconnues. En effet, parmi ces effets, on note le contrôle de la flore intestinale et l inhibition de la croissance de nombreux pathogènes et bactéries

18 putréfiantes, la régulation du transit intestinal, l amélioration de l intolérance au lactose et des allergies alimentaires aux caséines laitières, certaines propriétés anticancérigènes, anticholestérolémiques et antidiarrhéiques ainsi qu une stimulation du système immunitaire (Modler et al., 1990; Gournier-Chateau et al., 1994; Salminen et Saxelin, 1996; Tannock, 1997). La survie des bifidobactéries dans les produits laitiers fermentés dépend de facteurs divers tels que la souche des bactéries utilisées, les conditions de fermentation, la température d entreposage et les conditions de conservation (Shimamura et al, 1992 ; Roy, 2005). La croissance des bifidobactéries dans le lait est souvent lente ou limitée comparée à celle des bactéries lactiques utilisées dans les produits laitiers fermentés, et ceci semble partiellement dû à de faibles activités protéolytiques. En fabriquant le fromage ou le yaourt, l addition des cultures probiotiques aux ferments a généralement comme conséquence une croissance plus lente des souches probiotiques comparé à si elles étaient ajoutées au lait seules ( Dave et Shah., 1997). L utilisation de plus hauts niveaux d inoculum de bifidobactéries et l addition de facteurs de croissance comme la source d azote devraient améliorer la croissance et la viabilité des bifidobactéries. Le succès de l incorporation des bifidobactéries dans les yaourts dépend des souches de bifidobactéries, de l activité des bactéries lactiques utilisées dans la fabrication du yaourt, de la composition du yaourt, et des conditions de fabrication. Les changements de la composition chimique et de la texture des produits fermentés peuvent se produire dans les yaourts et les laits fermentés à la suite de l incorporation des bifidobactéries, sans affecter les propriétés sensorielles (Roy., 2005).

19 Notre travail est divisé en deux parties : La première partie : une étude bibliographique qui révèle plusieurs points sur les différents lait fermentés et le yaourt, les bactéries lactiques et les bifidobactéries. La deuxième partie : composé d une méthodologies de travail, puis résultat et discussion. Le but de notre travail est : 1-Isoler des bifidobactéries à partir d un yaourt fabriqué et commercialisé en Algérie. 2- Etudier leurs caractères et aptitudes biotechnologiques. 3-Dénombrer le taux des bifidobactéries présent dans le yaourt commercialisé avant la date d expiration.

20

21 I-Lait fermentés et yaourt 1. Les laits fermentés : Les laits fermentés, un aliment apprécié pour sa saveur, sont préparés depuis une époque très lointaine en Asie centrale, dans les pays méditerranéens et dans la plupart des régions d'élevage où ils constituent un mode de protection et de conservation du lait grâce à l'abaissement du ph en même temps qu'ils sont un aliment apprécié pour sa saveur. (FAO,1998 ; Mahaut et al, 2000 ). Longtemps restés traditionnels, certains de ces produits connaissent depuis quelques années un développement considérable grâce, d'une part, à l'intérêt qu'y trouvent les consommateurs sur le plan organoleptique, nutritionnel, voire thérapeutique et, d'autre part, à la mise en œuvre de procédés de fabrication industriels et aux progrès de la distribution (FAO,1998 ; Mahaut et al, 2000 ). Ces produits présentent un grand intérêt dans les pays en développement en raison de leur acidité qui en fait des aliments hygiéniques, sans inconvénients pour les consommateurs intolérants au lactose. De plus, ils présentent une bonne valeur nutritionnelle, des qualités organoleptiques généralement très bien acceptées ainsi qu'une relative facilité de préparation et de distribution. Enfin, l'attrait pour ces produits est renforcé par leur diversification et par de puissantes campagnes publicitaires. (FAO,1998 ; Mahaut et al, 2000 ) Divers laits fermentés : Il existe un nombre considérable de laits fermentés qui diffèrent par leurs origines (vache, chèvre, brebis et chamelle), leur flore totale, leur texture

22 (liquide, filante ou épaisse), leur acidité et leur durée de conservation qui peut atteindre plusieurs mois (FAO,1998 ; Chougrani et al.,2008). Les principaux laits fermentés sont : Lait fermenté à l acidophile : préparé par Lactobacillus acidophilus, il est apprécié comme aliment hygiénique Lait fermenté au bifidobacterium seul ou associé au Lactobacillus acidophilus ou Lactobacillus casei. Lait fermenté alcoolisé, le Kéfir qui est originaire du Caucase préparé avec un mélange complexe de bactéries lactiques et de levures, et le Koumis originaire de l Asie centrale, est fabriqué avec du lait de Jument ou de chamelle la fermentation résulte d une flore mixte de bactéries lactique et de levures. Il existe Aussi le Zimne obtenu à partir de lait de brebis en Yougoslavie, le touloum en Turquie le Leben en moyen orient et en Afrique du nord. En chine existe le Kurut, riche en éléments nutritionnels, en vitamines, en une grande diversité des bactéries lactiques et en levures.( Zhang et al., 2008). 2.Le yaourt : 2.1 Définition : Les yaourts sont définis comme des laits coagulés qui sont obtenus via une acidification du milieu par l'action de microorganismes spécifiques (Rasic et Kurmann, 1978). Les yaourts sont fabriqués a partir de lait entier ou ses dérivés, généralement d'origine animale (vache, chèvre, brebis, bison. etc.); cependant certains peuples utilisent le lait d'origine végétale (soya) pour la production de lait fermenté (FAO,1998).

23 La composition du lait varie généralement avec l'origine et affecte les propriétés du yaourt. Les yaourts faits de lait de bison, de yak ont généralement une meilleure consistance que ceux faits avec du lait de vache ou de chèvre puisqu'on observe une variation au niveau de la structure des particules de caséine et des globules gras (Rasic et Kurrnann, 1978). Industriellement, on standardise le contenu protéique et la teneur en matières grasses du lait de départ afin d'uniformiser le produit. Cette standardisation se fait par l'addition de lait écrémé, de lactosérum, de crème (Rasic et Kurrnann, 1978) Les micro-organismes retrouvés dans le yaourt : Les différents microorganismes que l'on retrouve dans le yaourt peuvent être divisés en trois groupes : la microflore essentielle, la microflore non essentielle et les contaminants. Et un bon yaourt doit répondre à norme de qualité. (tableau 1) (Tamime,1999). Tableau 1 : nombre de microorganismes retrouvés dans un yaourt répondent à la norme de qualité (Tamime,1999) Micro-organismes S.thermophilus 10 ufc/ml L. delbrueckii subsp. bulgaricus 10 ufc/ml Coliformes (ufc/ ml) Levures (ufc/ml) Moisissures Nombre > 100 > 100 < 1 < 10 Absence

24 2.2.1 La microflore essentielle : Composée de Strepfococcus thermophilus et Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus et si l'une de ces bactéries est absente du milieu de fermentation, on ne peut désigner le produit comme étant un yaourt, mais plutôt comme étant un lait fermenté. Les streptocoques de type S. thermophilus sont des bactéries en forme de coques disposées en chaînes, de longueurs variables ou par paires. (Rasic et Kurmann, 1978). La température et le milieu nutritif influencent sur la morphologie de cette souche. La température optimale de croissance pour ce microorganisme varie entre 40 C et 45 C. S. thermophilus possède un métabolisme de type homofermentaire (Rasic et Kurmann, 1978). Les lactobacilles, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, sont des bactéries en forme de bâtonnets isolés ou en courtes chaînes. La température optimale de croissance pour cette bactérie varie entre 40 C et 43 C. L. delbrueckii subsp. Bulgaricus possède aussi un métabolisme de type homofermentaire. (Rasic et Kurmann, 1978 ; Tamime,1999). Généralement, les cultures commerciales ayant une population de bactéries lactiques mixtes utilisent un ratio S. fhermophillus : L. delbrueckii subsp. bulgaricus se situant entre 1/l et 2/l. Le ratio est généralement ajusté selon le type de yaourt fabriqué. (Rasic et Kurmann, 1978) La microflore non essentielle : Composée de diverses bactéries lactiques homofermentaires et hétérofermentaires, de moisissures et de levures. On rajoute généralement ces bactéries afin d'améliorer la qualité organoleptique ou nutritionnelle du produit. (Tamime,1999).

25 2.2.3 La microflore contaminantes : La présence de contaminants (coliformes, lactobacilles, etc.) est peu souhaitée puisqu'ils peuvent dégrader la qualité organoleptique du produit(tamime,1999). 2.3 Le métabolisme et fonction des bactéries du yaourt : Après leur inoculation dans le lait, les bactéries du yaourt se multiplient et transforment considérablement les caractéristiques du lait au niveau physique, chimique, bactériologique, organoleptique, nutritionnel et physiologique. Le lactose est le sucre le plus abondant dans le lait et celui-ci est utilisé par la microflore essentielle du yaourt comme source de carbone et d'énergie. (Rasic et Kurmann, 1978). Les bactéries du yaourt sont pourvues d'une perméase qui permet le passage du lactose a travers la membrane cellulaire. Dans la cellule, le lactose est clivé en glucose et en galactose par une 8-galactosidase (Greenberg et Mahoney, 1982 ; Hutkins 2001). Le galactose n'étant pas utilisé par la plupart de ces souches est alors relégué dans le milieu. Par la suite, le glucose est transformé en acide lactique par la voie glycolytique Embden-Meyerhof. La souche S. thermophilus synthétise exclusivement de I'acide lactique sous forme L(+) et cette dernière est la plus facilement métabolisable. Par contre, L. delbrueckii subsp. bulgaricus produit de I'acide lactique de forme D(-) (Rasic et Kurmann, 1978 ; Robinson et al., 2002).

26 Lors de la production du yaourt, Streptococcus thermophilus convertit rapidement le lactose en acide lactique. La concentration d'oxygène dans le milieu étant très faible, mais non nulle, de I'acide formique et du CO 2 sont aussi synthétisés. Le CO 2 et I'acide formique stimulent alors la croissance de Lactobocillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Ce dernier se développe et produit de petits peptides et acides aminés qui, à leur tour, encouragent la croissance continue de S. therrnophilus (Rasic et Kurmann, 1978 ; Robinson et al., 2002). Ce métabolisme complémentaire est schématisé a la figure 1 est à noter que la quantité d'acide lactique produite par le mélange des deux bactéries est plus grande que la somme d'acide produite individuellement par les bactéries; on appelle ce phénomène la synergie.(frederickson, 1977 ; Courtin et Rul, 2003). La croissance des deux bactéries est arrêtée lorsque la concentration d'acide lactique totale les inhibe. De plus la présence importante de galactose aurait un effet inhibiteur sur l'activité B-galactosidase, réduisant ainsi la croissance de ces souches. (Rasic et Kurmann, 1978 ; Robinson et al., 2002). Le lait possède un contenu protéique total de 3.2%, dont 80% sont sous formes de caséines. La production bactérienne d'acide lactique se reflète par une diminution du ph du lait; lorsque celui-ci atteint le point isoélectrique des caséines (ph 4.61, le complexe calcium-caséinate-phosphate est déstabilisé et un caillé se forme (Rasic et Kurmann, 1978 ; Robinson et al., 2002). Au cours de la fermentation du lait, on observe la formation d'acide lactique et de métabolites secondaires; ces derniers sont constitués de composés carbonyles, d'acides gras volatils et d'alcools (Gorner et al., 1968; Schulz et al., 1954). Les composés carbonyles que I'on retrouve dans le yaourt sont l'acétaldéhyde, le diacétyle, I'acétoine, l'acétone et le butanone-2. L'acétaldéhyde

27 est le composé impliqué principalement dans la flaveur du yaourt et cette substance est rnétabolisée principalement par la souche L. delbrueckii su bsp. bulgaricus (Gorner et al., 1968; Schulz et al., 1954). L'acétaldéhyde est généralement transformé en éthanol par l'alcool déshydrogénase des bactéries lactiques, mais la plupart des souches utilisées dans les yaourts sont dépourvues de cette enzyme, ce qui explique la quantité importante d'acétaldéhyde que I'on retrouve dans le lait fermenté de type yaourt.(courtin et Rul, 2003). L'optimum de flaveur est généralement obtenu lorsque les yaourts contiennent d'acétaldéhyde à un ph variant entre 4.0 et 4.4. Le diacétyle et I'acétoine sont des composés qui sont présents en très faible quantité, mais qui contribuent au goût plaisant du yaourt. La synthèse de ces substances est généralement associée au métabolisme de la souche S. thermophilus. Quant à l'acétone et le bufanone-2, ces substances originent généralement du lait, mais peuvent être produites par les bactéries du yaourt (Rasic et al, 1971). Les acides gras volatils (acide acétique, acide propionique, acide formique) et l'éthanol qui sont produits au cours de la fermentation contribueraient aussi à la saveur des yaourts. (Rasic et al, 1971). 2.4 Procédure de fabrication du yaourt : Le lait est standardisé au taux de matière grasse requis pour le produit fini et peut être enrichi en extrait sec laitier. Il est homogénéisé pour favoriser la dispersion de la matière grasse et traitée à 90 C pendant quelques minutes. Ce traitement thermique entraîne notamment la destruction de germes pathogènes, l'inactivation des enzymes, la fixation de la plus grande partie des protéines solubles sur les molécules de caséine.(lamoureux,2000).

28 figure 1 : Schéma du métabolisme complémentaire de Streptococcus thermophilus et Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus dans le lait. (Lamoureux,2000)

29 Le lait est ensuite refroidi pour atteindre la température optimale de fermentation (vers 45 C). L'ensemencement (taux de 5 à 10 %) se fait le plus souvent à partir d'un levain déjà préparé en cuve. La fermentation se fait en 2 à 3 heures : Pour les yaourts fermes, le lait ensemencé est directement mis en pots; dès formation du caillé, ceux-ci sont stockés à 4 C, de façon à stopper l'acidification. Pour les yaourts brassés, le lait ensemencé fermente en tanks où il sera brassé en fin de fermentation. Le mélange est ensuite refroidi puis mis en pot et stocké à 4 C, Figure 2. Suivant le type de yaourt, l'adjonction de fruits, de sucres, d'édulcorants et d'arômes se fait avant ou après fermentation (Syndifrais,1997 ;Lamoureux,2000 ). 2.5 Les modifications du yaourt : Les modifications les plus importantes ont lieu durant la fermentation, au niveau industriel, une fermentation de 2 à 6 heures à des températures variant entre 40 C et 46ºC est généralement suffisante pour obtenir un lait coagulé.(syndifrais,1997 ; Lamoureux,2000 ). Plusieurs facteurs tels que la température de fabrication, le contenu protéique du milieu, l'activité protéolytique des souches et l'acidité affectent les propriétés physiques du yaourt. Les propriétés physiques telles que la fermenté, la consistance, la viscosité sont d'ailleurs le sujet de plusieurs investigations (Rasic et Kurmann, 1978 ; Rash,1990; Laye et al., 1993).

30 Traitement préliminaire du lait Standardisation du gras 0.5%-3% Fortification des solides 12%-16% Addition d agent sucrant ou d agents stabilisateurs Traitement thermique faible variant entre 50 C et 60 C Homogénéisation à une pression variant entre100kg/cm et 200Kg/cm Pasteurisation 85 C 30 min 90 à 95 C 5 à 15 mn 120 C à 5 sec Refroidissement du lait a la température d incubation Préparation des souches de yaourt yaourt brassé Yaourt ferme Inoculation des souches de yaourt Incubation du lait inoculé à des température variant entre 40 et 46 C pendant 2 à 6 h Distribution dans des contenants Addition de fruits ou de saveur synthétique Incubation du lait inoculé à des températures variant entre 40 et 46 C pendant 2 à 6 h Refroidissement du lait coagulé à des température variant Entre 20 et 4 C Distribution dans des contenants Addition de fruits ou de saveur Synthétique Refroidissement du lait coagulé à Entreposage a basse température Des température variant entre 20et 4 C Jusqu à Consommation Figure 2 :Procédure de fabrication du yaourt. (Lamoureux 2000)

31 Cependant les modifications peuvent aussi se poursuivre durant l'entreposage: l'intensité des changements étant influencée par la température et la durée. La modification majeure au cours de l'entreposage des yaourts est la post-acidification causée principalement par L. delbrueckii subsp. Bugaricus (Rasic et Kurmann, 1978 ; Rash,1990; Laye et al., 1993). 2.6 La composition chimique du yaourt : Les glucides : La teneur du yaourt en lactose résiduel est de l'ordre de 4,5 g pour 100 g. La dégradation du lactose conduit à la formation de galactose, de glucose et d'acide lactique qui passe d'un niveau pratiquement nul à un niveau de 0,8 à 1 %, dont 50 à 100 % d'acide L+ lactique selon les ferments. Les quantités finales de galactose sont de 1 à 1,5 %. Les concentrations en glucose et oligosaccharides sont très faibles (Toba et al., 1983 ; Vidal- Val verde et al., 1984) Les protéines : Les bactéries lactiques produisent des enzymes qui hydrolysent partiellement les protéines du lait, De ce fait, un yaourt contient plus de peptides et d'acides aminés libres (Rasic et al., 1971) Les lipides : Il existe une hydrolyse très modérée des triglycérides qui n'a pas d'incidence nutritionnelle observable ( Boccignone et al., 1984) Les minéraux : C'est surtout la richesse en calcium du yaourt et des laits fermentés qui est à noter. La poudre de lait ajoutée au lait lors de la fabrication des yaourts augmente en effet la teneur en calcium par rapport au lait d'origine. Un pot de yaourt de 125 g apporte 180 à 200 mg de calcium (Dupin, 1992 ;Melton, et al., 2003 ;Hidvegi et al., 2003).

32 2.6.5 Les vitamines : La composition des vitamines du yaourt dépend principalement de celle du lait utilisé. De plus, elle sera modulée au cours de la fermentation, dépendant aussi des souches employées. La composition en vitamines liposolubles A et D varie en fonction de leur teneur dans le lait utilisé (entier ou partiellement écrémé) (Dupin, 1992). 2.7 Apports nutritionnels du yaourt : Les apports nutritionnels du yaourt dépendent de sa composition chimique, du lait utilisé et de procédure de production par exemple un traitement thermique du yaourt à 70 C pendant 10 minutes entraîne des diminutions importantes des teneurs en vitamines du groupe B et en enzymes (De Felip et al.,1977 ; Syndifrais, 1997 ). Les différents apports nutritionnels sont démontrés dans le tableau 2 Tableau 2 : Apports des différents yaourts pour un pot de 125 g (Syndifrais, 1997) Yaourt nature lait partiel (écrémé) Yaourt nature maigre (lait écrémé) Yaourt Nature Au lait entier Yaourt Maigre aux fruits Yaourt lait partiel (écrémé et aux fruits) Yaourt Lait entier et aux fruits Yaourt aromatisé Partiel écrémé sucré Protides g Lipides g Glucides g Calcium mg Kilocalories Kilojoules

33 2.8.Les effets bénéfiques du yaourt : Le yaourt a une valeur nutritive similaire au lait puisqu'il contient une quantité importante de protéines, de calcium, de potassium et de phosphore, et ce, en ne fournissant que peu de calories. De plus, le yaourt est une source importante de vitamines A, BI et 82, mais son contenu aurait tendance à diminuer au cours de l'entreposage du produit (Deeth et Tamime, 1981). De plus, le transit intestinal du yaourt est deux fois plus long que celui du lait, ce qui améliore l'absorption des nutriments. Ce produit se différencie du lait par le fait qu'il est plus facile à digérer, tant au niveau de son contenu protéique qu'au niveau de son contenu en carbohydrates (Deeth et Tamime ). La propriété bénéfique la plus reconnue dans les yaourts est celle de permettre aux personnes intolérantes au lactose de digérer un produit laitier. Les lactases des bactéries du yaourt hydrolysent de 20% à 30% du lactose contenu dans le produit et continuent leur action au niveau de l'intestin. Cette propriété réduirait les inconforts associés à une mauvaise digestion du lactose (Pulusani et al., 1979 ; Deeth et Tamime, 1981 ; Piquet et al., 2007 ). D'autres effets thérapeutiques ont été associés à l'absorption de yaourt, plusieurs études ont évalué l'impact bénéfique de la consommation de yaourt sur les désordres gastro-intestinaux (Deeth et Tamime, 1981 ;Labell,1989). 1l a aussi été rapporté que les bactéries du yaourt auraient des effets antibactériens contre des microorganismes pathogènes. Ces effets seraient associés à la production de bactériocines et d'acides lactiques (Pulusani et al., 1979 ; Deeth et Tamime, 1981 ; Piquet et al., 2007 ). Van de Water et al, (1999) ont démontré que la consommation journalière de lait fermenté pouvait moduler le système immunitaire. En effet, la consommation journalière de 200g de yogourt a permis de diminuer les symptômes associés à des allergies nasales.

34 La composition chimique et nutritionnels du yaourt apporte des effets bénifique sur les malades cardiovasculaires (Olga et al., 2007). L'addition d'agents probiotiques, prébiotiques ou synbiotiques permet d'améliorer les valeurs nutritives et thérapeutiques des yaourts. Comparativement à un yaourt traditionnel, le yaourt «Actimel Cholesterol Control» aurait un effet hypocholesterolémique qui serait entièrement associé à son contenu en L. acidophilus et en fructo-oligosaccharides (Schaafsma et al., 1998 ; Roberfroid 2000 ; Simons et al., 2006 ; Fava 2006 ; Piquet et al., 2007). Malgré le fait que la majorité des effets bénéfiques soient associés aux agents probiotiques et prébiotiques, on utilise toujours les souches de yaourt dans les laits fermentés. Commercialement, il est difficile de fermenter le lait en utilisant qu'un microorganisme probiotique puisque le temps requis pour abaisser le ph serait trop long et de plus, certaines souches probiotiques donnent des goûts douteux aux produits. Ainsi, les bactéries du yaourt permettent de diminuer le temps de fermentation, d'améliorer le goût, la texture et la consistance du produit (Lamoureux, 2000).

35 II- BACTERIES LACTIQUES ET BIFIDOBACTERIES 1. Les bactéries lactiques 1.1 Définition : Les bactéries lactiques sont définies comme des cellules vivantes, procaryotes, hétérotrophes et chimio-organotrophes (requièrent des molécules organiques complexes comme source d énergétique) (De Roissart, 1986). 1.2 Principales caractéristiques : Les bactéries lactiques sont un groupe de bacilles ou coccobacilles à Gram positif qui ont moins de 55mol% de contenu G+C dans leur ADN. Elles sont asporulées, généralement non mobiles, anaérobies mais aérotolérantes, ne possèdent ni nitrate-réductase, ni cytochrome-oxydase. En outre, elles ne liquéfient pas la gélatine, ne produisent pas d indole ni d hydrogène sulfureux et seulement quelques espèces hydrolysent faiblement la caséine. Elles ont des exigences nutritionnelles complexes en ce qui concerne les acides aminés, les peptides, les vitamines, les sels, les acides gras et les glucides fermentescibles ( Dellaglio et al.,1994 ; Gonzàlez et al., 2000). 1.3 Taxonomie et classification : Les bactéries lactiques sont un groupe de bactéries unies par une constellation de caractéristiques morphologiques, métaboliques, et physiologiques. Elles appartiennent à la lignée des Firmicutes, à la classe des Bacilli, et à l ordre des Lactobacillales (Garrity et Holt, 2001). Phylogénétiquement, elles appartiennent au phylum des clostridium des bactéries Gram positif (G+C < 50mol%).

36 Selon Stiles et Holzapfel (1997) et Axelsson (1998), les bacteries lactiques englobent les genres suivants : Aerococcus, Alloicoccus, Carnobacterium, Dolosigranulum,, Enterococcus, Globicatella, Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenecoccus, Vagococcus et Weissella. Néomoins c est surtout Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Weissella et a grande échelle Lactobacillus, qui ont une certaine importance dans les aliments (Vandamme et al., 1996). On outre il est a signaler que le nombre d espèces lactiques d origine alimentaire ne cesse d augmenter. 2 nouvelles espèces lactiques ont été isolées d un milieu viande il s agit de Lactobacillus versmoodensis (Krockel et al., 2003) et Vagococcus carniphilus (Shewmaker et al., 2004). 1.4 Bactéries lactiques et produit alimentaires fermentés : La plupart des aliments fermentés font intervenir des bactéries lactiques soit en tant qu agent principal de la fermentation, soit en tant qu agent secondaire, ces produits sont principalement les produits laitiers fermentées ( laits fermentés, yaourt, fromages, beurre et crème), les produits carnés, Vinification et cidrerie et les produits végétaux. (Pilet et al., 1998) Les bactéries lactiques dans les produits laitiers : Il s agit du domaine d application le plus courant des fermentations lactiques, du fait de la contamination fréquente de bactéries lactiques dans le lait et de leur capacité à utiliser le lactose. Les ferments lactiques naturels ou commerciaux interviennent dans l élaboration de tous les produits laitiers fermentés (Tableau 3 ) (Pilet et al., 1998).

37 Tableau 3 : Principales bactéries lactiques associées aux produits laitiers fermentés et leurs rôles (Pilet et al., 1998) Laits Fermentés Yaourt enrichis en bactéries Kéfir, Koumiss lait ribot, buttermilk Lb. delbrueckii subsp. Bulgaricus, St. Thermophilus Acidification / texture / arômes (acétaldéhyde) idem yaourt + Lb. acidophilus, Bifidobacterium *ou Lb. casei rôle nutritionnel Lb. brevis, Leuconostoc, Lc. lactis Acidification / texture / arômes Lactococcus, Leuconostoc texture / arômes Beurre et Fromages crème Frais ou A pâte molle à pâte persillée à pâte pressée à pâte pressé cuite (gruyère, emmenthal) Lc. Lactis bv. diacetylactis arôme (diacétyle) Lc. Lactis subsp. Cremoris, lactis, diacetylactis Acidification : formation du caillé Leuconostoc Formation d ouvertures facilitant la croissance de penicillium Lactobacillus, Lactococcus Arômes au cours de la maturation St. Thermophilus, Lb. helveticus, Lb.delbruckii subsp. Lactis Acidification: production d acide lactique utilise par les bactéries propioniques /protéolyse

38 2.LES BIFIDOBACTERIES : 2.1 Définition : Les bifidobactéries ont été découvertes, par Tissier Ont été isolées à partir de selles d'enfants nourris au lait maternel. Tissier avait alors décrit ces organismes comme des bactéries anaérobies, Gram positif en forme de bâtonnet. Ces bactéries avaient alors reçu le nom de Bacillus bifidus cornmunis. Au même moment, en Italie, Moro découvrait des bactéries semblables qu'il a identifiées comme des Lactobacillus (Ballongue, 1993) Ecologique des bifidobactéries : Les bifidobactéries font partie de la flore prédominante de l'intestin chez les humains et les animaux à tous les stades de vie. La composition de la flore dominante chez l'humain change au cours des différents stades de vie. Chez un jeune enfant nourri au lait maternel, la flore intestinale est composée de % de bifidobactéries et les principales espèces retrouvées sont Bifidobacterium infants et B. bifidum. Les entérocoques, les coliformes et les lactobacilles représentent environ 1-15% de la flore fécale alors que les bactéroïdes et les clostridies sont absents (Rasic et Kurmann, 1983) figure 3. Le lait maternel contient des facteurs, tels que des oligosaccharides comme le galactose et le N-acetyglucosamine, qui stimulent la croissance des bifidobactéries (Bezkorovainy et Miller-Catchpole, 1989). L'absence de ces facteurs dans les préparations de laits pourrait expliquer la différence observée entre les flores des enfants nourris au lait maternel et ceux nourris au lait de vache (Tamime et al., 1995).

39 Figure 3 : Schéma simplifié décrivant les compartiments de l appareil digestif de l homme et leurs microflores (Ouwehand & Vesterlund,2003).

40 La flore des enfants sevrés représente une transition entre la flore infantile et la flore adulte. Plusieurs espèces telles que les bactéroïdes, les eubactéries, les fusobactéries et les clostridies apparaissent dans la flore fécale. Les bifidobactéries deviennent moins prédominantes (Rasic et Kurmann, 1983). La flore adulte devient plus complexe et la flore dominante est composée de bactéroïdes. Bien que les bifidobactéries ne soient plus prédominantes, elles demeurent un des groupes les plus importants de la flore intestinale. Les espèces de bifidobactéries les plus retrouvées chez l'adulte sont Bifdobacterium adolescentis et B. longum (Tamime et al., 1995). Certains autres facteurs tels que l'origine ethnique de l'homme, des troubles intestinaux et le type d'alimentation expliquent la différence de composition de la flore intestinale observée entre individus. 2.3 Taxonomie et les différents espèces : Pendant plusieurs années, les bifidobactéries ont été classées parmi les bactéries du genre Lactobacillus. C'est d'ailleurs sous ce nom que sont retrouvées les bifidobacténes dans les quatre premières éditions du manuel Bergey 's Manual of Determinative Bacteriology. Après 1965, suite à I'apparition des nouvelles technologies génétiques, deux équipes de recherche (Sebald et al., 1965 ; Werner et al., 1966) ont démontré, grâce au pourcentage G+C, que les bifidobactéries étaient différentes des lactobacilles, des corynébactéries ainsi que des propionibactéries.

41 Ces équipes ont démontré que le pourcentage de G+C était de 60.1% pour les bifidobactéries alors qu'il était de 67.6% pour les propionibactéries, de 54.7% pour les corynébactéries et se situait entre 33 et 49% pour les 1actobacilleses (Sebald et al., 1965; Werner et al., 1966). À partir de 1974, le genre Bifidobacterium a été reconnu par les éditeurs du manuel Bergey's Manual of Deteminative Bacteriology et à ce moment là, le genre Bifidobacterium était composé de 11 espèces. Selon Crociani et al (1996)les bifidobactéries sont répertoriées de 32 espèces, 12 seraient d'origine humaine, 3 proviendraient de l'abeille, 14 seraient d'origine animale à sang chaud et 2 proviendraient des eaux usés. On outre les espèces de bifidobactéries ne cesse d augmenter, l équipe de Crociani et al (1996)) ont pu isolé une nouvelle éspèce Bifidobacterium Iactis à partir des produits laitiers. Selon Euzéby (2007), le nombre d'espèces citées est de 35 et le nombre de sous-espèces est de 6. Et selon, il y aurait 32 espèces et 9 sous-espèces, Bifidobacterium denticolens et Bifidobacterium inopinatum, isolés de caries dentaires chez l'homme, ne sont plus considérés comme des espèces du genre Bifidobacterium. Bifidobacterium denticolens a été transféré dans le genre Parascardovia et l'espèce Bifidobacterium inopinatum dans le genre Scardovia. Les différentes espèces de bifidobacterium et leur origines selon Vanden broek et al., (2005) sont mentionnées au tableau 4.

42 Tableau 4 : Les différentes espèces de bifidobacterium et leur origines (Vanden broek et al., 2005) Espèce Source et Reference B. adolescentis Selles des adultes et caries dentaire Reuter (1963) B. angulatum Selles des adultes Scardovi and Crociani (1974) B. animalis Selles des rats, poulet, lapins Scardovi and Trovatelli (1974) B. asteroides Les abeilles Scardovi and Trovatelli (1969) B. bifidum Selles des adultes et des enfants Orla-Jensen (1924) B. boum Selles des porc Scardovi et al. (1979) B. breve Selles des enfants Reuter (1963) B. catenulatum Selles des enfants et adultes Scardovi and Crociani (1974) B. choerinum Selles des porc Scardovi et al. (1979) B. coryneforme Les abeilles Biavati et al. (1982) B. cuniculi Selles des lapins Scardovi et al. (1979) B. denticolens Caries dentaires humaines Crociani et al. (1996) B. dentium Caries dentaire humaines, selles des adultes Scardovi and Crociani (1974) B. gallicum Selles des adultes Lauer (1990) B. gallinarium Selles des Poulets Watabe et al. (1983) B. infantis Selles des enfants Reuter (1963) B. inopinatum Caries dentaire humaine Crociani et al. (1996) B. lactis Lait fermenté Meile et al. (1997) B. longum Selles des enfants et des adultes Reuter (1963) B. magnum Selles des lapins Scardovi and Zani (1974) B. merycicum eaux usées Biavati and Mattarelli (1991)

43 B. pseudolongum subsp.globosum B. pseudolongum subsp pseudolongum Selles des rat, Mitsuoka (1969); Selles des bovins, ovins, eaux usées Biaviti et al., 1982 Yaeshima et al. (1992) B. psychraerophilum caecum de porc Simpson et al. (2004) B. pullorum Selles des poulet Trovatelli et al. (1974) B. ruminantium Selles des bovins Biavati and Mattarelli (1991) B. saeculare Selles des lapins Biavati et al. (1991) B. scardovii Selles des adultes Hoyles et al. (2002) B. subtile Eaux usées Biavati et al. (1982) B. suis Selles des porc Matteuzzi et al. (1971) B. thermacidophilum Selles de porc Dong et al. (2000) B. thermacidophilum ssp B. thermophilum Selles de porc et poulet Mitsuoka (1969) 2.4.Caractéristiques morphologiques,physiologiques et biochimiques des bifidobactéries : Morphologie : Les bifidobactéries sont des bactéries non mobiles et non-sporulantes. sont Gram-positif. Elles sont souvent retrouvées sous forme de Y ou V. Leurs extrémités sont effilées, bifurqués ou spatulées elles peuvent se présenter aussi sous forme de cocoides ou sous formes de petites bacilles réguliers ( Rasic et Kurmann, 1983 ; Scardovi, 1986 ; gavini et al., 1990). Les cellules de certaines espèces peuvent présenter des structures semblables à des membranes enroulées en hélice ou en cercle se répartissant dans le cytoplasme et qui peuvent être colorés au bleu de méthylène.

44 Les colonies des bifidobactéries sont d apparence très variable, selon les souches elles formes des colonies lissent, muqueuses de contours réguliers. ( Scardovi, 1986) Physiologies des bifidobacteries : Température : Les espèces de bifidobactéries d origine humaine montre une croissance à une température varie entre 36 et 38ºC par contre les espèces d origine animales peuvent se croître a des température plus élevée qui varie entre 41º et 43 C (Scardovi, 1986 ; Martin et chou, 1992). L espèce B.thermacidophilum pousse a une température plus élevée égale 49.5ºC (Dong et al., 2000). Au dessous de 20ºC la croissance des bifidobactéries n est plus détectable avec l exception de B.psychroaerophilum qui a une faible croissance a 8ºC (Simpson et al., 2003) L Oxygène : Les bifidobactéries sont des microorganismes anaérobies strictes (Scardovi 1984), mais la sensibilité à l oxygène varie entre les espèces (De Vries et Stouthamer 1967). Les espèces qui tolèrent l oxygène ( ex : B. lactis, B. aerophilum et B. psychroaerophilum) présentent une faible activité catalytique qui élimine les traces du super oxyde d hydrogène formées (H 2 O 2 ) ou par le fait que le NADH oxydase de ces souches ne forme pas de H 2 O 2, alors l accumulation d H 2 O 2 inhibe l activité de F6PPK.

45 Pour les souches extrêmement sensibles à l oxygène, n accumulent pas l H 2 O 2 et l oxygène bloque la multiplication bactérienne par l intermédiaire d un potentiel d oxydoréduction trop élevé (Scardovi, 1986 ; Romond et al., 1992 ; Shimamura et al., 1992, Ventura et al., 2004) Le ph : Les bifidobactéries sont considérées comme des microorganismes acidophiles, mais elles ne supportent pas les ph trop bas > 4 et les ph basiques < 9 (Biaviti et al., 1992). A l exception l espèce B.animalis supp lactis résiste à un ph =3.7 (Meile et al., 1997). La production maximale d acide lactique et acétique chez les bifidobactéries exige un ph optimal initial proche de la neutralité qui varie entre 6-7(Collins et Hall, 1984 ; Scardovi, 1986) la sensibilité aux antibiotiques : Les bifidobacteries sont généralement sensible aux antibiotiques du spectre Gram positif( macrolides, bacitracine, erythromcine, lincomicine, novobicine et vancomicine ) aussi aux beta-lactamine( penicilline, ampicicilline, amoxicilline, piperacilline et ticarcilline) ( Delagdo et al.,2005 ; Moubarek et al., 2005 ; Zhou et al., 2005 ; Masco et al., 2006 ; Ammor et al., 2007). La sensibilité des bifidobacteries au tetracycline est variables selon les éspèces ( Delagdo et al.,2005; Masco et al., 2006 ; Ammor et al., 2007). Beaucoup d espèces des bifidobactrie sont résistante aux antibiotiques du spectre Gram négatif (acide fusidique, acide nalidixique et polymixine) et les aminoglycosides (neomycine, gentamicine, kanamicine et streptomicine) ( Charteris et al., 1998 ; Delagdo et al.,2005; Moubarek et al., 2005 ; Zhou et al., 2005 ; Masco et al., 2006 ; Ammor et al., 2007).

46 Les besoins nutritionnels des bifidobacteries : En générale les bifidobactéries sont capables d utiliser les sels d ammonium comme seul source d azote par contre d autres éspèces comme B.magnum, B. cuniculi et B. choerinum exigent la présence d azote organique (Hassinen et al., 1951). L activité des enzymes comme le glutamate dehydrogénase et le glutamine synthétase permet l assimilation d ammonium. Ces deux enzymes sont isolés et caractérisé a partir de B.breve, B. pseudolongum et B.bifidum (Ballongue,1993). Aussi la croissance des bifidobactéries est stimulées par la présence d ions, vitamines et par d autres facteurs qui sont métabolisés par l hôte ou par les microorganismes du tractus gastro-intestinale comme la thréonine, extrait de levure, cystéine, dextrine, maltose et β-glycerophosphate et les facteurs bifidogènes qui sont des substances qui se trouve dans le laits maternel ces facteurs incluent N- acetyl glycosamine, fructooligosaccharides, lactoferine, lactulose, lactitol, oligoholosides et les polyholosides (Modler et al., 1994) Biochimie des bifidobacteries : Le Métabolisme : La majorité des bifidobactéries utilisent le lactose, le glucose, le galactose, le sucrose et le fructose comme sources de carbone. L'ammoniac est la seule source d'azote utilisée par la majorité des espèces de bifidobactéries Contrairement aux autres bactéries lactiques qui dégradent le glucose via le système glycolytique ou encore par la voie des hexoses monophosphates, les bifidobactéries dégradent le glucose par la voie du fhctose-6-phosphate. La dégradation du glucose par cette voie est rendue possible grâce à l'enzyme fructose-6-phosphate phosphocétolase, qui est particulière aux bifidobactéries et

47 qui scinde le fructose-6-phosphate en acétylphosphate et en érythrose-4- phosphate (Rasic et Kurmann, 1983). Une étude faite sur 22 souches de bifidobactéries d'origine humaine a démontré que toutes les souches testées possédaient les activités α et β galactosidases et une activité α-glucosidase (Desjardins et al., 1990). La voie métabolique du fructose-6-phosphate phosphocétolase produit de l'acide lactique et de l'acide acétique comme métabolites primaires en proportion de 2/ 3 figure 4 (Scardovi et Trovatelli.,1965 ; DeVries et al., 1967). Fig.4 la voie du fructose 6-phosphate ou bifid(us) shunt (Scardovi et Trovatelli.,1965 ; De Vries et al.,1967).

48 Toutefois, certaines souches de bifidobactéries vont produire plus d'acide acétique et moins d'acide lactique. Le surplus d'acide acétique formé provient d'une autre voie métabolique des bifidobactéries qui convertit le pyruvate en acide formique et en acétate plutôt qu'en acide lactique. Par la suite, une partie de l'acide acétique est transformé en éthanol (De Vries et Stouthamer, 1968; Lauer et KandIer,1976) Métabolisme des vitamines : Les bifidobactéries sont capables de produire des vitamines tels que thiamine (B1), l acide folique (B9) et l acide nicotinique (Tamura 1983 ; Deguchi et al., 1985). Les espèces B.breve et B.infantis excrète un taux trop élevé de l acide nicotinique et le biotine, de même B.bifidum et B.infantis possèdent une bonne production des vitamines B1 et B9 ( Tamura,1983) Production des substances antimicrobiennes : Malgré la grande utilisation des bifidobactérie dans la production des aliments fonctionnels les études sur son pouvoir antimicrobien est un peu restreint (Ventura et al.,2004). Chartensis et al.,(1998) ont testé la sensibilité de 16 souche de bifidobactéries aux antibiotique la plupart montraient une résistance aux cefoxitine, aztreoname, kanamycine, amikacine, gentamicine, acide fusidique, polymyxine B et une sensibilité aux penecilline, chloramphenicole, eythromycin, bacitracine et rifampicine. L activité antimicrobienne du genre Bifidobacterium a été détectée en premier lieu par tissier (1900), il a pu dériver plusieurs types des effets antagonistes de B.bifidum contre E.coli.

49 Récemment d autres études décrive l activité antagoniste ou l activité antimicrobienne spécifique des bifidobacteries liées a la production des acides lactique et acétique ou a la production des bactériocines (Gibson et Wang 1994 ; Yildirim et johnson 1998 ; Yildirim et al.1999 ; Abd El-Salam et al., 2004 ; Bevilacqua et al., 2003 ; Cheikhyoussef et al., 2007 ; Cheikhyoussef et al., 2008) Les bifidobactéries en tant qu'agents aromatisants : Certaines études ont mis en évidence le rôle des bifidobactéries en tant qu'agents aromatisants. Dés 1968, l'équipe de Schuler-Malyoth et al., avait déterminé que les produits laitiers contenants des bifidobactéries avaient un goût et un arôme typiques qui étaient distincts des saveurs habituellement produites par les bactéries lactiques. Depuis cette étude, grâce aux développements des technologies permettant d'identifier et de quantifier les composés volatils, certaines études ont été faites afin de déterminer quels composés aromatiques, résultant du métabolisme des bifidobactéries, étaient responsables du goût particulier des produits faits avec celles-ci. (Lamoureux, 2000). Ainsi, Yuguchi et al., (1989), ont évalué la capacité, de cinq souches de Bifidobacteriun, de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ou de Streptococcus thermophilus, en monoculture ou en culture mixte, à produire des composés volatils. IL a été constaté que les espèces Bifidobacterium Iongum, B. bifidum et B. breve produisaient de petites quantités de composés aromatique tel l'acétaldéhyde, le diacétyle, le 2-butanone et le sulfure de diméthyle.

50 2.5. L utilisation des bifidobactéries dans les produits laitiers : Bien que les bifidobactéries fassent déjà partie de la flore intestinale indigène chez l'humain, un apport quotidien de bifidobactéries peut être nécessaire pour stimuler ou suppléer la population déjà existante. L'ingestion de bifidobactéries permet aussi de remplacer la flore qui est détruite par des infections ou encore par la prise d'antibiotiques (Piquet et al., 2007). L'incorporation des bifidobactéries s'est faite pour la première fois par Mayer, en 1948 en Allemagne. Bifidobacterim bifidum a été incorporé à de la nourriture pour bébé qui était prescrite à des enfants ayant des carences nutritionnelles. Par la suite, en 1968, l'équipe de Schuler-Malyoth a démontré que les bifidobactéries pouvaient être cultivées dans les produits laitiers (Rasic et Kurman, 1983). Aujourd'hui, plus de 100 types de produits contenant des bifidobactéries sont retrouvés sur le marché à travers le monde mais plus particulièrement au Japon et en Europe (Hugues et Hoover, 1991 ; Fuller, 1992 ; Tharmaraj, 2003 ). Tableau 5. Tableau 5 : Quelques produit laitiers commercialisés contiennent de Bifidobacterium spp dans different pays (Lourens-Hattingh and Viljoen 2001) produit pays culture Acidophilus bifidus yogurt LC 1 Bifidus yaourt Allemagne Australie Plusieurs pays A + B + yaourt culture L. acidophilus +C +B+ yogurt culture B. longum + yogurt culture Bifighurt Allemagne B. bifidum or B. longum + yogurt culture Biobest Allemagne B. longum + S. thermophilus

51 Yoplus Australie B. bifidum or B. longum + yogurt culture Bioghurt Allemagne A + B + C + yogurt culture Philus Suède A + B + S. thermophilus BA live Grande Bretagne A + B + yogurt culture Vaalia Australie Lactobacillus +B+ yogurt culture Kyr Italy Italie A + B + yogurt culture Ofilus France A + B + S. thermophilus Biodynamic yogurt Australie A + B + C + yogurt culture BIO France A + B + yogurt culture Biogarde Allemagne A + B + S. thermophilus Mil-Mil Japon A + B + yogurt culture Cultura Danemark A + B + yogurt culture AKTIFIT plus Suisse A + B + L. casei + S. thermophilus Ski-Divine Australie A + B + yogurt culture ZabAdy Egypte B. bifidum + yogurt culture A = L. acidophilus; B = Bifidobacterium spp.; C = L. casei. En Algérie quatre fabricants réclame la présence de Bifidobacterium spp dans leur produit commercialisé sur le marché : Danone Djurjura bioactivia, Soummam Acti+, Trèfle probiotic et Djugurta biofide.

52 2.5.1 La viabilité des bifidobacteries dans les produits laitiers : Pour que l'apport de bifidobactéries soit efficace, certaines conditions doivent être observées. En premier lieu, la consommation de produits contenant des bifidobactéries doit se faire sur une base régulière et ceux-ci doivent contenir un minimum de 10 6 UFC/g de produit au moment de la consommation. Les espèces de bifidobactéries utilisées doivent survivre au passage de la barrière gastrique (Tamime et al., 1995). De plus, la survie des bifidobactéries dans les produits laitiers doit être assurée jusqu'à la consommation du produit par le consommateur. Ainsi, la viabilité des bifidobactéries dépend de plusieurs facteurs parmi lesquels on retrouve le degré d'acidification, l'espèce utilisée, les conditions de fermentations, la température d'entreposage, la post-acidifïcation et les méthodes de conservation (Kneifel et al.,1993). Actuellement, les bifidobacténes sont incorporées aux produits laitiers de deux façons. Les bifidobactéries peuvent être ajoutées aux produits laitiers déjà fermentés ou encore elles peuvent être ajoutés aux bactéries lactiques lors de I'ensemencement (Roy, 2005). Lorsqu'elles sont ajoutées au moment de la fabrication du produit, les bifidobactéries sont utilisées en monoculture ou encore en culture mixte avec des bactéries lactiques (Patel et al., 1991). Les espèces de bifidobactéries les plus utilisées dans le domaine laitier sont Bifidobacterium adolescentis, B. bifidum, B. breve, B. longum, B. animalis, B.lactis et B. infantis ( Roy, 2005).

53 2.6.Milieux sélectifs utilisés pour la détection des bifidobactéries dans les produits laitiers : Les premiers milieux de cultures permettant la numération des bifidobactéries servaient à isoler les bifidobactéries provenant du tractus intestinal ou encore des selles humaines. À la suite de la découverte des propriétés bénéfiques des bifidobactéries, celles-ci ont été incorporées aux produits laitiers. On retrouve sur le marché plusieurs produits dont la survie des microorganismes est quelquefois à mettre en doute puisque le suivi de la viabilité des probiotiques a souvent été négligé. Un produit peut être considéré de qualité lorsque le fabricant est capable de déterminer la viabilité des souches et la nature de ces dernières. II a été difficile de mettre au point des milieux sélectifs pour les bifidobactéries puisqu'elles ont des exigences nutritionnelles élevées et réclament des conditions de croissance anaérobie.(lamoureux, 2000). Depuis quelques années, des progrès importants ont été faits pour mettre au point des milieux afin d'isoler et de différencier les bifidobactéries. Selon Shah (1997), les conditions anaérobies sont essentielles pour l'isolation et l'énumération des bifidobactéries. Aussi suggère d'incuber les bifidobactéries sous atmosphères modifiées et composées de 10% CO2 et 90% N2 à 37OC pendant 48 heures. De plus, selon ce même auteur, il est préférable de réduire le potentiel rédox des milieux de culture en utilisant des nutriments tels que la cystéine, la cystine, les sels métalliques, l'acide ascorbique et le sulfate de sodium (Shah, 1997).

54 Les différents milieux sélectifs qui ont été développés au cours des années sont basés sur la résistance des bifidobactéries à des agents antibiotiques et bactériostatiques, Les bifidobactéries sont résistantes à plusieurs antibiotiques tels que le sulfate de kanamycine, le sulfate de néomycine et le sulfate de paramomycine (Rasic et Kurmann,1983). Scardovi (1986) a aussi rapporté que les bifidobactéries étaient résistantes a la polymixine, la gentamycine, et à la streptomycine. Certains agents bactériostatiques tels que le chiorure de lithium, I'acide nalixidique, le propionate de sodium, l'azide de sodium et l'acide ascorbique peuvent aussi être utilisés car ils n'ont pas d'effet sur les bifidobacténes (Rasic et Kurmann, 1983). Les premiers milieux développés, utilisaient l'acide ascorbique et I'azide de sodium (Ballongue, 1993). Matteuzzi et al., (1983) ont développé un milieu contenant 80 µg de kanamycine par millilitre de milieu de culture. Les milieux de culture développés, contiennent souvent un mélange de différents agents sélectifs. Ainsi le milieu NPNL-aga développé par Teraguchi et al., (1978) contient du chlorure de lithium, de l'acide nalidixique, du sulfate de néomycine, du sulfate de paramomycine ainsi que de la néomycine et de la kanamycine. La récupération des bifidobactéries avec ce milieu serait de 90% (Rasic et Sad, 1990). Dans une étude, menée par Rasic et Sad (1990) sur les différents milieux de culture sélectifs les auteurs recommandent l'utilisation du milieu NPNL-agar pour l'isolement des bifidobactéries dans les produits laitiers. Dans une autre étude faite sur les différents milieux de cultures, Shah (1997) conseille l'utilisation des milieux NPNLagar, NPNL-agar modifié, des milieux Rogosa-agar modifié et le milieu de Garches contenant du chlorure de lithium (milieu MGLP agar) ou du chlorure de lithium et de la pénicilline G

55 potassium (MGLP agar) ainsi que les milieux MRS/TPY+ dicloxacilline et MRS + sulfate de néomycine, acide nalixidique et chlorure de lithium, lors de l'isolement des bifidobactéries en présence des bactéries lactiques. L'équipe de Sonoike et al., (1986) a développé un milieu de culture contenant des galacto-oligosaccharides comme source de carbone. Ce milieu permettait la numération de 22 espèces de bifidobactéries alors que les espèces Streptoccocus et Lactobacillus ne pouvaient croître. Wijsrnan et al., (1989) ont eux aussi développé un milieux contenant des galacto-oligosaccharides et une solution de NPNL. Ce milieu a semblé souhaitable pour la numération des bifidobactéries dans les produits laitiers. Dans cette même étude, les galacto-oligosaccharides ont été remplacés par I'arabinose pour la numération de Bifidobacterim lonum et B. adolescentis. L'équipe de Roy et al., (1997) a mis au point un milieu sélectif composé de Columbia Agar Base (CAB). de raffinose, de chlorure de lithium, de propionate de sodium et le ph est ajusté à 5.1 pour suivre la viabilité des bifidobactéries dans un fromage frais. Tabasco et al (2007) ont élaboré un milieu sélectif composé de MRS agar modifier a base de raffinose, de chlorure de lithium qui a permis de dénombrer Bifidobacterium lactis a partir des yaourt. Le ph est aussi utilisé comme moyen sélectif pour empêcher la croissance des bactéries lactiques sur les milieux servant à dénombrer les bifidobactéries. Ainsi, Beerens (1990) a proposé un milieu sélectif dans lequel est ajouté de l'acide propionique et où le ph est ajusté à 5.

56 L équipe de Roy et al., (1998) a élaboré un milieu sélectif composé de Columbia agar a base, de raffinose, de chlorure de lithium, de propionate de sodium et où le ph est ajusté à 5 Le milieu a permis le décompte des bifidobactéries dans un fromage frais contenant des lactocoques Génétique des bifidobactéries : Pourcentage en base cytosine guanine de l ADN : Les bifidobactéries ont un pourcentage en base G+C plus élevé que la plupart des autres espèces bactériennes (Delcenserie et al., 2002). Ce taux est en générale supérieur à 55% par apport aux bases A+T. Les bifidobactéries sont classer en trois groupes : le premier regroupe les riches en G+C dont le pourcentage est de 55-67%, le deuxième regroupe les pauvre en G+C dont le pourcentage est de 45% et les bifidobacteries ayant un pourcentage de G+C intermédiaire 55% (Delcenserie et al., 2002) les plasmides des bifidobactéries : L'intérêt pour les plasmides des bifidobactéries s'est manifesté en 1982, le groupe de Sgorbati a analysé isolats représentant 24 différentes espèces du genre Bifidobacterium pour la présence d'adn plasmidique. Environ 20% des isolats portaient des plasmides. Cependant, ces souches se regroupaient dans seulement 4 espèces : B.longum, B. globosum, B. asteroides et B. indicum. Plusieurs profils plasmidiques ont été établis mais aucun phénotype n'a pu être corrélé avec la présence des plasmides (Sgorbati et al., 1982). Dans une autre étude, un total de 42 souches de B. breve ont été isolées de fèces humaines et la présence de plasmides a été observée chez 40% d'entre eux (Iwata et Morishita, 1989). Cinq profils plasmidiques différents ont été mis en évidence chez cette espèce bactérienne (Iwata et Morishita, 1989).

57 l étude de la séquence d ADN : L étude de la séquence de l ADN est un moyen pour pouvoir identifier une espèce bactérienne, mais aussi pour pouvoir étudier le lien de parenté entre des souches appartenant à une même espèce. En ce qui concerne les bifidobactéries certaines régions du génome ont particulièrement été étudiées (Delcenserie et al., 2002). L étude de la séquence ADN a permet l analyse du gène codant pour l ARN ribosomal 16S est un moyen utile pour identifier des relations phylogéniques entre les espèces (Mangin et al., 1999).

58 III-LES PROBIOTIQUES ET LES PREBIOTIQUES 1. Définition des probiotiques : La notion de '' probiotiques'' a été développée grâce aux travaux de Metchnikoff (1907) qui avait constaté que les paysans bulgares, grands consommateurs de laits fermentés, vivaient très vieux et en bonne santé. Ainsi, Metchnikoff avait proposé l ingestion de bactéries vivantes, particulièrement des bactéries lactiques, pour réduire les désordres intestinaux et améliorer l hygiène digestive, et donc augmenter l espérance de vie (Gournier-Château et al., 1994). Le terme probiotique dérive des deux mots grecs '' pros'' et '' bios'' qui signifient littéralement ''pour la vie''. Ce terme a été introduit pour la première fois par Lilly et Stillwell (1965) pour décrire des substances produites par un microorganisme et stimulant la croissance d autres microorganismes. Depuis, plusieurs définitions ont été données aux probiotiques dépendamment de leurs effets sur la santé et selon la définition adoptée par le groupe de travail mixte formé par l Organisation des Nations Unies (ONU) pour l agriculture et l alimentation et l Organisation Mondiale pour la Santé (OMS) (Report of FAO/WHO, 2002), les probiotiques sont «des microorganismes vivants administrés en quantités adéquates et qui sont bénéfiques pour la santé de l hôte». 2. Définition des prébiotiques : Les prébiotiques sont des substances fermentescibles il s agit souvent de petits sucres comme les fructo- et galacto-oligosaccharides, ou encore des fibres, de l inuline, du lactulose constituant une source d énergie métabolisable par la flore intestinale, ou une partie de celle-ci (idéalement les bactéries de la flore

59 dont on souhaite favoriser la prolifération et/ou l activité) ou encore utilisable par les probiotiques administrés par voie exogène (orale) (Roberfroid,2007). Certains composants de la microflore intestinale, particulièrement les bifidobactéries, sont capables de fermenter des substances essentiellement non digestibles (hydrates de carbone) dans le colon grâce à son pouvoir saccharolytique important (Kaplan et al., 2000). Cette propriété permet d augmenter la croissance ou l activité des microorganismes spécifiques du tractus gastro-intestinal en influençant positivement la santé de l hôte. Les effets bénéfiques générés par ces interactions ont permis le développement du nouveau concept «prébiotiques» (Roberfroid,2007). 3. Définition des symbiotiques : Un symbiotique est un mélange de probiotiques et de prébiotiques qui affecte positivement l hôte en améliorant la survie et l implantation d espèces microbiennes vivantes apportées sous forme de suppléments alimentaires dans le tractus gastro-intestinal, et, par conséquent, la santé et le bien-être de l hôte (Isolauri et al., 2002). Le terme symbiotique évoque la propriété de synergie et est réservé uniquement aux produits contenant les probiotiques et les prébiotiques au même temps. Dans ces produits, les prébiotiques stimulent sélectivement la croissance des probiotiques. Par exemple, un produit contenant l oligofructose et une bifidobactérie probiotique est considéré comme un symbiotique. Cependant, lorsque un Lactobacillus probiotique est associé à l oligofructose, la combinaison ne forme pas un symbiotique (Schrezenmeir & De-Vrese, 2001). Cette différence serait due au fait que les bifidobactéries produisent une grande quantité de ß-fructosidases, enzymes capables de dégrader sélectivement

60 la liaison entre les fructoses présents dans l oligofructose (Schrezenmeir & Vrese, 2001). 4. les propriétés fonctionnelles des Probiotiques : 4.1. Survie des probiotiques dans le tube digestif chez l Homme : Pour pouvoir exercer leur effet biologique, les probiotiques, ingères oralement, doivent atteindre l intestin grêle et le colon vivants et en quantité suffisante. Cela suppose qu ils puissent résister à un certain nombre de barrières physiologiques à la colonisation bactérienne digestive, parmi lesquelles la sécrétion d acide gastrique, les acides biliaires, les peptides antimicrobiens du mucus et ceux secrétés par certaines cellules intestinales (immunoglobulines a sécrétoires, lactoferrine, lysozyme, etc.) ( Dann et Eckmann,2007; Wehkamp et al., 2007). Un des premiers critères de sélection des probiotiques sera donc leur survie dans le tube digestif et leur capacité a coloniser le colon, certes de manière transitoire, mais suffisamment longtemps pour pouvoir y exercer leur action. Ce processus de sélection a été à l origine du développement de méthodes spécifiques d étude de la survie des probiotiques chez l Homme (Flourie et Nancey 2007) Mécanismes d action des probiotiques : Les mécanismes d action des probiotiques sont encore très incomplètement connus. Il est par ailleurs vraisemblable qu ils varient en fonction du (ou des) probiotique utilise, et peut-être de la dose administrée.

61 Les effets des probiotiques résultent essentiellement de leurs interactions avec le contenu digestif d une part, à la fois avec les nutriments présents dans la lumière intestinale et avec les composants de la flore endogène, et avec le contenant d autre part, principalement les cellules épithéliales intestinales et les cellules immunocompétentes (Backhed et al., 2005). 5. Les probiotiques et leurs effets bénéfiques sur la santé : Plusieurs effets bénéfiques sur la santé ont été associés à la consommation des probiotiques : 5.1.Les probiotiques en pathologie digestive : L utilisation des probiotiques en thérapeutique a naturellement concerné en premier lieu les maladies de l appareil digestif, et en particulier les maladies de l intestin grêle et du colon ; les travaux en pathologie digestive ont utilisé soit des «probiotiques-aliments» (c est le cas des produits laitiers fermentes), ou, plus souvent, des «probiotiques-medicaments». Plusieurs études ont montré effets thérapeutique des probiotiques sur les diarrhée aigue infectieuse et diarrhée compliquant l antibiothérapie (De-Vrese et Marteau, 2007) sur les maladies inflammatoires chroniques intestinales (Barnich et al., 2007). Des travaux de plus en plus nombreux suggèrent un intérêt pour les probiotiques dans le traitement de l infection à H. pylori (Goldman et al., 2006 ; Lesbros- Pantoflickova et al., 2007 ; Falagas et al., 2008 ) Probiotiques et immunité : De façon générale, très peu de données sont disponibles concernant les effets des probiotiques sur l activité du système immunitaire in vivo chez l Homme. La plupart des travaux sont expérimentaux, in vitro ou in vivo chez l animal, et suggèrent que certains probiotiques ont la capacité d augmenter ou de moduler la réponse inflammatoire et immunitaire (Matsuzaki et al., 2007).

62 En clinique humaine, quelques études suggèrent que les probiotiques pourraient avoir une place dans la prévention et/ou le traitement de l allergie (Ouwehand,2007). 5.3 Probiotiques et maladies métaboliques : Peu de travaux ont été consacres a l intérêt éventuel des probiotiques en prévention ou dans la prise en charge thérapeutique du diabète, des hyperlipémies ou de l obésité (Piquet et al., 2007). La Figure 5 illustre la diversité des effets bénéfiques sur la santé documentés et rapportés dans la bibliographie. Figure 5 : Les principaux effets bénéfiques attribués aux probiotiques (Mercenier et al., 2002).

63 6. Les principales souches microbiennes à potentiel probiotique : Les souches ou espèces probiotiques sont des composants normaux de la flore intestinale (Dunne et al., 2001). En alimentation humaine, les genres microbiens les plus utilisés comme probiotiques sont Lactobacillus, Bifidobacterium et Streptococcus (Berg, 1998 ). Par contre, en alimentation animale de nombreux genres bactériens et fongiques sont utilisés, comme Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus, Streptococcus, Pediococcus, Enterococcus, Propionibacterium, Saccharomyces, Aspergillus et Torulopsis (Tannock, 1997). En général, les souches probiotiques sont sélectionnées prioritairement pour leurs effets bénéfiques et leur sécurité d utilisation. Le Tableau6 rapporte les microorganismes considérés comme probiotiques( Holzapfel et al., 2001). Tableau 6 : les microorganismes considérés comme probiotiques ( Holzapfel et al., 1998 ; Holzapfel et al., 2001 ) Les éspèces de Lactobacillus L. acidophilus L. amylovorus L. casei L. crispatus L. delbrueckii subsp. Bulgaricus L. gallinarum L. gasseri L. johnsonii L. paracasei L. plantarum L. reuteri L. rhamnosus Les éspeces de Bifidobacterium B. adolescentis B. animalis B. bifidum B. breve B. infantis B. lactis B. longum Autre bactéries lactiques Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Lactococcus lactis4 Leuconstoc mesenteroides Pediococcus acidilactici4 Sporolactobacillus inulinus2 Streptococcus thermophilus4 Autre bacteries non lactiques Bacillus cereus var. toyoi Escherichia coli strain nissle Propionibacterium freudenreichii Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces boulardii

64 7. Effets probiotiques des bifidobactéries : Plusieurs rôles sont attribués à la présence des bifidobactéries. Un des rôles les plus importants des bifidobactéries, est l'adhésion de celles-ci aux cellules épithéliales de l'intestin ce qui permet de créer une niche écologique et ainsi d'empêcher l'invasion de bactéries pathogènes. Certaines études ont été faites sur l'effet de l'administration de comprimés de bifidobactéries à des gens ayant la diarrhée et il a été remarqué que l'ingestion de ces comprimés aidait à diminuer les symptômes. L'équipe de Tojo et al., (1987) avait remarqué que les personnes atteintes d'entérites causées par Campylobacter guérissaient plus vite lorsque des comprimés contenant Bifidobacterium breve leur étaient administrés. Romond et Romond (1989) ont aussi constaté l'effet positif de l'administration d'un lait fermenté avec B. longum sur la disparition d'un rotavirus. Il a aussi été remarqué que les bifidobactéries ont un rôle nutritionel car elles produisent des vitamines du groupe B, des acides aminés tels que la valine, l'alanine, l'acide aspartique et la thréonine (Rasic et Kurxnann, 1983). IL est aussi reconnu que les bifidobactéries ont un effet probiotique qui est imputable à leur métabolisme. Ainsi, il a été reconnu que la présence de bifidobactéries chez l'humain diminuait l'intolérance au lactose puisque les bifidobactéries métabolisent le lactose. De plus, la teneur en lactose des produits laitiers fermentés par des bifidobactéries est moins importante que les produits fermentés sans bifidobactéries ce qui rend ces produits attrayants pour les gens soufrants d'intolérance au lactose. Ainsi, il a été remarqué par Blanchette et al., (1996) que la teneur en lactose d'un fromage fait avec B.infanti.s était 40% moins importante que pour le fromage sans bifidobactéries, après une journée d'entreposage.

65 Le même phénomène a été observé par l'équipe de Roy et al., (1997) dans le cas de yaourts contenants des bifidobactéries et ceux sans bifidobactéries. La présence des bifidobactéries permet aussi de réduire le niveau de cholestérol sérique. Les bifidobactéries aident a la déconjugation des acides biliaires, la réduction des nitrosamides et I'inhibition de la réduction des nitrates (Nagengast et al., 1988 ; Roberfroid, 2000). Plusieurs études ont aussi noté que les bifidobactéries pouvaient avoir un effet anticancérigène. Ainsi, certains auteurs ont suggéré que le risque du cancer pouvait être réduit en abaissant le ph de l'intestin car cet abaissement empêcherait la colonisation de l'intestin par les bactéries putréfiantes et aurait pour conséquence la réduction de composés potentiellement carcinogènes tels que les produits phénolés (Modler et al., 1990). Or, comme les bifidobactéries produisent de l'acide acétique et de I'acide lactique, il y a un abaissement du ph intestinal (Modler et al., 1990).

66

67 Matériels et méthodes 1. Echantillons : La source dans notre étude été un yaourt fabriqué et commercialisé en Algérie a base de Bifidobactéries plus les bactéries classiques d un yaourt Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus. Les prélèvements sont faites au hasard à partir du produit commercialisé, transporté à la condition de froid jusqu'à laboratoire. Les deux marques étudier : Danone Bioactivia aromatisé et au préparation de fruit fraise Soummam acti + et acti + a base de fruit fraise. 2. Milieux de cultures utilisées dans notre étude : 2.1. Milieux de cultures pour isoler les bifidobactéries : On a utilisé le MRS+0.05% cys Hcl (MRS ;De man et al., 1960) MRS- Raffinose modifier ( Tabasco et al., 2007) 2.2. Milieux de culture pour les bactéries lactiques : M17 (Tersaghi et sandine., 1975) pour Streptococcus thermophilus MRS (MRS ;De man et al., 1960)acidifié pour Lactobacillus bulgaricus 2.3. Milieu lait : On a utilise milieu lait (lait écrémé) UHT candia silhouette et lait écrémé préparé au laboratoire pour déterminer l activités biotechnologiques des souches.

68 3. Isolement des bifidobactéries : A partir de chaque échantillons on a pris 1 ml de yaourt, et nous avons réalisé des dilutions décimales dans la solution Ringer ¼ % cys Hcl pour 1 litre. 100 µl des dilutions 10ˉ4, 10ˉ5, 10ˉ6 sont ensemencés sur milieu MRS- Raffinose,3 boites pour chaque dilution. L incubation est faites dans une jarre a 37ºC pendant 72h en utilisant le système anaerocult + bougie pour créer l anaérobiose. figure Purification des souches : A partir des colonies obtenues des purifications sont faites sur milieu MRS cys et sur milieu MRS raffinose modifié 3.2. Pré-identification des souches : A partir des boites nous avons effectué les test suivant : 3.2.1Coloration de Gram : On prépare un frottis fixés à partir des colonies, on ajoute quelques gouttes de violet de gentiane et on laisse agir pendant 1 minute après on le jette et on recouvert la lame avec Lugol pendant 30secondes. On décolore avec l alcool 90, puis on ajoute quelques gouttes de Fuschine pour 1 minute.la lame est lavée à l eau distillée. (Marchal et al., 1991) Recherche de catalase : Sur une lame on dépose une goutte d eau oxygénée à 10 volumes puis on ajoute un peu de culture prélevé des boites, une résultat est considérés positifs par un dégagement de bulles gazeuses. (Marchal et al., 1991)

69

70 3.2.3 Recherche de l oxydase : Sur une lame on dépose un disque d oxydase et un goutte d eau distillé, un peu de culture est prélevé et déposer sur le disque. Résultat positif se manifeste par une coloration rose violette. (Marchal et al., 1991) L antibiogramme : la sensibilité et la résistance des souches de bifidobacteries a été réalisé par la technique de diffusion sur milieu MRS cys solide en utilisant des disques des antibiotiques suivants : acide nalidixique, ampicilline, Amoxicilline, Gentamicine, chloramphénicol, Pénicilline, néomycine, Erythromycine, Paramomycine, rifampicine, Sulphamethoxazole, vancomycine. Les boites sont incubées en anaérobiose à 37 C pendant 48h. La lecture s effectue par la mesure de la zone d inhibition Caractérisation des éspèces : Protocole d identification classique des Bifidobacteries : (Beerens, 1990, Crociani et al., 1996) le milieu utilisé été MRScys Croissance en anaérobiose : Ensemencement en surface de Bifidobacteries sur boite pétri coulées en MRScys gélosé incubation en anaérobiose à 37ºC /48h (Beerens, 1990, Crociani et al., 1996) Production de gaz à partir du glucose : Les Bifidobactéries ont été ensemencées dans le bouillon MRSc contenant la cloche de Durham recouvert d une couche d huile de vaseline et incubé en anaérobiose à 37ºC/48h (Beerens, 1990, Crociani et al., 1996) Production d indole :

71 Une colonies d une culture de Bifidobactéries est inoculé dans un tube d eau peptonée exempte d indole additionnée d huile de vaseline et incubé en anaérobiose à 37ºC/48h. la recherche d indole à été effectué à l aide du réactif Kovacs (Beerens, 1990, Crociani et al., 1996) Production d une gélatinase : Des tubes de gélatine nutritive sont ensemencés par piqûres centrales puis recouvertes d huile de vaseline. L incubation est effectué à 37 C/48h la lecture se fait par la diffusion d un pigment noir ou non (Beerens, 1990, Crociani et al., 1996) Test de fermentation des sucres : Un tube de 10 ml de milieu MRSc a été ensemencé avec une colonie de bifidobactérie et incubé en anaérobiose à 37ºC/48h. on a procédé une centrifugation 3000g/15 mn. Le culot une fois récupéré est rincé 3 fois à l eau physiologique puis une suspension épaisse est réalisée avec 20 gouttes d eau physiologiques (Collins et Hall 1984). Le milieu MRSc sans sucre additionné d indicateur de ph pourpre de Bromocrésol à raison de % et auquel on ajoute les sucres testés à une concentration finale de 2% puis le milieu est ensemencées avec 1% de la suspension bactérienne. Les cultures sont incubées en anaérobiose en présence d huile de vaseline stérile à 37 C/48h. figure 7. La fermentation d un sucre donné par la souche bactérienne testée se traduit par la formation d acide qui se manifeste par le virage de la coloration rouge en jaune.

72 3.3.6 Coagulation du lait écrémé stérile cystéiné : 1 ml de suspension épaisse de bifidobactéries est inoculé dans lait écrémé stérile et additionné de 0.05% de cystéine chlohydratée. L incubation se fait en anaérobiose à 37ºC/48h Préparation de l innoculum : Une culture pure de 24h de chaque souche de bifidobactéries est inoculé dans du lait écrémé avec 0.05% de cystéine chlohydratée et 0.5 % d extrait de levure (Frank et al., 1993), incubé à 37ºC jusqu'à coagulation Effets d oxygène, température et ph sur la croissance : L effet d oxygène : Ensemencement en surface de Bifidobactéries sur boite pétri coulées en MRSc gélosé incubation en aérobiose à 37ºC /48h L effet du ph : Les souches de bifidobactéries sont ensemencées sur milieu MRS cys gélosé a ph =7 et ph= 3 incubées en anaérobiose a 37ºC 48h L effet de température : Les souches de bifidobactéries sont ensemencées sur milieu MRS cys gélosé, les boites sont incubées en anaérobiose pendant 48h à 37 et 45ºC.

73

74 4. Taux de croissance spécifiques et temps de génération des isolats : 4.1 Préparation des cultures : Le lait écrémé UHT est inoculé avec 1% d innoculum.le dénombrement est fait en d incubation à 37 C pendant 6 h sur milieu MRS cys en anaérobiose (jarre+anaerocult+bougie) pendant 72h. µ = (Log Xt Log X0)/ (Tt T0). dont Xt et X0 sont le nombre ufc/ml dans les temps Tt et T0. Le taux de génération est calculé selon (Shin et al., 2000) : Tg= Ln(2/µ). 5. Suivie de l acidité titrable : Les souches de bifidobactéries B1,B2,B3 et B4, ont été inoculé dans des flacon de 250ml avec une concentration de 5% d inoculum.a partir des flacon de 250 ml on a préparé des tubes de 10 ml pour suivre l acidité titrable pendant 6 h d incubation a 42 ºC. Le titrage s effectue à l aide d une burette avec de la soude dornic sous agitation, on a utilisé le phénophtaleine comme indicateur. Le résultat est considéré positive quand le virement de la couleur blanche du lait au rose dure quelques secondes. Les résultats sont exprimés en degrée dornic n 10 n : volume de la soude dornic 1 D dornic=0.1 g d acide lactique L acidité titrable été suivie en milieu lait écrémé +0.05% cystéine Hcl. 5.1 Suivi du ph : L acidité développée dans le lait est suivie aussi par la mesure du ph.

75 6. Résistance des souches isolé a l acidité et la survie en milieu lait a 4 C: Dans des flacons Duran 200 ml on a inoculé le lait écrémé avec une concentration finale de 10 de notre souche isolé a partir de yaourt Danone Djurdjra bioactivia B1et B2 et de la souche isolé a partir de yaourt Soummam acti+ B3 et B4. Les flacons sont ensuite conservé a 4º C pendant 21 jours avec un ph initial 4.5 ajusté avec l acide lactique (Jayamanne et Adams. 2006). Durant cette période un dénombrement été fait 0,7, 14 et 21 jour. 7. Dénombrement des Bifidobactéries et bactéries lactiques avant la date d expiration : Pour suivre la viabilité des Bifidobactéries dans le yaourt commercialisé on a utilisé le Soummam acti + aromatisé, acti+ a base de fraise et Danone Bioactivia aromatisé, Bio-activia fruité fraise, les échantillons ont été pris du marché au hasard, transporté au condition de froid jusqu'au laboratoire est conservé a 4ºC. Le suivi du ph et le dénombrement été fait avant 15, 7 jours et le jour même de la date d expiration. On a effectué des dilutions en solution Ringer ¼ % cys Hcl pour 1 litre pour les bifidobactéries et en solution Ringer¼ pour les bactéries lactiques, 100 µl des dilutions sont ensemencés sur : (figure 8)

76

77 1. Milieu MRS-Raffinose pour le dénombrement des bifidobactéries l incubation est faites dans une jarre a 42ºC pendant 72h en utilisant l anaerocult+ bougie pour créer l anaérobiose. 2. Milieu M17 pour le dénombrement des sterptococcus l incubation est faites a 44ºC pendant 48h. 3. Milieu MRS acidifie pour le dénombrement des lactobacillus l incubation est faites a 42ºC pendant 48h en anaérobiose. 8 Contrôle de qualité des yaourts utilisés dans notre travail : On a fait les étapes suivies au laboratoire d hygiène de la wilaya d Oran Recherche des coliformes fécaux et totaux : On procède à la recherche et le dénombrement des coliformes en utilisant le milieu de culture Désoxycholate. La lecture des résultats se fait après 24h, résultat positif se manifeste par la présence des colonies rondes ou ovales qui se situent entre les deux couches du milieu gélosé Recherche d E. coli : Les milieux utilisés sont le VBL (Bouillon lactosé au vert brillant) et EPEI (Eau peptonée à l exemple d indole) avec cloche de Durham. L incubation se fait à 44 C pendant 24h. Résultat positif se manifeste par la présence de gaz dans la cloche de durham.

78

79 8.3.Recherche des Staphylococcus aureus : le milieu utilisé pour la recherche des Staphylococcus aureus est le milieu Chapman solide, l incubation est faites à 37 C pendant 48h Recherche des Salmonelles : La première étape dites «pré enrichissement» se fait avec l eau peptonée tamponée, la deuxième étape est faites sur milieu SFB l incubation des deux étapes est faites 37 C pendant 24h. Puis l isolement se fait sur milieu SS (salmonella schigella), l incubation à 37 C pendant 48h. Résultat positif se manifeste par un centre noir entouré d un anneau Recherche des levures et moisissures : Le milieu utiliser est le Sabouraud+chloramphénicol, les boites sont laissées a température ambiante pendant 5 jours, résultat positifs se manifestent par l apparition des petites colonies pour les levures et un mycélium pour les moisissures.

80

81

82 Résultats 1. Pré-identification des souches : 1.1 Aspect macroscopiques : Les colonies des bifidobactéries développées sur le milieu MRS-raffinose modifiée sont de type punctiforme, de coloration blanchâtre, de contour régulier. Figures 14,16,18, Aspect microscopiques : L observation microscopique après la coloration de Gram des frottis réalisés à partir des colonies apparues, révèle la présence des bactéries gram positif, des bacilles en formes Y et V ou incurvés avec des extrémités bifurqués. Sont isolés ou en amas et un changement de formes après plusieurs repiquage ce polymorphisme cellulaire est typique aux bifidobactéries. figures 15,17,19,21,22,23. Tableau 7 : Différents aspects macroscopiques et microscopiques Souches Aspect macroscopique Aspect microscopique Gram B1 Petites colonies, blanchâtre Bâtonnets sous formes Y et V + à surface lisse et contour régulier B2 Petites colonies, blanchâtre Bâtonnets sous formes Y et V + à surface lisse et contour régulier B3 Petites colonies blanchâtres Bâtonnets à contour ondulés et + à contour régulier des extrémités bifurquées B4 Petites colonies blanchâtres à contour régulier Bâtonnets à contour ondulés et des extrémités bifurquées +

83 Fig 14: Aspect macroscopique de la souche B1 sur milieu MRScys après 48 h à 37º Fig 15: Aspect microscopique de la souche B1 100

84 Fig 16: Aspect macroscopique de la souche B2 sur milieu MRScys après 48 h à 37º Fig 17 : Aspect microscopique de la souche B2 100

85 Fig 18 : Aspect macroscopique de la souche B3 sur milieu MRScys après 48 h à 37º Fig 19 : Aspect microscopique de la souche B2 100

86 Fig 20: Aspect macroscopique de la souche B4 sur milieu MRScys après 48 h à 37º Fig 21 : Aspect microscopique de la souche B4 100

87 Fig 22 : Aspect microscopique de la souche B2 100 après plusieurs repiquages Fig 23 : Aspect microscopique de la souche B3 100 après plusieurs repiquages

88 2. Caractérisation du genre: Toutes les souches se développent en milieu anaérobiose, ne produisent pas de gaz à partir du glucose, absence d une activité urée indole et gélétinase aussi. Les résultat sont inscris au tableau suivant : Sucre souche Tableau 8 : Mise en évidence de certaines activités enzymatiques chez les souches étudiées. Test B1 B2 B3 B4 2.1 Fermentation des sucres : Production du gaz Uréase Indole Gélatinase Les profils fermentaires ont été définit après 48h d incubation en anaérobiose toutes les souches fermentent le glucose, le galactose, le fructose et le lactose. Tableau 9 : type fermentaire des souches de bifidobactéries Ara Dex Lac Gal Glu Mal Man Mant Raf Sor Sal Sach Thre Xyl Fru B B B3 ND ND ND ND ND + ND ND ND ND + + B4 ND ND ND ND ND + ND ND ND ND + + Ara :Arabinose ; Dex :Dextrine ; Lac :Lactose ; Gal :Galactose ; Glu : Glucose ; Mal :Maltose ; Man : Mannose ; Mant : Mannitol ; Raf :Raffinose ; Sor : Sorbitol ; Sal : Salicine ; Sach : Saccharose ;Thre : Tréhalose ;Xyl : Xylose ; Fru :Fructose.

89 Les souches B1 et B2 fermentent le raffinose, saccharose, maltriose, maltose et la dextrine ces critères suggère de les classer parmis l espèce Bififidobacterium animalis. Fig 24 : les sucres dégradés par la souche B1 De gauche à droite Témoin, Xylose, Glucose, Lactose, Arabinose, Dextrine, Saccharose,Salicine, Galactose, Raffinose, Maltose, Sorbitol,Mannose, Mannitol, Tréhalose. Les souches B3 et B4 fermentent les sucres qui déterminent le genre Bifidobacterium spp. (Tableau 9). 2.2 Effets d oxygène, température et ph sur la croissance : Aucune croissance était observé en aérobiose pour toute les souches et au ph=3, par contre la croissance est normale aux autre condition ph=7, T= 37 et 44ºC les résultats sont mentionnées au tableau 10.

90 Tableau 10: effets Température, ph, oxygène sur la croissance des béfidobactéries Souche Température ph Aérobiose 37 C 45 C 3 7 B B B B présence de croissance - Absence de croissance 2.3. L antibiogramme : Les résultats de l antibiogramme montre la sensibilité des souches au chloramphénicol, Pénicilline, Amoxicilline, Ampicilline, Erythromycine, Sulphamethoxazole figure 25 et la résistance aux autres antibiotiques testés, les résultats sont mentionnées au tableau 11. Tableau 11 : Résultat de l antibiogramme des souches isolées Antibiotique Dose (µ.i) B1 B2 B3 B4 Acide nalidixique 30 R R R R Amoxicilline 25 S S S S Ampicilline 10 S S S S chloramphénicol 30 S S S S Néomycine 30 R R R R Gentamicine 10 R R R R Paramomycine 30 R R R R Rifampicine 30 R R R R Streptomycine 10 R R R R Vancomycine 30 R R R R Erythromycine 15 S S S S Sulphamethoxazole 75 S S S S Pénicilline 10 S S S S S : sensibilité R : résistance

91 Fig :25 la sensibilité des bifidobactéries au 1- Erythromycine,2-Sulphamethoxazole,3- Pénicilline,4- chloramphénicol,5- Ampicilline, 6- Amoxicilline. 2.3 Caractérisation du coagulum : Le genre Bifidobacterium forme un coagulum visqueux avec la formation des grumeaux sur la paroi du tube après agitation. 3. Taux de croissance spécifiques et temps de génération des souches : Après le dénombrement des colonies acquises on a calculé les le taux de croissance et le temps de génération des deux souches étudiées dont la première B1 et B2 isolée du produit Danone Bioactivia et la deuxième B3 et B4 isolée du produit Soummam Acti+ (tableau 11). Tableau 12 : Taux de croissance spécifiques et temps de génération des souches B1,B2, B3,B4 Souches µ (hˉ¹) Tg B ,54 B B B

92 4. L acidification du lait : Les résultat montrent que les souches B1, B2,B3 et B4 ont un pouvoir acidifiant cela est constaté a partir d acidité titrable acquise et du ph observé après 6h d incubation a 42 C les résultat sont représentés dans les figure suivantes 26 et 27. La production d acide entre les quatre souche est peut proche, elle atteint 30 D après 3 h d incubation et entre 40 et 47 D après 6 h d incubation pour les quatre souches B1,B2, B3 et B4 en milieu lait écrémé % cystéine Hcl. Fig 26: cinétique d évolution de l acidité Dornic produite par les souches à 42 C La fermentation du lait provoque un abaissement de ph qui est proportionnelle à l acidité produite.le ph varie de 6 à 5.2 en milieu lait écrémé+ cystéine Hcl.. figure 27.

93 fig 27 :Variation du ph des souches lors du suivie de l acidité titrable. 5. La survie des bifidobatéries dans milieu lait : Le suivie de la viabilité des souches B1,B2,B3 et B4 dans milieu lait pendant 21 jours avec un ph 4.5 ajustés avec l acide lactique est conservé a 4 C montre la résistance des souches isolées B1, B2, B3 et B4 à l acidité et au froid avec un nombre initial supérieur a 10 8 et un nombre finale supérieur à les souches B1 et B2 garde un nombre de 6.7 Log ufc/ml et les souches B3 et B4 gardent un nombre de 5.8 Log ufc/ml. Les résultats sont représentés dans la figure 28.

94 Fig 28 : La survie des souches ph 4.5 Pendant 21 jours dans milieu lait à 6. Dénombrement des bifidobactéries et les bactéries lactiques dans le produit commercialisé : Les résultat obtenus montrent la présence d un nombre élevée des Streptococcus et Lactobacillus dans les quatre produits étudier P1,P2,P3 et P4 des deux marques Dannone et Soummam avec un nombre supérieur à 10 7 de Streptococcus et un nombre supérieur à 10 6 de lactobacillus à la date d expiration. Le nombre des bifidobactéries : Yaourt aromatisé P1 de Dannone : le nombre varie entre le jour de d échantillonnage et de le jour d expiration Fig 29. Yaourt fruité P2 de Danone : On a observé un nombre un peut plus élevée qui varie entre le jour d échantillonnage et le jour d expiration Fig 30. Yaourt aromatisé P3 de Soummam : le nombre varie entre le jour de d échantillonnage et de 10 4 le jour d expiration Fig 31.

95 Yaourt fruité P4 de Soummam : le nombre varie entre le jour de d échantillonnage et de le jour d expiration Fig 32. Le ph varie entre 4.5 et 3.9 pour les deux produits. Les résultats sont représentés dans les figures suivantes : Fig 29 : Viabilité des bifidobactéries et les bactéries lactiques dans P1 Aromatisées de Danone. Fig 30 : Viabilité des bifidobactéries et les bactéries lactiques Fruité de Dannone. dans P2

96 Fig 31 : Viabilité des bifidobactéries et les bactéries lactiques aromatisé de Soummam. dans P3 Fig 32 : Viabilité des bifidobactéries et les bactéries lactiques dans P4 fruité de Soummam

97 7. Contrôle de qualité des échantillons des yaourts utilisés dans notre travail : Les analyses microbiologiques des échantillons utilisés dans notre travail ont démontrés l absences des d E.coli, Staphylococcus aureus, Salmonelles, des coliformes fécaux et totaux et des moisissures. La présence des levures a été détectée dans quelques échantillons, mais le nombre est négligeable qui n a pas d influence sur la qualité microbiologique et même organoleptique du yaourt. Les résultats sont mentionnés au tableau 12. Tableau 12 : contrôle de qualité des yaourts utilisés Produit Micro-organisme Danone aromatisé Danone fruité Soummam aromatisé Soummam fruité d E. coli Absence Absence Absence Absence Staphylococcus Absence Absence Absence Absence aureus Salmonelles Absence Absence Absence Absence Coliformes fécaux Absence Absence Absence Absence et totaux levure Présence de quelque colonies présence de quelque colonies présence de quelque colonies présence de quelque colonies moisissure Absence Absence Absence Absence

98 Discussion 1. Les conditions et les milieux d isolement : Deux facteurs sont très importants lors de l'isolement des Bifidobactéries, Le premier de ces facteurs est l'obtention des conditions anaérobies et le second est un milieu de culture adéquat ( Rasic et Sad 1990). Les conditions anaérobies sont facilement obtenues depuis l'apparition des hottes anaérobies qui ont des atmosphères modifiées composées de 10% de CO2 et de 90% de N2. Ou l utilisation des anaerocult ou les gas pack (Shah, 1997 ; Scardovi, 1986). Dans notre travail l anaérobiose est assurée par l utilisation des anaerocult plus bougie pour assurer les conditions citées au dessus. De plus, les milieux de culture contiennent généralement des suppléments tels que la cystéine, la cystine, chlorure de lithium, des sels métalliques, l'acide ascorbique et le sulfite de sodium qui réduisent le potentiel redox (Shah, 1997). Le milieu utilisé été le MRS modifié a base de raffinose, La propriété de ce milieu repose sur ces élément chimique, la cystéine-hcl qui joue un agent réducteurs du potentiel d oxydoréduction, chlorure de lithium comme agent inhibiteur des lactobacillus et le raffinose comme source d énergie (Tabasco et al., 2007). 2. Identification des souches : L identification des souches basées sur des aspects morphologiques, macroscopiques et microscopiques. Les bifidobactéries qui poussent sur les milieux MRS-cys et MRS- Raffinose formes de petites colonies dépourvues de toute activité catalase et

99 oxydase confirme l anaérobiose des souches isolées (B1,B2,B3,B4) Ces résultat sont aussi obtenus par Tabasco (2007). Microscopiquement sont des Gram+ de forme bifide qui est la forme typique au bifidobactéries (Scardovi, 1986 ;Beerens, 1990 ;Tabak et al.,2007 Tabasco et al, 2007). L observation microscopiques des bifidobactéries cultivé sur milieu MRSraffinose représente des forme Y et V plus que les bifidobactéries cultivées sur milieu MRS cys, on a observé aussi un pléomorphisme après plusieurs repiquage. Ce pléomorphisme observé chez les bifidobacteries est souvent associé à la composition du milieu de culture aussi la morphologie cellulaire des bifidobactéries est influencées par la nature de la source de carbone (Tamime et al., 1995 ; Bensoltane, 1997). Les souches appartenant au genre bifidobactéries ne forment pas d indole, ne possèdent pas une activité uréique et ne liquéfient pas la gélatine (Mitsuoka, 1984).Ces caractères biochimiques n ont pas été constatés chez les souche retenues. Les quatre souches isolées (B1,B2,B3,B4) résistent à l acide nalidixique, Néomycine, Gentamicine, Paramomycine, Rifampicine, Streptomycine, Vancomycine. Ces antibiotiques sont utilisés comme agents sélectifs dans les milieux pour l isolement et le dénombrement des bifidobactéries (Ventoura, 2004). La résistance des bifidobactéries aux antibiotiques cités au dessus est signalés par plusieurs auteurs (Charteris et al., 1998 ; Delagdo et al.,2005;

100 Moubarek et al., 2005 ; Zhou et al., 2005 ; Masco et al., 2006 ; Ammor et al., 2007 ; D'Aimmo et al., 2007). Les bifidobacteries sont généralement sensibles aux antibiotiques betalactamine( penicilline, ampicicilline, amoxicilline, piperacilline et ticarcilline) ( Delagdo et al.,2005 ; Moubarek et al., 2005 ; Zhou et al., 2005 ; Masco et al., 2006 ; Ammor et al., 2007 ; D'Aimmo et al., 2007 ; Ouoba et al., 2008 ). Les bifidobacteries sont aussi sensible à la chloramphénicol ( Delcenserie et al., 2002 ; D'Aimmo et al., 2007 ; Ouoba et al., 2008 ). Cette sensibilité été observé chez les souches isolées. La différenciation des espèces de bifidobactéries repose sur la fermentation des carbohydrates. La souche NCC 2705 de bifidobacterium longum possède des gènes codant pour des enzymes ( fumarase, oxoglutarate déhydrogénase et le maltate déhydrogénase) qui permettent la dégradation de plusieurs sucres comme arabinose, xylose, ribose, cellobiose, melibiose, maltose, raffinose, et mannose (Schell et al., 2002). Les souches B1 et B2 fermentent dextrine, glucose, le maltose, le maltotriose, le raffinose et le saccharose. La caractérisation biochimique, fermentation des sucres dextrine,glucose, le maltose, le maltotriose, le raffinose et le saccharose, la croissance a température 44º des souches B1 et B2 nous a mené a l identifier comme Bifidobacterium animalis. L espèce prédominante dans les produits probiotiques commercialisés selon fasoli et al (2003). Le fabricant du yaourt dont ont à isolé B1 et B2 Danone réclame la présence du Bifidobacterium animalis subsp. Lactis.

101 Les caractérisation morphologique, macroscopique, microscopique et biochimiques des souches B3 et B4 permette les identifier comme Bifidobacterium spp. Les bifidobactéries sont généralement sensible a des ph inférieurs à 4.6 (boylyston et al., 2004). Cependant les souches de Bifidobacterium animalis montrent une résistance au ph acide que d autres espèces appartenant au genre de Bifidobacterium (Jayamanne et Adams,2006). Les bifidobactéries préfèrent les milieux neutres ou légèrement acides a des ph compris entre 5 et 8 (Rommond et al, 1992 ; Wang et Gibson, 1993 ; Akalin et al.,2004 ; Collado et al., 2006). Pour les souches B1, B2,B3 et B4 ont montré une croissance a un ph égale à 7 et une absence de croissance a un ph égale 3. La température d incubation agit sur la croissance des bifidobactéries, les espèces d origine humaine montre une croissance à une température varie entre 36 et 38ºC par contre les espèces d origine animales peuvent se croître à des température plus élevée qui varie entre 41º et 43 C (Scardovi, 1986 ; Martin et chou, 1992). Les souches B1, B2,B3 et B4 ont montré une croissance a la température 37 C comme a la température 45 C. 3. Les aptitudes biotechnologiques : Les deux souches B1et B2 atteignent un taux de croissance de 0.46hˉ¹, B3 et B4 atteint un taux de 0.4 hˉ¹, ce taux de croissance était observé chez plusieurs espèces de bifidobactéries (B.lactis, B. longum, B.bifidum, B.breve) sélectionnées comme probiotiques (Martinez-Villaluenga et Gomez, 2007).

102 La composition du lait utilisé influence sur la croissance et aux taux d acidité produite par les bifidobactéries ( Abu Tarabush et al., 1998 ; Hadadji et Bensoltane 2006). La fermentation du lait par les bifidobactéries conduit à la production d une acidité titrable qui détermine les propriétés technologiques de ces bactéries. En revanche la production de l acidité dépend de plusieurs paramètres tels que la température d incubation, l état physiologique des bactéries, la concentration de l inoculum et le lait utilisé (Hadadji, 2007). La production d acide entre les quatre souches est peut proche, elle atteint 30 D après 3 h d incubation et entre 40 et 47 D après 6 h d incubation pour les quatre souches B1,B2, B3 et B4 en milieu lait écrémé % cystéine Hcl. L acidité titrable des souches B1 et B2 atteint plus de 45 ºD dans le lait partiellement écrémé+cys, la souche B4 et B4 aussi montre un pouvoir acidifiant au lait écrémé+cys qui dépasse aussi les 45 D après 6 heures d incubation a 42 C. Nous avons remarqué que les souches B1,B2, B3 et B4 gardent un nombre de 10 5 ufc/ml pendant 21 jours à 4 C avec un nombre >10 8 le jour d ensemencement et un ph égale a 4.5. Les souches B1 et B2 garde un nombre de 6.2 Log ufc/ml et les souches B3 et B4 gardent un nombre de 5.4 Log ufc/ml. Ces résultats montrent la résistante des deux souches étudiées à l acidité et au frois et confirment ces aptitudes technologiques sont obtenus aussi par Jayamanne et Adams (2006).

103 La résistance des bifidobactéries à l acidité est importante pour avoir de bon effet thérapeutique et pour garder sa viabilité dans les produits fermentés (Takiguchi et Suzuki, 2000). Matsumoto et al, (2004) ont étudié la résistance à l acidité chez 17 espèces de bifidobacterium en utilisant le HCL comme agent acidifiant, l espèce la plus résistante a été Bifidobacterium animalis subsp. Lactis. Jayamanne et Adams (2006), ont utilisé l acide lactique pour étudier la résistance des B.bifidum, B.longum, B.infantis, B.adolescentis et Bifidobacterium animalis subsp. Lactis et ont pu constaté que cette dernière possèdent une résistance plus élevée par apport aux autres espèces. 4. Dénombrement et viabilité des bifidobactéries et les bactéries lactique dans un yaourt fabriqué et commercialisé en Algérie : Les produits laitiers fermentés y incluent le yaourt contient plusieurs souches de bactéries probiotiques, les plus dominants sont les lactobacillus acidophilus, L.casei, L.bulgaricus et Bifidobacterium lactis ( Fasoli et al., 2003 ; Gueimonde et al., 2004 ; Masco et al., 2005 ; Yeung et al., 2002). La présence de ces multiples espèces rendent le dénombrement des bactéries lactiques et les bifidobactéries difficile, pour cela plusieurs milieu sont proposés pour le dénombrement des bifidobactéries (Chartiers et al., 1997 ; Shah, 200 ; Roy, 2001 ; Coeuret et al., 2003) et d autres milieux ont démontré une performance analytique,tous ces milieux proposées exigent l utilisation des antibiotiques.(payne Moris et bers, 1999 ; Talwalker et Kailasapathy, 2004 ; Masco et al., 2005 ; Van de casteele et al., 2006) Aussi l utilisation du MRScys présente une croissance optimal des bifidobactéries pur mais il n est pas sélective (Roy, 2001 ; Leuschner et al,. 2003).

104 Pour cela on a utilisé le milieu MRS-Raffinose pour le dénombrement des bifidobacteries a partir du yaourt. Il est composé de raffinose comme source de carbohydrates et 0.05% de chlorure de lithium pour inhiber les lactobacillus, il ne contient pas d antibiotiques et sa sélectivité pour le dénombrement des B.lactis dépasse les 98% (Tabasco et al., 2007). Les colonies de Bifidobactéries apparaissent petites, les colonies de lactobacillus sont lenticulaire, et les colonies de streptococcus sont un peux plus grande. Un probiotique doit survivre tout au long du passage gastrique, pour avoir des bienfaits sur la santé humaine (Kailasapaty et Rybeka, 1997). Cependant certaines études ont montré que le consommation de probiotiques non-viables peut aussi engendrer des effets bénéfiques sur le système immunitaire (Ouwehand et Salminen, 1998; Salminen et al., 1999 ; (Pessi et al, 1999). Dans de tels cas, il suffit alors d obtenir de grandes concentrations des souches probiotiques dans le yaourt durant la période initiale de production sans nécessairement conserver une bonne viabilité durant le stockage. Mais d autres études ont démontrés que la condition pour avoir de bienfaits thérapeutiques est la présence d un nombre important des bactéries probiotiques viable dans les produits consommés (Gueimonde, 2004). Un produit probiotique efficace doit obtenir au minimum 10 7 ufc/ml de L.acidophilus et de 10 6 ufc/ml de bifidobacteries le jour d expiration (Jayamanne et Adams 2006), La stabilité physique et génétique des cellules ainsi que toutes les propriétés nécessaires pour exercer leurs bienfaits sur la santé doivent également être assurées. De plus, ces souches devraient être viables sans se multiplier pour

105 ne pas provoquer d effet indésirable sur le goût ou l arôme du produit ni augmenter l acidité (Mattila-Sandholm et al., 2002). Dans les produits étudier (yaourt Danone BioActivia et yaourt Soummam Acti+) le nombre de bifidobactéries varie entre 10 4 et 10 5 le jour d expiration. Yaourt aromatisé P1 de Dannone : le nombre varie entre Log 6.2 le jour de d échantillonnage et de Log 4.2 le jour d expiration. Yaourt fruité P2 de Dannone : On a observé un nombre un peut plus élevée qui varie entre Log 7.1 le jour d échantillonnage avant 15 jours d expiration et de Log 5.3 le jour d expiration. Yaourt aromatisé P3 de Soummam : le nombre varie entre Log 5.3 le jour d échantillonnage et de Log 4.2 le jour d expiration. Yaourt fruité P4 de Soummam : le nombre varie entre Log 6.5 le jour d échantillonnage et de Log 5.4 le jour d expiration. Le nombre de streptoccocus et supérieur à 10 7 pour les quatre produits étudier. Le nombre de lactobacillus et supérieur a 10 6 pour les quatre produits aussi. Au japon Fermented Milk and Lactic acid Beverages réclame la viabilité d un nombre supérieur à 10 6 ufc/ml des bifidobactéries dans les laits fermentés (Lourens Hattingh et Viljoen, 2001). Aux états unies The national youghurt asotiation (NYA) réclame la présence d un nombre supérieur a 10 6 ufc/ml de bifidobactéries (NYA, 2003) mais Ibrahim et Carr (2006) ont démontré que la plupart des produits probiotique commercialisé au Carolina du nord contient un nombre inférieur a 10 4 ufc/ml de Bifidobacterium. En Algérie aucune réclamation n est faites pour le nombre des bactéries probiotique viable dans les produits commercialisé.

106 Le nombre de streptococcus est de log 7 ufc/ml le jours d expiration pour les quatre produits aromatisé et fruité le nombre de lactobacillus est de < log 6.5 ufc/ml le nombre de ces deux bactéries a été aussi observé par Ibrahim et Carr (2006). Plusieurs facteurs influencent la viabilité des bactéries probiotiques ces facteurs regroupent : l acidité du produit, acidité produisait durant le stockage ou post acidification le degré d oxygène dans le produit, la sensibilité aux substances antimicrobiennes produisait par les bactéries lactiques (Gilliland et al., 2002). La souche isolées du même produit qui était B3 a montré une résistance a l acidité et un degré de survie important au milieu lait pendant 21jours. ce comportement n est observé lors du dénombrement à partir du produit commercialisé peut être expliqué comme suit : 1-Dans notre étude les échantillons ont été prélevés du produit commercialisé et non pas d usine directement c'est-à-dire les conditions de stockage ne sont pas connues ou plus précisément les bonnes conditions ne sont pas assurées avant d effectuer le prélèvement. 2-Le taux d inoculum utilisé n est pas connu aussi, le moment d ensemencement et la procédure de fabrication n est pas connue aussi. 3-Un autre facteur est le comportement des bifidobacterium en culture pure est différent a celui en culture mixte. Les associations des bactéries lactiques et bifidobactéries sont rédies par des interactions négatives de compétition, ou interaction positives (Juillard et Richard, 1994).

107 Les bifidobactéries sont anaérobiques et généralement considérées plus sensibles que L.bulgaricus contre les effets d oxygène (Talwalkar et Kailsasapathy, 2003). Pour De Vuyst (2000) la viabilité des bifidobactéries est du a l interaction des bactéries probiotiques et à la stabilité de culture, le degré de l inoculum et les conditions du processus technologique. La différence du nombre de bifidobacterium entre le produit aromatisé et le produit fruité dont le dernier le nombre été un peut élevé nous mène a mettre en évidence d une relation symbiotique entre les bifidobacterium et les élément ajoutés au yaourt (fruit).ce phénomène été observé par plusieurs auteurs (Hopkins et al., 1998 ; Lamoureux et al., 2002 ; Gueimonde et al., 2004 ; Martinez-Villaluenga et Gomez, 2007). La viabilité des bifidobactéries en présence des fibre alimentaire est l objectifs des travaux récent tel que le travail Sendra et al 2008 montre la capacité des L. acidophilus et B. bifidum de survivre durant le stockage en présence des orange et citron. Les bifidobactéries associent aux bactéries lactiques diminuent lentement le ph du lait par apport aux autres associations. Ceci peut être due à la croissance lente des bifidobactéries dans le milieu lait, par insuffisance des substances azotés facilement assimilable (Haddaji et bensoltane, 2006 ; Mahi et al., 2006). Dans notre étude le ph des échantillons étudier durant les quinze jours avant l expiration n a pas beaucoup diminués, le jour de l échantillonnage le ph= 4.5 et le jour d expiration le ph= 3.9. La présence de Bifidobacterium ou bien l acide acétique a un effet marginale sur lactobacillus et/ou Streptococcus, de ce fait les associations de Bifidobacterium avec lactobacillus et/ou Streptococcus peut donner un produit doux a longue durée de conservation aussi l acidification lente de ces culture

108 mixtes offre des avantages d une faible acidification, plus encore ces cultures donnent un produit réduit en acide lactique qui rend le produit facilement assimilable. (Hadaji 2007 ; Chekroun et Bensoltane, 2007). Les interactions possibles entre bactéries lactiques et probiotiques devraient également être prises en compte pour sélectionner la meilleure combinaison de souches afin d optimiser le procédé et la survie cellulaire dans le produit entreposé (Vinderola et al.,2002). 5. Contrôle de qualité des échantillons des yaourts utilisés dans notre travail : Un yaourt de bonne qualité doit répondre aux norme, l application de bonnes pratiques d hygiènes à tous les stades de la vie d un produit alimentaire (Jouve, 1998). Dans notre travail on a analysé la qualité microbiologique des yaourts. Les résultats obtenus on démontrés la présence d un nombre important des bactéries lactiques, l absence de toute bactérie pathogène tel que d E. coli, Staphylococcus aureus, Salmonelles et de coliformes fécaux et totaux et la présence de quelque colonies de levure qui n influence pas sur la qualité du produits. Ces résultat sont similaires aux normes de qualité utilisé au laboratoire d hygienne de la wilaya d Oran et aux études de Tamime (1975, 1999).

109 Conclusion Dans notre étude nous avons isolées des bifidobactéries à partir des yaourts fabriqués et commercialisés en Algérie. L exigence de ce genre nous a mené à utiliser plusieurs milieux de culture comme MRS cys, MRS raffinose. L étude macroscopique montre que ces bactéries forment de petites colonies blanchâtre, l étude microscopique montre la présence des formes typiques au genre Bifidobacterium, sont de Gram positif, ne possèdent pas de catalase. Le profil fermentaire nous a permis a confirmé le genre de Bifidobacterium et a identifié B.animalis. L étude physiologique réalisé dans le but de connaître les conditions optimales de la croissance des bifidobactéries a montré une croissance des souches isolées à température 37 C et 45 C, aussi la croissance des bifidobactéries est influencé par le ph initial du milieu ceci a été observé avec le ph=3 qui a inhibé complètement la croissance des bifidobactéries par contre le ph=7 ou = 6.5 favorise la croissance des bifidobactéries. Les souches étudier ont montré un pouvoir acidifiant important, un taux de croissance qui dépasse 0.4 et un temps de génération (dans lait UHT % de cysteine + 0.5% d extrait de levure) important qui confirme ces aptitudes technologique. La survie de bifidobactérie est un critère important pour la sélectionné autant probiotique, l étude de la survie sur milieu lait pendant 21 jours a un ph initial égale a 4.5 a montré la résistance des souches étudié à l acidité et à une température de conservation égale 4 C. Les souches B1, B2, B3 et B4 ont montré une résistance à l acidité et au froid avec un nombre initial supérieur à

110 10 8 et un nombre finale supérieur à Les souches B1 et B2 garde un nombre de 6.7 Log ufc/ml et les souches B3 et B4 gardent un nombre de 5.8 Log ufc/ml. Le dénombrement des bifidobactéries à partir du produit commercialisé a montré la présence d un nombre > 10 4 pour le produit aromatisé et un nombre > 10 5 pour le produit fruité. Par contre le nombre de Strepfococcus thermophilus est supérieur a 10 7 pour les deux produits le jour d expiration et Lactobacillus bulgaricus est supérieur a 10 6 pour les deux produits le jour d expiration. Les analyses microbiologiques des échantillons utilisés dans notre travail ont démontrés l absences des d E. coli, Staphylococcus aureus, Salmonelles et de coliformes fécaux et totaux. La présence des levures et moisissures a été détecté dans quelques échantillons, mais le nombre est négligeable qui n a pas d influence sur la qualité microbiologique et même organoleptique du yaourt. Il est de bonne qualité. Les perspectives : Le but de notre travail était la mise en évidence des bifidobactéries et étudier ses performances à partir des yaourts probiotiques fabriqués et commercialisés en Algérie.Cela nous a permis de conclure avec ces perspectives : 1-L identification génétique des bifidobactéries isolées du yaourt Algérien. 2-Etudier le potentiel probiotique des bifidobactéries isolées : In vitro : Les interactions avec d autres bactéries pathogène. In vivo : Sa résistance au passage gastrique chez des personnes sains et/ou malades en étudiant les modifications de la flore intestinale avant, durant et après la consommation du yaourt probiotique.

111 Abd El-Salam, M.H., Saleh, F. A., Kholif. A. M., El-Sayed, E. M., Abdou, S. M., El-Shibiny,S.,(2004). Isolation and characterization of bacteriocins produced by Bifidobacterium lactis BB-12 and Bifidobacterium longum BB-46. 9th Egyptian conference for dairy science and technology, Cairo, Egypt, Abu -Tarabush, H.M., Al-Dagal, M.M and Al-Royly, M.A.(1998).Growth, Viability, and Proteolytic activity of Bifidobacteria in Whole Camel milk. Journal of Dairy Sciences. 81, Akalin, A.S., Fenderya,S and Akbulut, N.(2004).Viability and activity of bifidobacteria in yoghurt containing fructooligosaccharides during refrigerated storage. International Journal of food Science.39: Ammor Mohammed Salim, Ana Belen Florez,Baltasar Mayo.(2007). Antibiotic resistance in non-enterococcal lactic acid bacteria and bifidobacteria. Journal of Food Microbiology 24: Axelsson (1998). Lactic acid bacteria: classification and physiology.p1-72 In:Salminen S, Won Wright (ed). Lactic acid bacteria Microbiology and functional aspects. 2nd ed.: Marcel Dekker Inc, New York. Backhed F, Ley RE, Sonnenburg JL, et al. (2005). Hostbacterial mutualism in the human intestine. Journal of Appl Science 307: Ballongue,J., Grill J.P.et Baratte-eulooge, P.(1993). Action sur la flore intestinale de laits fermentés au Bifidobacterium. Laits 73 : Barnich N, Darfeuille-Michaud A (2007). Adherent invasive Escherichia coli and Crohn s disease. Curr Opin Gastroenterol 23: Beerens,H.(1990).An elective and selective isolation medium for Bifidobacterium spp. Letters in Applied Microbioiogy. 11: Bensoltane A.(1997). Etude bibliographique sur la caractérisation de Bifidobacterium sp.annales de l université d Oran

112 Bensoltane A,YagoubiA, Mahi M and Chiriguene A. (2004).characterization of lactic acid bacteria isolated from traditional Algerian butter. Egypt. Journal Applied sciences; 19 :(11B), Berg R. D., Probiotics, prebiotics or conbiotics. Trends in Microbiology, 6, Bevilacqua, L., Ovidi, M., Mattia, E.D., Trovatelli, L.D., Canganella, F., (2003). Screening of Bifidobacterium strains isolated from human faeces for antagonistic activities against potentially bacterial pathogens. Microbiological Research 158, Bezkorovainy, A. et Miller-Catchpole, R.(1989). Biochemistry and physiology of bifidobacteria. In Étude de I impact de l'ajout des bifidobactéries sur les cinétiques de fermentation des bactéries lactiques mésophiles utilisées dans la production de fromage frais ; Martine Baron, Mémoire (M-Sc.) l'université Laval Canada. Biavati. B., Soni,T., Mattarelli,P. et Trovaletti.L.D.(1992). Survival of bifidobacteria from human habitat in acidified milk. Microbiologica. 15(2): Blanchette, L., Roy, D. Bélanger, G., et Gauthier, F. S.(1996). Production of cottage cheese using dressing fermented by bifidobacteria. J. Dairy Sci. 79:8-15. Boccignone M. Brigidi R. Sarra. C (1984). Studi effettuati sulla composizione in trigliceridi ed acidi grassi liberi nello yoghurt preparato da latte vaccino. pecorino e caprino. Ann Fac Med Vet (Turin) Bourlioux Pierre (2007). Histoire des laits fermentés.international Journal of Dairy Technology Volume 42, Supplement 2 : Pages Boylston T.D., Vinderola C.G., Ghoddusi H.B., Reinheimer J.A.(2004). Incorporation of bifidobacteria into cheeses: challenges and rewards. Int. Dairy J. 14 :

113 Charteris, W.P., Kelly, P.M., Morelli, L. and Collins, J.K.(1998). Development and application of an in vitro methodology to determine the transit tolerance of potentially probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium species in the upper human gastrointestinal tract. Journ Appl Microbiol 84, Charteris, W. P., Kelly, P. M., Morelli, L., & Collins, J. K. (1997). Selective detection, enumeration and identification of potentially probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium species in mixed bacterial populations. International Journal of Food Microbiology, 35, Cheikhyoussef, A., Pogori, N., Zhang, H., (2007).Study of the inhibition effects of Bifidobacterium supernatants towards growth of Bacillus cereus and Escherichia coli.international Journal of Dairy Science 2, Cheikhyoussef Ahmad, Natascha Pogori, Wei Chena and Hao Zhang(2008). Antimicrobial proteinaceous compounds obtained from bifidobacteria: from production to their application. International Journal of Food Microbiology, In press. Chekroun. A and Bensoltane.A.(2007).Nutritional characterization of fermented cow s milk at 45 C by lactobacillus acidophilus associated with bifidobacteria. Egypt of appl sci 22(12a): Chougrani.Fadela,Cheriguene.Abderrahim, and Bensoltane.Ahmed.(2008). Use of lactic strains isolated from Algerian ewe s milk in the manufactured of a natural yogurt. African Journal of Biotechnology, vol 7 (8),pp Coeuret, V., Dubernet, S., Bernardeau, M., Gueguen, M., & Vernoux, J.P. (2003). Isolation, characterisation and identification of lactobacilli focusing mainly on cheeses and other dairy products. Le Lait, 83,

114 Collado,M.C.,Moreno,Y.,Cobo,JM.,andHernandez,M.(2006). Microbiological evaluation and molecular charterization of bifidobacteria strains in commercial fermented milks.european food research technological.222: Collins EB., Hall BJ. (1984). Growth of bifidobacteria milk and preparation of Bifidobacterium infantis for a dietary adjunct. Journal of Dairy Sciences 67(7): Courtin P, Rul F.(2003).Interactions between microorganisms in simple ecosystem: yogurt bacteria as a study model. Lait 84: Crociani, F., Biavati, B., Alessandrini, A., Chiarini, C, et Scardovi, V. (1996).Bifidobacterium inopatum sp. nov. and Bifidobacterium denticolens sp nov., two new species isolated from human dental caries. Int. J. Syst. Bacteriol 46: D'Aimmo Maria Rosaria, Monica Modesto, Bruno Biavati.(2007). Antibiotic resistance of lactic acid bacteria and Bifidobacterium spp. isolated from dairy and pharmaceutical products. International Journal of Food Microbiology 115 : Dann SM, Eckmann L (2007). Innate immune defenses in the intestinal tract. Curr Opin Gastroenterol 23: Dave R. I. and Shah N. P. (1997). Viability of yoghurt and probiotic bacteria in yoghurts made from commercial starter cultures. Int. Dairy J, 7: Deeth,H,C. et Tamime,A.Y.(1981). Yogurt : Nutritive and therapeutic aspects. Journal of Food Protection. 44(1): De Felip G. Croci L. Gizzarelli S (1977). Ricerche su alcune idrolasi e vitamine dei gruppo B nello yogurt in relazione al trattamento termico. Ig Mod

115 Deguchi, Y., Morishita, T., & Mutai, M. (1985). Comparative studies on synthesis of water soluble vitamins among human species of bifidobacteria. Agricultural and Biological Chemistry, 49, Delcenserie V, China B, Gavini F, Beerens H, Daube G.(2002). Proposition pour un nouveau standard indicateur de la contamination d origine fécale dans les aliments : le genre Bifidobacterium.Ann Méd Vét, 146, Delgado S., Florez A.B. and Mayo B. (2005). Antibiotic susceptibility of Lactobacillus and Bifidobacterium species from the human gastrointestinal tract. Curr. Microbiol, 50: Dellaglio,F., DeRoissart,H., Torianni,S., Curk,MC, Janssens,D.(1994). Caractéristiques générales des bactéries lactiques,p In Ecosystème microbien d un atelier fermier de salaison identification et propriétés des bactéries lactiques thèse de doctorat université de Rennes France. De Man, J.C., Rogosa, M. and Sharpe, M.E. (1960). A medium for the cultivation of lactobacilli. Journal of Applied Bacteriology 23, De Roissart,H. (1986).Bactéries lactiques,p : 443.In Ecosystème microbien d un atelier fermier de salaison identification et propriétés des bactéries lactiques thèse de doctorat université de Rennes France. Desjardins,M.-L., Roy,D. et Goulet,J. (1990). Growth of bifidobacteria and their enzyme profiles. Journal of Dairy Science.; 73(2): De Vrese M, Marteau PR (2007). Probiotics and prebiotics : effects on diarrhoea. Journal of Nutrition 137(suppl 2): S803-S811. De Vries,W. et Stouthamer,A.H.(1967). Pathway of glucose fermentation in relation to the taxonomy of bifidobacteria. J.Bacteriol., 93: De Vries,W. et Stouthamer,A.H.(1968). Fermentation of glucose, lactose. galactose, mannitol and xylose by bifidobacteria. Journal of Bacteriology, 96(2):

116 De Vuyst Technology aspects related to the application of functional starter cultures. Foof Technol. Biotechnol. 38(2): Dong, X., Xin, Y., Jian, W., Liu, X. and Ling, D. (2000). Bifidobacterium thermacidophilum sp. nov., isolated from an anaerobic digester. International Journal Systimatic Evol Microbiolg,. 50, Dunne, C.L., L.M. O'Mahony, G. Thornton, D. Morrissey, S. O'Halloran, M. Feeney, S. Flynn, G. Fitzgerald, C. Daly, B. Kiely, G. O'Sullivan, F. Shanahan and J.K. Collins, (2001). In vitro selection criteria for probiotic bacteria of human origin: correlation with in vivo findings. Am. J. Clin. Nutr., 73: Dupin H (1992). Apports nutritionnels conseillés pour la population française. In : Tech & Doc. Lavoisier, Paris, France. Euzéby J.P. (2007). List of prokaryotic names with standing in nomenclatures, list of genera included in families. Update: September 04, Date de visite du site vendredi 07 septembre 2007, 16h: 32min. Falagas Matthew E.,Petros I. Rafailidis, Gregory C. Makris (2008). Bacterial interference for the prevention and treatment of infections, International Journal of Antimicrobial Agents.In press. FAO, 1998 / archives de document de la FAO, le lait et les produits laitiers dans la nutrition humaine. FAO/WHO (2002) Report of a Joint FAO-WHO Working Group on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. ftp://ftp.fao. org/es/esn/ food/wgreport2. pdf. Fasoli S., Marzotto M., Rizzotti L., Rossi F., Dellaglio F.and Torriani S.(2003). Bacterial composition of commercial probiotic products as evaluated by PCR-DGGE analysis. International. Journal of. Food. Microbiology, 82:

117 Fava F, Lovegrove JA, Gitau R, et al. (2006). The gut microbiota and lipid metabolism: implications for human, health and coronary heart disease. Curr Med Chem 13: Frank AMK, Kegma F, and Weerkamp HA. (1993). Growth and survival of Bifidobacteria in milk.neth. Milk. Dairy. journal 47: Frederickson AG.1977.Behavior of mixed cultures of microorganismes. Annu Rev Microbiol.31: Flourie B, Nancey S (2007). Propriétés fonctionnelles des probiotiques. Cah Nutr Diet 42(3 Hors-série 2): 2S Fuller R, (1992). Probiotics in human medicine.gut.32: Garrity,GM., Holt, JG Taxonomic outline of the archaea and Bacteria p In Ecosystème microbien d un atelier fermier de salaison identification et propriétés des bactéries lactiques thèse de doctorat université de Rennes France. Gavini F, Pourcher A.M, Bahaka D, Freney J, Romond C, and Izard D (1990). Le genre Bifidobacterium.classification, identification, aspect critiques, Méd. Mal infect.20: Gibson G.R. and Wang X. (1994). Enrichment of Bifidobacteria from Human Gut Contents by Oligofructose using Continuous Culture. FEMS Microbiol. Lett., 118: Gilliland S.E., S.S. Reilly, G.B. Kim, and H.S. Kim (2002). Viability During Storage of Selected Probiotic Lactobacilli and Bifidobacteria in a Yogurtlike Product. Food Microbiology and Safety, Vol. 67, Nr. 8, Goldman, B.S., Domingo A. Barrado, B.S., Norma Balcarce, M.D., Eduardo Cueto Rua, Ph.D., Masaru Oshiro, M.D.d, María L. Calcagno, B.S., Mariana Janjetic, B.S., Julián Fuda, Ricardo Weill, B.S., María J. Salgueiro, B.S., Mauro E. Valencia, Ph.D., Marcela B. Zubillaga, Ph.D., and José R. Boccio, Ph.D.(2006). Effect of a probiotic food as an

118 adjuvant to triple therapy for eradication of Helicobacter pylori infection in children, Nutrition 22 : Gonzàlaz,CJ.,Encinas,JP.,Garcia-Lopez,ML.,Otero,A.(2000). Characterization and identification of lacic acid bacteriafrom fresh water fishes. Food Microbiol 17: Gorner.F., Palo,V. et Bertan,M.(1968).Changes of the content of volatile substances during ripening of yoghurt. Milchwissenschaft.; 23(2) : Gournier-Chateau N, Larpent JP, Castellanos MI, Larpent JL (1994). Les probiotiques en alimentation animale et humaine. Lavoisier, Technique et Documentation (ed). Paris, France, Greenberg,N.A. et Mahoney,R.R. (1982). Production and characterization of B-galactosidase from Streptococcus therrnophilus. Journal of Food Science.47: Gueimonde, M., Delgado, S., Mayo, B., Ruas-Madiedo, P., Margolles, A. and De los Reyes-Gavilan, C.G. (2004). Viability and diversity of probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium populations included in commercial fermented milks. Food Research International 37, Hadadji M. (2007).Caractérisation biochimique, et microbiologique des bifidobactéries et leurs utilisations en biotechnologie. Thèse de doctorat d état Es-Sciences, département de biologie, faculté des sciences, Université d Oran, Algérie. Hadaji M, and Bensoltane A (2006). Growth and lactic acid production by Bifidobacterium longum and Lactobacillus acidophilus in goat s milk. AJB Vol. 5/(6), Hassinen, J. B., G. T. Durbin, R. M. Tomarelli, and F. W. Bemhart. (1951). The minimal nutritional requirement of Lactobacillus bifidus. Journal. Bacteaiology. 62:

119 Hidvegi E, Arato A, Cserhati E, Hovath C, Szabo A.(2003). Shight decrease in bone mineralization in cow milk sensitive children. Journal pediatric gastroenlogy nutrition.36: Holzapfel, W. H., Haberer, O., Snel, J., Schillinger, U., & Huis in t Veld, J. H. J. (1998). Overview of gut flora and probiotics. International Journal of Food Microbiology, 41, Holzapfel. Wilhelm Hl, Petra Haberer, Rolf Geisen, Johanna Björkroth, and Ulrich Schillinger(2001). Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food and nutrition. American Journal of Clinical Nutrition,73(suppl):365S 373S. Hopkins, M.J., Cummings, J.H. and Macfarlane, G.T. (1998). Inter-species differences in maximum specific growth rates and cell yields of bifidobacteria cultured on oligosaccharides and other simple carbohydrate sources, Journal Appllied Microbiology. 85, Hughes, D. B., and D. G. Hoover. (1991). Bifidobacteria-their potential for use in American dairy products. Food Technol. 45(4):75. Hutkins RW.2001.Metabolism of starter culture.in: Marth EH, Steele TL, editors Applied dairy microbiology.2 nd New york,ny: Marcel Dekker, Inc, p Ibrahim. S. A and J P Carr.(2006). Viability of bifidobacteria in commercial yogurt products in North Carolina during refrigerated storage. International Journal of Dairy Technology, Vol 59, No 4 November; Isolauri E, Rautava S, Kalliomaki M, Kirjavainen P, Salminen S. (2002). Role of probiotics In Probiotic research: learn from the evidence Allergy, 57: Iwata M. and Morishita T.(1989). The presence of plasmids in Bifidobacterium breve. Lett. Appl. Microbiol. 9:

120 Jayamanne, V. S., & Adams, M. R. (2006). Determination of survival, identity and stress resistance of probiotic bifidobacteria in bioyoghurts. Letters in Applied Microbiology, 42, Jouve J.L.(1996). La qualité microbiologique des aliments maîtrise et critères, 2 ème édition. Polytechnica, Paris.P 18. Juillard V, et Richard J, (1994). Mixed culture in milk of proteinase-positive and proteinase negative variant of lactococcus lactis subsp. Lactis Influence of initial percentage of proteinase positive cells on the growth parameters of each strain and on the rate of acidification. Lait 74: Kailasapathy, K. and Rybka, S. (1997). L. acidophilus and Bifidobacterium spp. their therapeutic potential and survival in yoghurt. Aust J Dairy Technol 52, Kaplan H. and Hutkins R.(2000). Fermentation of fructooligosaccharides by lactic acid bacteria and bifidobacteria. Applied Environnent Microbiology 66: Kneifel, W., Jaros, D., et Erhard, F. (1993).Microflora and acidification properties of yogurt and yogurt-related products fermented with commercially available starter cultures. Int. J. Food Microbiol. 18: Krockel,L.,Schilinger,U.,Franz,CM.,Bantleon,A.,Ludwig,W.(2003). Lactobacillus versmoldensis sp.nov., isolated from raw fermented sausage Int.J.Syst.Evol.Microbiol.53: Labell,F.(1989). Yogurt cultures offer health benefits(1989). Biotechnology to transform the yogurt of the future. Food Processing.: 50: Lamoureux.L.(2000).Exploitation de l activité B-galactosidase de cultures de bifidobactéries en vue d enrichir des produits laitiers en galactooligoshacharides ; Mémoire M.Sc. l'université Laval Canada.

121 Lamoureux L., Roy D., Gauthier S.F.,(2002). Production of oligosaccharides in yogurt containing bifidobacteria and yogurt cultures. J. Dairy Sci. 85: Lauer. E, Kandler.O, (1976). Mechanismus der Variation der Verhâltnisses AcetaVLactat bei der Verqârunq von Glucose durch Bifidobakterien. Arch Mikrobiol,10: Laye,l., Karleskind,D. et MorrC.V.(1993).Chernical, microbiological and sensory properties of plain nonfat yogurt. Journal of Food Science.; 58(5): Lesbros-Pantoflickova.D, Corthesy-Theulaz I, BlumAL (2007). Helicobacter pylori and probiotics. Journal of nutrition 137(suppl 2): S812-S818. Leuschner, R. G. K., Bew, J., Simpson, P., Ross, P. R., & Stanton, C. (2003). A collaborative study of method for the enumeration of probiotic bifidobacteria in animal feed. International Journal of Food Microbiology, 83, Lilly,D.M. et Stillwell,R.H.(1965). Probiotics : Growth-promoting factors produced by microorganisms. Science.; 147: Lourens-Hattingh A, Viljoen BC.(2001). Review: Yoghurt as probiotic carrier food. Int Dairy J 11: Mahaut M, Jeatet R, Schck P, Brule G (2000). Les produits industriels laitiers, Ed Tec et Doc, France, p : Mahi M, Yagoubi A, Rouissat L, Tabak S, Medouakh L and Bensoltane A (2006). Growth, viability and acidifying activity of bifidobacteria in goat s milk. Egypt. J. App Sci. 21: (3), Mangin I, Bouhnik Y, Bisetti N, Descaris B (1999). Molecular monitoring of human intestinal bifidobacterium strain diversity.res Microbiol, 150:

122 Marchal N, Bourdon J, and Richard C.L (1991). Les milieux de culture pour l isolement et l identification biochimique des bactéries. Ed.Doin P Martin J.H, et Chou K.M, (1992). Selection des bifidobacteria for use as Dietary adjuncts in cultured dairy food: I-Tolerance to ph of yoghurt Cultured. Dairy product J 27(4) : Martinez-Villaluenga Cristina, Rosario Gomez ;(2007).Characterization of bifidobacteria as starters in fermented milk containing raffinose family of oligosaccharides from lupin as prebiotic.international Dairy Journal, 17: Masco, L., Van Hoorde, K., De Brandt, E., Swings, J., & Huys, G. (2006). Antimicrobial sysceptibility of Bifidobacterium strains from humans, animals and probiotic products. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 58, Masco, L., Huys, G., de Brandt, E., Temmerman, R., & Swings, J. (2005). Culture-dependent and culture-independent qualitative analysis of probiotic products claimed to contain bifidobacteria. International Journal of Food Microbiology, 102, Matsumoto, M., Ohishi, H. and Benno, Y. (2004). H+-ATPase activity in Bifidobacterium with special reference to acid tolerance. International Journal Food Microbiology 93, Matsuzaki T, Takagi A, Ikemura H, et al. (2007). Intestinal microflora: probiotics and autoimmunity. Journal Nutrition 137(suppl 2): S Matteuzzi, D., Crociani, F., & Brigidi, P. (1983). Antimicrobial susceptibility of Bifidobacterium. Annales de Microbiologie (Paris), 134A, Mattila-Sandholm T, Myllarinen P, Crittenden R, Mogensen G, Fonden R, Saarela M (2002). Technological challenges for future probiotic foods. Int. Dairy J. 12:

123 Meile L., Ludwig W., Rueger U., Gut C., Kaufmann P., Dasen G., Wenger S. and Teuber M. (1997). Bifidobacterium lactis sp.nov., a moderately oxygen tolerant species isolated from fermented milk. System. Appl. Microbiol., 20: Melton,LJ., Crowson,CS, O Fallon,WM, Wahner, HW and Riggs, BL, 2003.Relative contributions of bone density,bone turnover and clinical risk factors to long-term fracture prediction. Journal Bone and Mineral Research.18:p Mercenier A,Pavan M and Pot B. (2002). Probiotics as biotherapeutic agents: Present knowledge and future prospect. Current pharmaceutical design.8: Metchnikoff E. (1907). Lactic acid as inhibiting intestinal putrefaction. In: The prolongation of life: Optimistic studies. W. Heinemann, London: Mitsuoka T.(1984).Taxonomy and ecology of Bifidobacteria. Bifidobacteria flora.3, Modler, H.W. (1994). Bifidodogenic Factors-Sources, Metabolism and Applications. Int. Dairy J., 4: Modler HW, McKellar RC, Yaguchi M (1990) Bifidobacteria and bifidogenic factors. Can. Inst. Food Sci. Technol. J. 23: Moubareck, C., Gavini, F., Vaugien, L., Butel, M.J., Doucet-Populaire, F., (2005). Antimicrobial susceptibility of bifidobacteria. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 55, Nagengast, F. M., Hectors, M. P. C., Buys, W. A. M., et van Tongeren, J. H. M.(1988). Inhibition of secondary bile acid formation in large intestine by lactufose in healthy subjects of two different age group. Eur. J. Clin. Inves. 18: Nilson, (1973). yoghurt - a review of the product and its manufacture. International Journal of Dairy Technology 28 (3),

124 NYA National Yoghurt Association. (2003) USA Available website at Olga Cueva, Kayanush J. Aryana (2007). Quality attributes of a heart healthy yogurt. Society of Food Science and Technology,21: Ouoba Labia Irene Ivette, Vicki Lei, Lars B Jensen.(2008). Resistance of potential probiotic lactic acid bacteria and bifidobacteria of African and European origin to antimicrobials: Determination and transferability of the resistance genes to other bacteria. International Journal of Food Microbiology 121: Ouwehand AC, Salminen SJ (1998). The health effects of cultured milk products with viable and non-viable bacteria. Int. Dairy J. 8: Ouwehand. A.C.(2007). Antiallergic effects of probiotics. J Nutr 137(suppl 2): S794-S797. Patel, J. R., Dave, R. I., Sannabhadti, S. S., et Dave, J. M.(1991). Use of bifidobacteria in fermented dairy products. Indian Daj.man.43 : Payne, J. F., Morris, A. E. J., & Beers, P. (1999). Evaluation of selective media for the enumeration of Bifidobacterium sp. in milk. Journal of Applied Microbiology, 86, Pelletier Jean-François, Jean-Michel Faurie, Alan François and Philippe Teissier (2007). Lait fermenté : la technologie au service du goût, International Journal of Dairy Technology, Volume 42, Supplement 2, Pages Pessi T, Sutas Y, Saxelin M, Kallioinen H, Isolauri E. (1999) Antiproliferative effects of homogenates derived from five strains five of candidate probiotic bacteria. Appl environ Microbio, 65 : Picard.C, J. Fioramonti_, A. Francois, T. Robinson, F. Neant & C. Matuchansky.(2005). bifidobacteria as probiotic agents physiological effects and clinical benefits. Aliment Pharmacol Ther.22:

125 Pilet M.F, C Magras et M Federighi (1998).Bactéries lactiques. p : In Sutra,L., Jouve,JL Manuel de bactériologie alimentaire polythechnica,paris. Piquet M.-A, R. Gloro, A.-M. Justum, J.-M. Reimund (2007).Les probiotiques, des outils thérapeutiques pour moduler les effets biologiques de la flore intestinale : une introduction. Springer Obes. 2: Pulusani SR, Rao DR, Sunki GR (1979). Antimicrobial activity of lactic cultures: partial purification and characterization of antimicrobial compound(s) produced by Streptococcus thermophilus. J Food Sei 44 p Rash,K Compositional elements affecfing flavor of cultured dairy foods. Journal of Dairy Science. 73(12): Rasic J, Curcic R, Stojsavljevic T, Obradovic B (1971).A study on the amino acids of yoghurt. Milchwissenschaft 26, Rasic,J.Li. et Kurmann,J.A Yoghurt, Scientific grounds, technology,manufacture and preparations.in exploitation de l activitébgalactosidasede culture de bifidobacteries en vue d enrichir des produits laitiers en galacto-oligosacharides. Rasic, J.Lj. et Kurmann,J.A.(1983). Bifidobacteria ant their role. Microbiological, nutritional-physiological, medical and technological aspects and bibliography. Birkhauser Verlag, Basel, Suisse. Rasic, J. Lj. et Sad, N. (1990).Culture media for detection and enurneration of bifidobacteria in fermented miks products. Bull. IDF (International Daky Federation),252: Roberfroid M (2007). Prebiotics: the concept revisited. Journal of Nutrition 137(suppl 2): S Roberfroid MB (2000). Prebiotics and probiotics: are they functional foods. Am J Clin Nutr 71(suppl): S16-S27.

126 Robinson RK, Tamime AY, Wszolek M Microbiology of fermented milks. In : Robinson RK, editor. Dairy microbiology handbook ; the microbiology of milk and milk products.third edition.new York:John Wiley and Sons, Inc.p Romond M.B, Romond C, and Izard D in Hermier J, Lenoir J et Weber F (1992). Les groupes microbiens d interet laitiers. Ed Tec Et Doc.Paris Romond, A. F. et Romond, M. B.(1989). Intérêt de l'apport d'un lait fermenté à Bifidobacterium longum dans les diarrhées à rotavirus du nourrisson. Bifdobacterim et santé; 1989 Juin Juin 9; Faculté de médecine, Paris, France. Ludres, France: Association pour la recherche sur les bifidobactéries et les bactéries anaérobies, Roy,D. (2005 ).Technological aspects related to the use of bifidobacteria in dairy products, Lait ;85: Roy, D., Mainville, I., et Mondou, F.(1998). Selective enumeration and survival of bifidobacteria in fiesh cheese. Int. Dair J. 7: Roy,D., Mainville,l. et Mondou.F. (1997). Bifidobacteria and their role in yoghurt related products. Micro ecology and Therapy,; 26: Roy D (2001). Media for the isolation and enumeration of bifidobacteria in dairy products. International Journal of Food Microbiology 69: Salminen S, Ouwehand AC, Benno Y, Lee YK (1999). Probiotics: How should they be defined? Trends Food Sci. Technol. 10: Salminen S, Saxelin M (1996). Comparison of successful probiotic strains. Nutr. Tod. Sup. 31: Scardovi, V. (1986) Genus Bifidobacterium. In Bergey s Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2 ed. Sneath, P.H.A., Mair, N.S., Sharpe, M.E. and Holt, J.G. pp Baltimore, MD: Williams and Wilkins.

127 Scardovi, V. (1984). Genus Bifidobacterium. Orla-Jensen. In Bergey s Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 1. ed. Kreig, N.R. and Holt, J.G. pp Baltimore, MD: Williams and Wilkins. Scardovi, V. and Trovatelli, L.D. (1965). The fructose-6-phosphateshunt as peculiar pattern of hexose degradation in the genus Bifidobacterium. Annali di Microbiologia 15, Schaafsma,G., Meuling,W.J.A., Van Dokkum.W. et Bouley,C.(1998). Effects of a milk product, fermented by Lactobacillus acidophilus and with fructooligosaccharides added, on blood lipids in male volunteers. European Journal of Clinical Nutrition. 52(6): Schell ma, karmirantzou M, Snel b, Vilanova D, Berger B, Pessi G, Wahlen MC, Desiere F, Bork P, Delly M, Primore RD, Arigoni F., (2002).The genom sequence of Bifidobacterium longum reflects its adaptation to the human gastrointestinal tract.proc natl acad sci usa 99: Schrezenmeir, J., & de Vrese, M. (2001). Probiotics, prebiotics and synbioticsapproaching a definition. American Journal of Clinical Nutrition, 73, 361S 364S. Schulz,M.E., Voss,E., et Kley,W.(1954). Studies on the adaptability of the acetaldehyd colour reaction for testing yoghurt. Milchwissenschaft. 9: Sebald, M; Gasser, F, et Werner, H.(1965). DNA base composition and classification. Application to group of bifidobacteria and to related genera. Ann. Institut de Pasteurl09:SS Sendra Esther,Patricia Fayos, Yolanda Lario, Juana Fernandez-Lopez, Estrella Sayas-Barbera, Jose Angel Perez-Alvarez. (2008). Incorporation of citrus fibers in fermented milk containing probiotic bacteria. Food Microbiology.25: Sgorbati, B., V. Scardovi et D. J. Leblanc. (1982). Plasmid in the genus Bifidobacterium. J. Gen. Microbiol. 128 :

128 Shah, N.P., (1997). Isolation and enumeration of bifidobacteria in fermented milk products: a review. Milchwissenschaft 52, Shah NP. (2000). Probiotic bacteria: Selective enumeration and survival in dairy foods. Journal of Dairy Sciences 83(4): Shewmaker,PL., Steigerwalt,AG., Morey, RE., Carvalho, MDG., Elliot,JA., Joyce, K., Barret, TJ.(2004). Vagococcus carniphilus sp.nov., isolated from ground beef. Int.J.Syst.Evol.Microbiol 54: Shimamura S., Abe F., Ishibashi N., Miyakawa H., Yaeshima T., Araya T., Tomita M.,(1992). Relationship between oxygen sensitivity and oxygen metabolism of Bifidobacterium species, J. Dairy Sci. 75 ; Shin, H., Lee, J., Pestka, J.J. and Ustunol, Z. (2000). Viability of bifidobacteria in commercial dairy products during refrigerated storage. J Food Prot 63, Simons LA, Amansec SG, Conway P.(2006). Effect of Lactobacillus fermentum on serum lipids in subjects with elevated serum cholesterol. Nutr Metab Cardiovasc Dis 16: Simpson P.J., Stanton C., Fitzgerald G.F. and Ross R.P Genomic diversity and relatedness of bifidobacteria isolated from a porcine cecum. J. Bacteriol. 185: Sonoike, K., Mada, M., et Mutai, M. (1986).Selective agar medium for counting viable cells of bifidobacteria in fermented rnilk. J. Food Hyg. Soc. Jap. 27: Stiles,ME., Holzapfel,(1997). Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy. Int.J.Food Microbiol.36:1-29. Syndifrais Mission scientifique (1997).Yaourts, laits fermentés, Lait 77, Tabak S, L Medouakh, M Adda, A Chekroun, K Krantar and Bensoltane A (2007). Interaction between Helicobacter Pylori responsible for

129 diseases gastro duodenales and Bifidobacteria. Egypt of appl sci 22(12a) 73. Tabasco.R, T. Paarup, C. Janer, C. Pelaez, T. Requena (2007). Selective enumeration and identification of mixed cultures of Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus, L. paracasei subsp. paracasei and Bifidobacterium lactis in fermented milk. International Dairy Journal.23: Takiguchi, R. and Suzuki, Y. (2000). Survival of lactic acid bacteria in simulated digestive juice. J Intest Microbiol 14, Talwalkar, A. and Kailasapathy, K. (2003). Metabolic and biochemical responses of probiotic bacteria to oxygen. J Dairy Sci 86, Talwalkar, A., & Kailasapathy, K. (2004). Comparison of selective and differential media for the accurate enumeration of strains of Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium spp. and Lactobacillus casei complex from commercial yoghurts. International Dairy Journal, 14, Tamime, A. Y., & Robinson, R. K. (1999). Yogurt science and technology. (2nd ed.). Cambridge: Woodhead Publishing Ltd., p Tamime,A.Y., Marshall,V.M.E. et Robinson,R.K.(1995). Microbiological and technological aspects of rnilks fermented by bifidobacteria. Journal of Dairy Research, 62(1): Tamime A. Y. (1975). yoghurt - a review of the product and its manufacture. International Journal of Dairy Technology,28 (3), Tamura,Z.(1983). Nutriology of bifidobacteria. Bifidobacteria and Microflora. 2(1): Taniguchi M, Kotani N, Kobayashi T (1987). High-concentration cultivation of Bifidobacterium longum in fermenter with cross-flow filtration. Appl. Microbiol. Biotechnol. 25: Tannock, G.W., (1997). Probiotic properties of lactic-acid bacteria: plenty of scope for fundamental R & D. Trends Biotechnol, 15,

130 Teraguchi, S., Uehara, M., Ogasa, K., Mitsuoka, T., (1978). Enumeration of bifidobacteria in dairy products. Japonese. Journal of Bacteriology. 33, Tersaghi B. E. and Sandine W. E. (1975). Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophage. Appl. Environ. Microbiol., 29: Tharmaraj, N., Shah, N.P.,(2003). Selective enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacteria, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, and Propionibacteria. J. Dairy Sci. 86, Tissier, H. (1900). Recherches sur la flore intestinale des nourrissons (Etat normal et pathologique). Thesis, ed. Georges Carre et C.Maud, University of Paris (medecine)[fr], Paris, France, pp Toba,T., Tomita,Y., Itoh,T. et Adachi,S B-galactosidase of lactic acid bacteria : Characterization by oligosaccharides formed during hydrolysis of lactose. Journal of Dairy Science. 64(2): Tojo, M., Oikawa, T., Morikawa, Y., Ymashita, S., Iwata, S., Satoh, J., Hanada, J., et Tanaka, R.(1987). The effects of Bifidobacterium breve administration on Campylobacter enteritis. Acta Paediatr.Jpn, 29: Vandamme P., Pot B., Gillis M., de Vos P., Kersters K. and Swings J.(1996). Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiology Revues. 60: Vanden broek B Hinz S.W.A, Beldman.G, Doeswijk-voragen C.H.L, Vinchen J.P Voragen A.G.J (2005). Glycosyl hydrolases from bifidobacterium adolescentis dsm, lait 87: Van de Casteele, S., Vanheuverzwijn, T., Ruyssen, T., Van Assche, P.,Swings, J., & Huys, G. (2006). Evaluation of culture media for selective enumeration of probiotic strains of lactobacilli and

131 bifidobacteria in combination with yoghurt or cheese starters. International Dairy Journal, 16, Van de Water,J., Keen,C.L. et Gershwin,M.E.(1999). The influence of chronic yogurt consumption on immunity. Journal of Nutrition. 1999; 129: Ventura Marco., Douwe van Sinderen., Gerald Fitzgerald., and Ralf Zink (2004). Insights into the taxonomy, genetics and physiology of bifidobacteria. Antonie van Leeuwenhoek 86: Vidal-Valverde C, Martin-Villa C, Herranz J (1984). Determination of soluble carbohydrates in yogurts by high performance liquid chromatography. J Dairy Sci 67, Vinderola CG, Mocchiutti P, Reinheimer JA (2002). Interactions among lactic acid starter and probiotic bacteria used for fermented dairy products. J. Dairy Sci. 85: Wehkamp J, Schauber J, Stange EF (2007). Defensins and cathelicidins in gastrointestinal infections. Curr Opin Gastroenterol 23: Werner, H., Gasser, F, et Sebald, M.(1966). DNA-Basenbestimmungen an 28 Bifidus Sthunen und Ansthmen Morphologish Ahnlicher GaMinger. Zbl. Bak. 1.Brig. 198S : Wijsman MR, Hereijgers JLPM, Groote JMFH (1989). Selective enumeration of Bifidobacteria in fermented dairy products. Neth Milk Dairy J 43, Yeung, P. S. M., Sanders, M. E., Kitts, C. L., Cano, R., & Tong, P. S. (2002). Species-specific identification of commercial probiotic strains. Journal of Dairy Science, 85, Yildirim, Z., Johnson, M.G., Characterization and antimicrobial spectrum of bifidocin B, a bacteriocin produced by Bifidobacterium bifidum NCFB Journal of Food Protection 61,

132 Yildirim, Z., Winters, D.K., Johnson, M.G., Purification, amino acid sequence and mode of action of bifidocin B produced by Bifidobacterium bifidum NCFB 1454.Journal of Applied Microbiology 86, Yuguchi, H., Hiramatsu, A., Doi, K., Idach, et Okogoni, S. (1989).Studies on the flavor of yogurt fermented with Bifidobacteria: Signifiame of volatils components and organic acids in the sensory acceptance of yogurt. Jpn J. Zootech Sci.; 60: Zhang Heping, Jie Xu, Junguo Wang, Menghebilige, Tiansong Sun, Haiping Li, Mingruo Guo (2008). A survey on chemical and microbiological composition of kurut, naturally fermented yak milk from Qinghai in China, Food Control 19 : Zhou. J.S, C.J. Pillidge, P.K. Gopal, H.S. Gill (2005). Antibiotic susceptibility profiles of new probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium strains ; International Journal of Food Microbiology 98 (2005)

133 Composition des milieux des cultures utilisées dans notre étude : Milieu MRS (De Man Rogosa., 1960) Polypeptone 10g Extrait de levure 4g Extrait de viande 8g Acétate de sodium 5g Citrate de sodium 2g Glucose 20g KH2PO4 2g MgSO4.7H2O 0.2g MnSO4.4H2O 0.05g Tween 80 1ml Eau distillée 1000 ml Pour milieu gélosé ajouté 20 g d Agar Avec un ph= Chlohydrate de cystéine pour les Bifidobacterium et ph= 5.2 pour les lactobacillus Autoclavage à 120 C pendant 20 minutes. Milieu MRS-Raff modifiée ( Tabasco et al., 2007) Polypeptone 10g Extrait de levure 4g Acétate de sodium 5g Citrate de sodium 2g Rafinose 15g Chlohydrate de cystéine 0.5g Chlorure de lithium 0.3g KH2PO4 2g MgSO4.7H2O 0.2g MnSO4.4H2O 0.05g

134 Tween 80 1 ml Eau distillée 1000 ml Pour milieu gélosé ajouté 20 g d Agar agar ph= 6.8 Autoclavage à 120 C pendant 20 minutes Milieu M17 (Terzaghi et sadina., 1975) Peptone trypsique de caseine 10g Peptone pepsique de viande 2.5g Peptone de soja 5g Extrait de levure 2.5g Extrait de viande 5g MgSO4.7H2O 0.25g Lactose 5g Acide ascorbique 0.50 Agar 20g Eau distillée 1000 ml ph=6.9 autoclavage à 120 C pendant 20 minutes. Lait écrémé UHT Candia silhouette Eau Poudre de lait écrémé Vitamines C E B1 B6 B9 D Vitamine E 0.13 mg/100ml Vitamine B mg/100ml Vitamine B mg/100 ml Vitamine B9 7µg/100ml

135 Lait écrémé préparé Poudre de lait écrémé 10g Extrait de levure 0.5g Eau distillé 100 ml ph= 7 autoclavage 110 C pendant 10 mn Eau physiologique Chlorure de sodium 8.5g Peptone 0.5 g Eau distillé 1000ml ph= 7 Autoclavage à 120 C pendant 20 minutes. Milieu Désoxycholate (Institut de pasteur Algérie) Peptone 10g Chlorure de Sodium 5g Phosphate dipotassique 2g Citrate de sodium 1g Citrate ferrique 1g Lactose 10g Désoxycholate de sodium 1g Rouge neutre 0.03g Agar 15g Eau distillée 1000 ml ph= 7.3

136 Eau peptonée exempte d indole (Institut de pasteur Algérie) peptone exempte d indole 10g Chlorure de sodium 5g ph= 7.2 Autoclavage à 120 C pendant 15 mn Milieu VBL (Bouillon lactosé au vert brillant) (Institut de pasteur Algérie) Peptone 10 Bile de bœuf 20 Lactose 10 Vert brillant Eau distillée 1000 ml ph= 7.4 Milieu SS Salmonella-Shigella ( Institut de pasteur Algérie) Peptone 5g Extrait de viande 5g Sels biliaires 4.2g Citrate de sodium 10g Thiosulfate de sodium 8.5g Citrate de fer 2g Lactose 10g Rouge neutre 0.025g Vert brillant g Agar 15 g Eau distillée 1000 ml ph = 7.3

137 Milieu de Chapman (Institut de pasteur Algérie) Peptone 10g Extrait de viande 1g Chlorure de sodium 75g Mannitol 10g Rouge de phénol 0.025g Agar 15g Eau distillée 1000 ml Milieu urée-indole (Institut de pasteur Algérie) Tryptophane 3g Phosphate monopotassique 1g Phosphate dipotassique 1g Chlorure de sodium 5g Urée 20g Alcool à ml Rouge de phénol 25 mg Eau distillée 1000 ml Réactif Kovacs (Institut de pasteur Algérie) Diméthyl-amino-4-benzaldéhyde 50g Acide chlorydrique pur 250 cm Pentanol 750 cm