MRI FORMATION. Nicole Lautrédou, MRI-IURC, Montpellier

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1 MRI FORMATION Nicole Lautrédou, MRI-IURC, Montpellier

2 Formation théorique #1 Anatomie d'un microscope Public : n chercheurs ou ITA sciences du vivant Durée : 4h - Introduction : microscope à champ plein (présentation d'un microscope, vue générale de ses composants). - Eclairage (propriétés de la lumière, lampes halogène et mercure, LASERs) - Le tube optique (éclairage de Köhler, interêt) - Condenseur (rôle, diaphragme de champ et d'ouverture) - Les objectifs (caractéristiques principales, grossissement, ouverture numérique, limites de résolution axiale et latérale, diffraction, correction des aberrations) Mélanie Franco, CRBM, Montpellier - Les oculaires (grossissement) - Caméras CCD (fonctionnement résolution, compromis vitesse d acquisition/résolution) - Principe de l épifluorescence - Imagerie en transmission (Contraste de phase, fond noir, contraste interférentiel/dic/nomarski) Mathieu Gabut, IGMM, Montpellier - Autres configurations en microscopie photonique types de microscopes - microscope à champ plein inversé - microscope confocal ( point par point ou Nipkow/spinning disk) - microscope bi-photonique

3 Formation pratique #1 Technique d immunofluorescence en biologie cellulaire (biologie animale) Public : 5/6 chercheurs ou ITA en Sciences du vivant Durée : 1,5 journée Objectifs : Connaître la technique d immunofluorescence en biologie cellulaire (cellules animales), ses avantages, ses limitations. - Aperçu des principales étapes de l immunifluorescence - Les différents types de fixateurs et leur impact sur le résultat - Critères de choix des anticorps primaires et secondaires, des fluorochromes, du milieu de montage - En parralèle, Immunofluorescence sur cellules animales, coloration de l ADN, des microtubules et de l actine. - Analyse de résultats sur un microscope confocal (ne comprend pas la formation à l utilisation du microscope). - Discussion informelle sur certains cas particuliers des utilisateurs Marie-Laure Parmentier, IGF, Montpellier Nicole Lautrédou, MRI-IURC, Montpellier

4 Formation pratique #2 Technique en histo-cytologie et anatomie végétale Public : 10 chercheurs ou ITA en Sciences du vivant Durée : 4 journées Objectifs : Utiliser un microscope (lumière transmise et fluorescence), choisir, réaliser et interpréter sa coloration en fonction de sa problématique. Acquérir des bases en anatomie végétale. Découvrir l intérêt de l anatomie comparative chez les végétaux. * Jour1 : le microscope et ses applications - Description, principaux réglages et entretien du microscope - Contraste de phase, Nomarski, fond noir, fond clair, épifluorescence. - Acquisition (photographie argentique, photographie numérique). * Jour2 : préparation des échantillons - Spécificité de l histologie végétale - Fixation, déshydratation, inclusions en paraffine, en résine (glycol méthacrylate) (avantages et inconvénients respectifs). - Les échantillons végétaux récalcitrants aux inclusions (caractéristiques, traitements) - La réalisation des coupes au microtome - Fluorochromes spécifiques utilisés en biologie végétale (Nile Red lipides, Calcofluor cellulose, DAPI noyaux, IP paroi et noyaux, réactif de Neu polyphénols, etc ) * Jour3 : anatomie végétale - Les tissus végétaux ( leurs principales caractéristiques et leurs fonctions). - Structure des principaux organes végétaux (tiges, racines, feuilles et fleurs) - Reconnaissance d organes et de tissus sur lame - Etude de la ramification de la racine (origine cellulaire et structure des racines secondaires), néoformation de racines (observation de coupes plantes herbacées et plantes ligneuses - Anatomie comparée, relations structure / fonction, relations structure / adaptation à différents milieux et biotopes * Jour4 - Choix et spécificité des colorations, topologiques, histochimiques - Notions d histo-enzymologie : localisation d activités enzymatiques sur coupes

5 Formation pratique #3 Microscopie de fluorescence Public : 5 chercheurs ou ITA en Sciences du vivant Durée : 4h Objectifs : Connaître la technique d épifluorescence adaptée à un microscope droit à champ plein, être à même de prendre des images 2 et 3D à partir d'échantillons fixés des utilisateurs. Prérequis : suivre formation théorique #1 - Mise sous tension - Identifier les différents éléments du microscope - Choisir son objectif en fonction de ses besoins, grossissement utile et résolution latérale - Choisir les filtres d'excitation et d'émission, bleed-through - Module acquire du logiciel metamorph (temps d'exposition, binning, mode autoscale, saturation de l'image, encodage de l'image 8 ou 12bits, vitesse de lecture, gain ADC). - Acquisition fleuve (Stream acquisition) - Acquisition 3D, résolution axiale, sous-échantillonage et suréchantillonage Julien Cau, MRI-CRBM, Montpellier Liliana Krasinska, CRBM, Montpellier

6 Formation pratique #4 Microscopie confocale Public : 5 chercheurs ou ITA en Sciences du vivant Durée : 1 journée Objectifs : Utiliser un microscope à épifluorescence confocal (LSM510 META). Acquérir des images 2 et 3D à partir d'échantillons fixés (apportés par les utilisateurs). Prérequis : suivre formation théorique #1 - Mise sous tension - Identifier les différents éléments du microscope - Comprendre le fonctionnement d un microscope confocal, taille du pinhole, avantage en résolution axiale et latérale. Loïc Deleyrolle, INM, Montpellier - Detection de l image via les PMT (gain, offset) - Compromis vitesse de balayage/qualité de l image, moyennage, résolution. - Comprendre pourquoi le microscope confocal apporte une meilleure résolution latérale (et axiale) s il est bien utilisé - Modes simultanés ou séquentiels (single track/multitrack), avantages et désavantages Chadi Soukkarieh, INM, Montpellier - Mode spectral (les différents modes, mis en oeuvre sur le LSM510 META)

7 Formation pratique #5 Microscopie confocale en biologie végétale. Public : x chercheurs ou ITA en Sciences du vivant. Durée : 3.5 jours Objectifs : Connaître et utiliser un microscope à confocal * Jour 1 : Aspects théoriques du microscope confocal à épifluorescence -Le microscope confocal : principes et applications en biologie végétale - Fluorescence et fluorochromes - Préparation des échantillons biologiques pour la microscopie confocale - Objectifs à longue ou courte distance de travail, à immersion, plongeant : lequel choisir? * 1/2 Journée 2 : (séance théorique et pratique) - Leica SP2, Biorad 1024, Zeiss LSM 510 Meta : quel microscope confocal choisir? * Jour 3 : Séminaires d application et manipulations (séances pratiques) * Jour 4 : autres applications en microscopie à fluorescence - FRAP, FLIP, FRET, FLIM, SNOM etc.... quand la «simple» microscopie confocale ne suffit pas. (séance théorique) - Microscopie confocale et déconvolution spectrale (séance pratique) Julie Petit, UMR1096 PIA, Montpellier

8 Formation pratique #6 Imagerie du vivant Public : 5 chercheurs ou ITA en Sciences du vivant Durée : 8h Objectifs : Maîtriser l imagerie de cellules vivantes par épifluorescence et transmission à débit normal ou moyen débit (les cellules sont fournies par les utilisateurs). Prérequis : suivre formation pratique #2 Jean-Michel Saffin, IGH, Montpellier - Réglage des différents éléments du DIC /nomarski - Optionnel : réglage du HMC/LMC - Timelapse multichannel sur une position - Reconstruction mosaïque - Mise sous tension d un poste moyen débit - Mise sous tension d un poste de fluorescence - Identifier les différents éléments du microscope - Identifier les compromis nécessaires permettant la survie des cellules à observer - Centrage des différents éléments du contraste de phase. - Timelapse en contraste de phase sur une position - Timelapse moyen débit sur plaque 6-12 puits en mode multiposition Sophie Maire, IGMM, Montpellier

9 Formation pratique #7 Fonctions de présentation du logiciel metamorph Public : chercheur ou ITA sciences du vivant Durée : 4h Objectifs : utiliser les différentes fonctionnalités du logiciel Metamorph pour la présentation des images. - Création de piles 2D+t ou 3D d images - Manipulation de l'image (contraste, niveaux, rotation, zoom) - Alignement, combinaisons d'images - vues orthogonales de piles d images - Kymographes - Anotation des images (temps, calibration) - Fabrication de films 00:00 00:15 00:30 00:45 Fluorescence (membrane) Protrusion Rétraction Julien Cau, MRI-CRBM, Montpellier

10 Formation pratique #8 Fonctions d analyse du logiciel metamorph Public : 7 chercheurs ou ITA sciences du vivant Durée : 4h Objectifs : utiliser les différentes fonctionnalités du logiciel Metamorph pour l analyse 2D quantitative et la détection automatique d objets (Morphométrie). - Mesures de surfaces, d'intensités, de vitesses, seuillage. - Stockage des mesures - Opérations binaires, masques - Ratio, soustractions d'images - Morphometrie : détection automatique d objets, mesures. Cécile Travo, INM, Montpellier

11 Formation pratique #9 Visualisation 3D/4D avec le logiciel Imaris Public : 7 chercheurs ou ITA sciences de la vie Durée : 4h Objectifs : Présenter et analyser (mesures volumétriques, mesures d intensités, colocalisation) des images en 3D/4D - Manipulation des objets en 3D/4D (conversion z t, seuillage, soustraction de bruit) - Visualisation des plans orthogonaux, mode extended - Mesures de distance en 3D - Rendu pseudo-3d et projections - Visualisation en 3D, mode isosurface (représentation, clipping planes) - Quantifications (mesures volumétriques, d intensités, suivi d objets en 4D) - Colocalisations tridimensionnelles x y z y x z 20 um Marion De Toledo, CRBM, Montpellier Suzanne VIgneron, CRBM, Montpellier

12 Formation pratique #10 Déconvolution : aspects théoriques et pratiques Public : 5/6 chercheurs ou ITA en Sciences du vivant Durée : 1/2 journée Objectifs : Comprendre les principes de la déconvolution, utiliser le logiciel Huygens et son interface en ligne HRM. - Causes de dégradation de l image - Comment fonctionne la déconvolution (notion de convolution, psf, image théorique et image mesurée). - Algorithme MLE (Maximum Likelihood Estimation), itérations - Structure de déconvolution sur la plate-forme MRI -Utilisation de HRM (Huygens Remote Manager), paramètres d acquisition, de tâche) Frédérique Scamps, INM, Montpellier

13 Formation pratique #11 Traitement et analyse d image avec Image J et MRI Cell Image Analyzer Public : 7 chercheurs ou ITA amené à analyser des images Durée : 1 journée Langue : anglais ou Français (à définir) Objectifs : Comprendre et appliquer les techniques d analyse et de traitement de l image avec ImageJ et MRI Cell Image Analyzer - Affichage de l image (affichage, niveaux, ajustement du contraste et de la luminosité, changer de palette/lut) - Prétraitement de l image (gestion du bruit éléctronique, suppression du bruit de fond, augmentation de la netteté -unsharp masking, enlever des signaux parasites- seuillage et utilisation de masques) - logiciels de traitement et d analyse de l image gratuits ImageJ et MRI Cell Image Analyzer (installation et upgrade, plugins et applications) - Types d image et formats (résolution, conversions rgb color, 8 bit grayscale, 16 bit grayscale et 32 bit grayscale images, formats de fichiers tiff, jpeg, etc...) - Analyse d image - compter des objets (ex. noyaux, adhésions focales, vésicules) - mesurer des tailles et distances - mesurer et comparer des intensités - Détecter et classer des objets - Annotation d images - Manipulation de piles d images 3D ou 2D+temps (construire un stack, manipuler les stacks, créer des films, des animations et des rendus 3D).

14 Formation pratique #12 Automatisation de l analyse d image avec Image J Public : 7 chercheurs ou ITA amené à analyser des images Durée : 1 journée Langue : anglais ou Français (à définir) Objectifs : utiliser le langage macro de ImageJ et le système visuel de scripts MRI Image Analyzer. Prérequis : connaissance des techniques d analyse d image. - Installer ImageJ et MRI Cell Image Analyzer - Construire des scripts d analyse d image avec l interface MRI Cell Image Analyzer - Applications automatisées (batch) - Application semi-automatisées (interactives) - Le langage macro ImageJ (macro recorder, installation de macros, langage macro) - Applications interactives et traitement des données de ImageJ - Mise en oeuvre de ImageJ et de l interface Cell Image Analyze sur des cas concrets des utilisateurs. Stéphane Ory, CRBM, Montpellier