Banque «Agro-Véto» AT-0113 SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE Durée : 3 heures L'usage d'abaques, de tables, de calculatrice et de tout instrument électronique susceptible de permettre au candidat d'accéder à des données, de les traiter par des moyens autres que ceux fournis dans le sujet est interdit. Si, au cours de l épreuve, un candidat repère ce qui lui semble être une erreur d énoncé, il le signale sur sa copie et poursuit sa composition en expliquant les raisons des initiatives qu il a été amené à prendre. Chaque candidat est responsable de la vérification de son sujet d épreuve : pagination et impression de chaque page. Ce contrôle doit être fait en début d épreuve. En cas de doute, il doit alerter au plus tôt le chef de centre qui contrôlera et éventuellement remplacera son sujet. Ocytocine, progestérone et parturition chez les Mammifères Le sujet comporte 3 thèmes dépendants qui seront traités dans l ordre de l énoncé. Le candidat s appuiera essentiellement sur une analyse détaillée des documents, pour répondre aux questions posées en début de chaque thème. Aucune introduction n est attendue. En revanche, une courte conclusion s appuyant sur un schéma bilan est attendue en fin de devoir. On considère que les résultats obtenus chez des espèces différentes (rat et homme) pourront être généralisés à l ensemble des Mammifères. Le candidat ne doit pas rédiger de longs développements de ses connaissances sur le thème, indépendamment de l exploitation des documents. Les documents peuvent être découpés et collés sur la copie à condition d être légendés, commentés et exploités ; des croquis légendés peuvent également être proposés. 1
Quelques données sur la parturition chez les Mammifères Ces données n ont pas à être étudiées pour elles-mêmes La parturition se définit comme l expulsion, hors des voies génitales maternelles, du foetus et des annexes. Elle résulte de l apparition de contractions coordonnées et rythmiques du muscle lisse utérin, ou myomètre, succédant aux contractions localisées et de faible intensité caractéristiques de l état gestationnel. Evolution de l activité électromyographique du muscle utérin chez la rate On mesure l activité électrique du muscle utérin avant, pendant et après la parturition. Cette activité peut être directement corrélée aux contractions mécaniques du muscle. Histologie de l utérus L utérus est formé d une muqueuse, l endomètre, surmontée de deux couches musculaires : une couche de fibres circulaires et une couche de fibres longitudinales. Ces deux dernières couches forment le muscle utérin ou myomètre. Coupe transversale d utérus de rate non gestante - ML : fibres longitudinales du myomètre - MC : fibres circulaires du myomètre - E : endomètre - L : lumière 2
Thème 1. Contrôle de la contractilité du myomètre au cours de la grossesse par l ocytocine et la progestérone A partir des documents 1.1 à 1.6, déterminer les rôles de l ocytocine et de la progestérone sur la contractilité du myomètre au cours de la grossesse. Document 1.1 : Effet de l ocytocine sur la contraction du myomètre L ocytocine est une molécule synthétisée par l hypothalamus (une région de l encéphale) qui est libérée dans le sang. On étudie l effet de cette molécule sur les contractions du myomètre chez le rat. Pour cela, on prélève le myomètre de rates à différents stades de la gestation : 17 jours de gestation (J17), 18 jours de gestation (J18), 21 jours de gestation (J21) et 22 jours de gestation (P : parturition naturelle) Pour chaque stade, des bandes de myomètre de même taille sont découpées et placées dans du liquide physiologique oxygéné, et contenant plus ou moins d ocytocine. On mesure la force développée par chaque bande en réponse à un étirement (en unités arbitraires). Les résultats sont présentés dans le graphique ci-dessous en fonction du stade de gestation et de la concentration du milieu en ocytocine (en log de la concentration en mol/l). Les barres représentent les écarts-types. 3
Document 1.2 : Effet de la progestérone sur la contraction du myomètre On teste l effet de la progestérone sur la contraction du myomètre en utilisant différents antagonistes de cette molécule : RU 486, ZK 299 et ZK 734. Le protocole est identique à celui du document 1.1, à deux différences près : - les myomètres sont tous prélevés au 18 ème jour de gestation - on réalise l expérience sur 4 lots de rates : - lot C : les rates ne subissent aucune injection - lot RU 486 : les rates ont une injection de RU 486 à 16 jours de gestation - lot ZK 299 : les rates ont une injection de ZK 299 à 16 jours de gestation - lot ZK 734 : les rates ont une injection de ZK 734 à 16 jours de gestation Les rates des lots traités avec des antagonistes mettent bas à 70% au jour 18 de gestation (au lieu de 21). La réponse (force développée en UA) est présentée en fonction de la concentration en ocytocine (mol/l). Les barres représentent les écarts-types : elles sont présentées sous forme d une demi barre inférieure ou supérieure lorsqu elles se superposent. 4
Document 1.3 : Etude de l effet de la progestérone sur la liaison de l ocytocine à son récepteur On étudie la fixation de l ocytocine sur son récepteur (OTR) en présence / absence de progestérone. Expérience A : des myomètres de rates sont prélevés au terme de la gestation et sont incubés avec de l ocytocine radioactive, en présence de doses variables de progestérone. On mesure la quantité d ocytocine radioactive fixée sur le récepteur après avoir lavé les cellules avec du sérum physiologique. Les résultats sont donnés en pourcentage de la fixation en présence d ocytocine seule. Expérience B : des cellules n exprimant pas le récepteur à l ocytocine sont transfectées avec soit : - un vecteur permettant l expression du récepteur à l ocytocine (OTR) - un vecteur permettant l expression du récepteur à une autre hormone, hormone V, qui n intervient pas dans la parturition On mesure comme dans l expérience A la quantité : - d ocytocine fixée à son récepteur, en présence de doses variables de progestérone (triangles noirs) - d hormone V fixée à son récepteur RV, en présence de doses variables de progestérone (triangles blancs). Les barres représentent les écarts-types. Document 1.4 : Evolution des concentrations en progestérone et ocytocine au cours de la gestation Les concentrations sanguines en progestérone et en ocytocine sont mesurées dans le sang de femmes au cours de leur grossesse et de l accouchement. A : évolution des concentrations en progestérone : la flèche indique la parturition B : concentrations en ocytocine au cours de la grossesse (G) et de l accouchement (P). A B 5
Document 1.5 : Expression du gène codant le récepteur à l ocytocine (OTR) dans le myomètre au cours de la gestation Document 1.5.a : Etude qualitative par hybridation in situ chez la femme La quantité d ARNm du récepteur à l ocytocine OTR est évaluée par hybridation in situ sur des coupes d utérus de femme à différents stades de la grossesse. L ARNm est détecté grâce à une sonde radioactive complémentaire (anti-sens) de l ARNm. Un contrôle est réalisé avec une sonde sens (de même séquence que l ARNm). L'expression est étudiée dans le myomètre (noté M) et dans la muqueuse (notée E) à différents stades de grossesse : pré-terme (entre 24 et 28 semaines) et au terme (37 semaines). Document 1.5.b : Quantification de l ARNm du récepteur à l ocytocine (OTR) dans le myomètre au cours de la gestation chez la rate On purifie les ARNm de myomètres de rates prélevés : - du 15 ème au 23 ème jour de gestation : d15 à d23 (terme à 23 jours) - un jour après la mise bas : 1PP La quantité d ARNm est déterminée par Northern blot. Les ARNm purifiés sont déposés sur gel d électrophorèse : après migration, le gel est transféré sur une membrane qui est incubée avec une sonde radioactive complémentaire de l ARNm OTR. La même expérience est réalisée avec l ARNm du gène de l actine. 6
Document 1.6 : Contrôle de l expression du récepteur à l ocytocine (OTR) Document 1.6.a : Etude de l effet de la progestérone sur la quantité d ARNm OTR On étudie l effet d injection de progestérone sur la quantité d ARNm OTR dans des myomètres prélevés sur des rates gravides (gestantes) aux jours 21, 22 et 23 de gestation. Les expériences sont réalisées à partir de deux lots : - un lot reçoit des injections quotidiennes de progestérone (2mg) à partir du vingtième jour de gestation - un lot reçoit des injections de liquide physiologique (témoin) Les résultats sont présentés sous forme de taux : quantité d ARNm OTR / quantité d ARNm actine (les barres représentent les écarts-types : seule la moitié supérieure a été indiquée). Document 1.6.b : Etude de l effet d un stimulus mécanique On étudie l effet d un stimulus mécanique sur l expression du récepteur à l ocytocine. On rappelle que les rates, comme les souris, possèdent 2 cornes utérines. On utilise dans cette expérience des rates ayant des embryons implantés dans une seule corne utérine. Les rates subissent une opération qui peut être de deux types : - groupe S : on implante dans la corne utérine non gravide un tube de 3mm provoquant l étirement de l utérus - groupe C : on réalise la même opération (ouverture de l utérus sous anesthésie) mais sans implanter de tube. Cette opération a lieu soit à 15 jours de gestation soit à 18 jours de gestation. Après 5 jours, les rates sont tuées et leur myomètre est prélevé. La quantité d ARNm OTR est déterminée par la même méthode que dans le document 1.5.a. La même étude est réalisée chez des rates gravides non opérées (G). C : rate à corne utérine non gravide opérée sans tube G : rate à corne utérine gravide non opérée S : corne utérine non gravide opérée avec implantation d un tube Les barres représentent les écarts-types, seule leur partie supérieure à été indiquée. 7
Thème 2. Etude de la transduction du message ocytocine A partir des documents 2.1 et 2.2 et de vos connaissances, déterminez quelles sont les conséquences cellulaires de la fixation de l ocytocine sur son récepteur. Document 2.1 : Conséquences intracellulaires de la fixation de l ocytocine sur son récepteur chez le rat Les expériences sont réalisées sur des cellules en culture exprimant le récepteur à l ocytocine. Expérience A : on mesure la production d inositol phosphate dans ces cellules incubées dans des milieux ayant des concentrations variables d ocytocine (en moles/l). Les résultats sont donnés en pourcentages de la concentration maximale d inositol phosphate produit. Expérience B : on mesure au cours du temps la quantité de calcium cyosolique de cellules incubées dans un milieu : - sans ocytocine de 0 à 100 s - avec ocytocine (2nmol/L) de 100 à 400 s (barre noire) - sans ocytocine après 400 s 8
Expérience C : on mesure la quantité de calcium cyosolique de cellules incubées dans des milieux ayant des concentrations variables d ocytocine (en nmol/l). Les résultats sont donnés en pourcentages de la concentration maximale de calcium mesurée. Document 2.2 : Etude du rôle du calcium sur la contraction Document 2.2a : Etude du rôle du calcium extracellulaire sur la contraction Des fragments de myomètre prélevés au terme de la grossesse chez des femmes sont placés dans un milieu contenant de l ocytocine, avec ou sans calcium. On mesure leur contraction au cours du temps (en UA). Un exemple de mesure est présenté ci-dessous. 50 100 150 9
Document 2.2.b : Etude de la provenance du calcium cytosolique Les expériences sont réalisées sur des cellules en culture, issues de myomètres de femmes enceintes. On mesure au cours du temps la concentration en calcium cytosolique suite à l ajout d ocytocine dans le milieu de culture (indiqué par la flèche). Deux expériences sont réalisées. Expérience A : les cellules sont incubées soit dans un milieu contenant du calcium ([Ca 2+ ] = 1 mmol/l), soit dans un milieu dépourvu de calcium ([Ca 2+ ] = 0 mmol/l). Expérience B : les cellules sont incubées soit dans un milieu contenant du calcium, soit dans un milieu contenant du calcium et un inhibiteur de la phospholipase C. On rappelle que la phospholipase C est une enzyme membranaire capable de produire de l inositol phosphate. Document 2.2.c : Etude du rôle de l ocytocine sur la pompe à calcium (Ca 2+ dépendante) On étudie l effet de l ocytocine sur la Ca 2+ dépendante ATPase, une protéine membranaire dont le rôle est d expulser le calcium de la cellule vers le milieu extracellulaire. On mesure l activité de pompes à calcium de membranes plasmiques isolées à partir de myomètre de rates, en présence ou en absence d ocytocine. On donne les valeurs d activité des pompes en nmol de Ca 2+ / mg d ATPase. Sans ocytocine Avec ocytocine Transport de calcium (nmol de Ca 2+ / mg d ATPase) 9 (+/- 0,2) 7,8 (+/- 0,2) 10
Thème 3. Etude de l ocytocine et de la progestérone sur l activité électrique du myomètre A partir des documents 3.1 à 3.4 et de vos connaissances, déterminez quels sont les effets de l ocytocine et de la progestérone sur l activité électrique du myomètre. Document 3.1 : Etude du lien entre activité électrique et activité mécanique du myomètre chez la femme On mesure chez une femme en début de parturition les activités électrique et mécanique du myomètre : - activité électrique : électromyogramme transabdominal obtenu grâce à deux électrodes placées à 3 cm l'une de l'autre près du nombril (en µv). L'électrode de référence est positionnée sur la hanche. - activité mécanique : l intensité des contractions est suivie au cours du temps grâce à un capteur posé sur l abdomen et sensible à la pression (plus la contraction est forte, plus la pression exercée sur le capteur est élevée). Document 3.2 : Effet de l ocytocine sur l activité électrique du myomètre On mesure au cours du temps l activité électrique (en mv) de myomètres prélevés sur des rates en gestation (14 ème jour) en présence ou en absence d ocytocine. 11
Document 3.3 : Evolution des jonctions gap du myomètre au cours de la gestation Document 3.3a : Etude de la taille et de la densité des jonctions gap chez la rate Des coupes sont réalisées sur des myomètres de rates à différents stade de la gestation et sont observées au microscope électronique à transmission. On quantifie : - l aire relative occupée par les jonctions (aire des jonctions / aire de la membrane plasmique) - la densité des jonctions gap : nombre de jonctions gap par millimètre de membrane plasmique Document 3.3b : Etude du rôle de la progestérone sur l expression des protéines formant les jonctions gap On étudie le rôle de la progestérone sur l expression des connexines, protéines membranaires qui s associent pour former les jonctions gap. Les expériences sont réalisées sur des myomètres prélevés sur des rates contrôle (C) ou sur des rates ayant reçu des injections de progestérone (P). Expérience A : les myomètres de rates, traitées ou non avec de la progestérone, sont cryofracturés. Une réplique est réalisée et est ombrée. Le résultat est observé au microscope électronique à transmission. 200nm 200nm 12
Expérience B : les connexines sont localisées grâce à des anticorps anti-connexine, révélés par des anticorps secondaires liés à la fluorescéine. 25 µm 25 µm mc : myomètre à fibres circulaires ml : myomètre à fibres longitudinales Document 3.4 : Etude du rôle des jonctions gap sur la contraction du myomètre Les expériences sont réalisées sur des myomètres de rates en cours de gestation ou au terme. On mesure la vitesse de propagation des potentiels d action le long d une fibre musculaire. Schéma du montage - les lignes verticales représentent les fibres musculaires - les x représentent les 6 électrodes de mesure (e1 à e6) Résultats Rate en cours de gestation Rate au terme de la gestation Vitesse de propagation (cm/s) 2,3 (+/- 0,4) 4 (+/- 0,4) 13
Bibliographie Thème 1 : Che-Wei Ou et al., 1998. Biology of Reproduction 59, 1055-1061. Garfield et Beier, 1989. American Journal of Obstetrics and Gynecology, vol.161, N 2, 454-461. Grazzini et al., 1998. Nature Vol. 392, 509-512. Thibault et Levasseur : La reproduction, chez les mammifères et l homme, Ed Ellipses1991. Risek et al., 1995. Journal of Cell Science 108, 1017-1032. Wathes et al., 1999. Journal of Endocrinology 161, 143 151. Thème 2 : Grazzini et al., 1998. Nature Vol. 392, 509-512. Sanborn 2001. Experimental Physiology (2001) 86.2, 223 237. Tribe 2001. Experimental Physiology (2001) 86.2, 247 254. Enyedi et al.,1989. Biochemistry Journal 261,23-28. Thème 3 : Garfield et al., 1982. Biology of reproduction 27, 967-975. Kuriyama et Suzuki, 1975. Journal of physiology 260, 335-349. Puri et Garfield, 1982. Biology of reproduction 27, 967-975. Risek et al., 1995. Journal of Cell Science 108, 1017-1032. Miller et al., 1989. Am J Physiol Cell Physiol vol. 256, 131-141. 14