Spectrométrie de Masse ENCPB, 2012 1
Repères historiques 1910 : J.J. THOMSON mesure des abondances isotopiques du néon 20 et 22 (gaz). (Prix Nobel en 1906) 1938 : Premier spectre de masse d'une molécule organique : le benzène. 1959 : GOHLKE réalise le premier couplage de la chromatographie en phase gazeuse avec la spectrométrie de masse CG-SM. 1966 : BECKER : ionisation chimique. 1975 : première CPG-SM sur colonne capillaire 1981 : BARBER : source à bombardement d'atomes rapides FAB. Possibilité d'analyse de molécules d'intérêt biologique. 1985 : HILLENKAMP : MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization). Application au séquençage de peptides. 1988 : FENN : Electrospray (ESI) : permet les mesures de hautes masses moléculaires (peptides). Prix Nobel de Chimie 2002 ENCPB, 2012 2
Principe ENCPB, 2012 3
Ionisation-Séparation-Détection Analyse d un échantillon pur : chromatographie préalable puis : Vide ENCPB, 2012 4
Ex. de spectres de masse ENCPB, 2012 5
Les techniques d ionisation - Ionisation chimique - Electrospray - FAB (Bombardement par atome rapide) - Phase solide ENCPB, 2012 6
Ionisation Chimique (IC-CI) ENCPB, 2012 7
Ionisation Chimique La pression du gaz réactant (méthane,butane,nh 3 ) dans la source d'ions est suffisante pour entraîner des réactions de transferts de charges. Ionisation plus douce qu en IE Ions pseudomoléculaires ([M+H] + en mode positif ou [M- H] - ) en mode négatif et fragments. ENCPB, 2012 8
Ionisation Chimique ENCPB, 2012 9
L Electrospray ENCPB, 2012 10
Electrospray A partir d une phase liquide tamponnée 2 processus : formation de gouttelettes Ionisation ENCPB, 2012 11
Formation des gouttelettes ENCPB, 2012 12
Ionisation ENCPB, 2012 13
Positif ou négatif? Mode positif : molécules acceptant facilement des protons : protéines, peptides Mode négatif : molécules cédant facilement des protons : saccharides, oligonucléotides ENCPB, 2012 14
Massifs multiprotonés ENCPB, 2012 15
Estimation de la masse molaire ENCPB, 2012 16
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Ionisation par désorption ENCPB, 2012 19
FAB (Bombardement par atome rapide) Ions argon ou xénon. Ionisation douce du composé. Ions quasimoléculaires (M+H) +, (M+Na) + ENCPB, 2012 20
MALDI : Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Solide dispersé dans une matrice, irradié par un laser dont la longueur d'onde est située dans la bande d'absorption de la matrice. Désorption de molécules ionisées intactes. On peut observer l'ion : M +, (M+H) +, (M+Na) +, (M-H) -, des ions multichargés (M+2H) 2+, (M+3H) 3+, (M-3H) 3-, etc. mais peu d'ions fragments. ENCPB, 2012 21
Désorption laser ENCPB, 2012 22
Faible masse moléculaire Doit être source de proton afin de faciliter l ionisation Forte absorption UV pour faciliter l absorption laser Soluble en solutions aqueuses La matrice Ajout de solvants organiques pour les analytes hydrophobes 23 ENCPB, 2012
SELDI Présélection du composé. ENCPB, 2012 24
Les analyseurs Quadripôles, trappes ioniques, temps de vol et les autres ENCPB, 2012 25
Les quadripôles ENCPB, 2012 26
Description ENCPB, 2012 27
Lignes de champ dans un quadripôle ENCPB, 2012 28
Parcours autorisé dans un quadripôle ENCPB, 2012 29
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Bilan du «Quad» Gamme de masse : entre 10 et 4000 m/z. Précision : 0,1-1 m/z Vitesse de balayage : 5000 m/z /s. Octopôle : augmente la précision de guidage des ions. Le temps de vie d un ion de sa formation à sa détection est de 40 à 100 µs. ENCPB, 2012 31
Détection des ions ENCPB, 2012 32
Analyseur : trappe ionique ENCPB, 2012 33
Analyseur : trappe ionique ENCPB, 2012 34
Trappe ionique ENCPB, 2012 35
Trappe ionique ENCPB, 2012 36
Analyseur : FTICR Résonance Cyclotronique Ionique à Transformée de Fourier ENCPB, 2012 37
FTICR-FTMS www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/fticr-massspec.html. ENCPB, 2012 38
Analyseur à temps de vol ENCPB, 2012 39
Temps de vol ENCPB, 2012 40
Station TOF ENCPB, 2012 41
Bruker Daltonics Autoflex MALDI-TOF ENCPB, 2012 42
Reflecteur ENCPB, 2012 43
Mode linéaire / réflecteur ENCPB, 2012 44
Bilan Analyseur Secteur magnétique Quadripôle TOF FTICR Domaine de masse 100 000 < 5000 illimité 100 000 Sensibilité **** *** **** ***** Résolution **** *** **** ***** ENCPB, 2012 45
Tandem CID : Collision Induced Dissociation ENCPB, 2012 46
LC-MS-MS ENCPB, 2012 47
Influence de l énergie de collision ENCPB, 2012 48
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MALDI TOF-TOF ENCPB, 2012 51
Ultraflex Brucker ENCPB, 2012 52
MALDI-PSD Post Source Decay ENCPB, 2012 53
Applications de la SM au séquençage peptidique Nécessité d une fragmentation supplémentaire ENCPB, 2012 54
Acides aminés ENCPB, 2012 55
Fragmentations peptidiques ENCPB, 2012 56
Etude de peptides ENCPB, 2012 57
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Analyses de résidus trypsiques par SM Figures extraites de «NOUVELLES APPROCHES DE LA SPECTROMETRIE DE MASSE EN TANDEM POUR LA CARACTERISATION DE BIOMOLECULES. APPLICATIONS A LA PROTEOMIQUE» par Elsa WAGNER, thèse de doctorat de l UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG, 2004. ENCPB, 2012 63
Exemple ENCPB, 2012 64
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Quantification différencielle Marquage itraq (isobaric Tag for Relative and Absolute Quantification) ENCPB, 2012 69
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Bibliographie Spectrométrie de masse - René BOTTER, Guy BOUCHOUX - Techniques de l Ingénieur, traité Analyse et Caractérisation - PE 2 615. Couplages chromatographiques avec la spectrométrie de masse - Frédéric de MAACK, Michel SABLIER - Techniques de l Ingénieur, traité Analyse et Caractérisation - PE 2 614. ENCPB, 2012 72
E. de HOFFMANN. J. CHARETTE. V. STROOBANT. Spectrométrie de Masse : cours et exercices corrigés. Dunod. 2ème édition, 1999. E. CONSTANTIN. P. TRALDI. D. FAVRETTO. A. SCHNELL. Spectrométrie de Masse : Principes et Applications. Technique et Documentation Lavoisier. 2ème édition, 1996. R. M. Silverstein, Spectrometric Identification of Organic Compounds, 7th Edition, Wiley, 2005, 512 p. ENCPB, 2012 73
Sur le Net : http://www.ms-textbook.com/ http://www.chem.arizona.edu/massspec/exa mple_html/examples.html http://www.chez.com/dalmeyda/cours/spectr odemasse/interpretation-ms.pdf http://www.sfsm.fr/index.php/fr/actionssfsm/enseignements-cours ENCPB, 2012 74