Les bactéries dans l environnement

DÉPARTEMENT DE BIOLOGIE DU CÉGEP DE JONQUIÈRE ORGANISATION DU VIVANT Laboratoire 05 Les bactéries dans l environnement Esteban Gonzalez Département de biologie Bureau 261.2 esteban.gonzalez@cjonquiere.qc.ca 101-JAA-JQ 3-2-3 Pour les étudiant(e)s du programme collégial de Sciences, lettres et arts (700.A0) Hiver 2012

DIRECTIVES: 1) L étudiant(e) est responsable de lire attentivement la partie théorique et la partie pratique de cette unité. La préparation de l élève est sujette à évaluation. 2) Cette unité sur les bactéries de l environnement durera deux séances de laboratoire (environ 3 périodes). 3) L activité se fait en équipe de deux élèves et entièrement au laboratoire. 4) Le professeur vérifiera, au laboratoire même, les tableaux que l étudiante ou l étudiant remplira sur place au fur et à mesure des expérimentations. 5) Chacune des équipes devra remettre tous les tableaux et répondre à toutes les questions de l unité une semaine après la prise des données une copie pour deux étudiant(e)s. OBJECTIFS : À la fin de cette activité d apprentissage, l étudiante ou l étudiant devra : 1) Mettre en pratique la technique aseptique; 2) Être sensibilisé à l ubiquité des bactéries dans l environnement et sur le corps humain; 3) Être capable de préparer un ensemencement bactérien sur un milieu de culture dans une boîte de Pétri; 4) Reconnaître les formes de bactéries existantes; 5) Être capable de préparer un frottis bactérien; 6) Être en mesure d effectuer une coloration de Gram et d en observer le résultat au microscope optique. 7) Pouvoir effectuer un contrôle de qualité microbiologique sur une bière commerciale. LAB JAA 05 -bact_enviro_est-h11.doc page 2 sur 17

1. GÉNÉRALITÉS 1.1. DÉCOUVERTE DES MICROORGANISMES Les microorganismes sont peut-être les plus anciens des êtres vivants (3 500 Millions d années) mais ils ont été découverts les derniers en raison de leur dimension. De toutes les espèces d êtres vivants, ils sont, sans aucun doute, les plus abondants. C est le hollandais Antoine Van Leeuwenhoek (1632-1723) qui, le premier, a fait la description de microorganismes grâce à son microscope rudimentaire. 2. LES MICROBES DE L ENVIRONNEMENT La microbiologie est l étude des microorganismes, c est-à-dire les organismes qu on ne peut voir qu à l aide d un microscope. Les microorganismes comprennent: les bactéries, les virus, les archéobactéries, les algues, les levures et moisissures et les protozoaires. Ces microorganismes, sont d une importance considérable pour l homme. Ils sont importants dans l agriculture, dans l industrie, dans l assainissement de l environnement, dans l alimentation, etc. Certains de ces microorganismes sont les agents responsables de plusieurs maladies et leur étude est indispensable en médecine, afin de connaître leur forme, leur mode de reproduction, leur mode de contamination ainsi que le moyen de les éliminer. Dans cette unité nous allons, en premier lieu, connaître les règlements et les mesures d asepsie qu il faut respecter dans le laboratoire de microbiologie afin d éviter les contaminations, ces règlements doivent être respectés lors de chaque séance de laboratoire. 2.1. Aspect des colonies Les bactéries se multiplieront à la surface de la gélose et leur masse prendra une forme arrondie appelée colonie. Chacune de ces colonies est réputée issue d une seule bactérie ou Unité Formatrice de Colonie (UFC) qui s est divisée à des centaines de reprises de façon asexuée et constitue donc un clone. Chaque espèce bactérienne a une forme et une couleur de colonie typique. La forme, la couleur, l élévation, le contour et parfois même l odeur des colonies sont des critères utilisés pour aider à les reconnaître. LAB JAA 05 -bact_enviro_est-h11.doc page 3 sur 17

Figure 1. Caractéristiques des colonies bactériennes sur milieu solide. 3. Les levures Le groupe de microorganismes appelé levures est limité au x mycètes chez qui la forme unicellulaire est prédominante. Ces microorganismes se reproduisent principalement par simple division cellulaire ou par bourgeonnement des cellules parentales (voir photo). Des milliers de lignées différentes de Saccharomyces cerevisiae son utilisées pour la production de différents produits alimentaires tels le pain, la bière et le vin. Elle possède un métabolisme autant aérobie qu anaérobie, qui lui permet d utiliser les sucres simples comme source de carbone et d énergie. Les principaux produits de son métabolisme sont le CO 2 et l éthanol. Source : Tiré de Campbell et Reece 2007. Utilisé avec permission. LAB JAA 05 -bact_enviro_est-h11.doc page 4 sur 17

Les bactéries de l environnement 3.1. Morphologie des bactéries au microscope Les bactéries présentent des aspects différents sous le microscope. On peut généralement les placer dans l un des groupes représentés à la figure 2. A) Forme sphérique (cocci) B) Forme de bâtonnet (bacilles) C) Forme hélicoïdale (spirilles) Figure 2. Formes les plus courantes de procaryotes. Tiré de CAMPBELL et REECE, 2007. Figure 3 : Coulée des géloses nutritives dans les vases de Petri. LAB JAA 05 -bact_enviro_est-h11.doc page 5 sur 17

4. LA CULTURE DES MICROORGANISMES Dans cette activité, nous ferons un inventaire des microorganismes de l environnement. Les microorganismes jouent des rôles indispensables et diversifiés dans les écosystèmes. Ils se trouvent partout et pour les distinguer, il est souvent nécessaire de les cultiver. Les bactéries ont besoin d une variété de nutriments pour assurer leur croissance. À cette fin, on peut facilement préparer un mélange nutritif suffisant pour une grande diversité de bactéries en mettant en solution diverses sources de minéraux et de carbone (matière organique). On ajoute ensuite à ce bouillon nutritif, de l agar purifié qui, en se refroidissant, permet de donner une texture solide au mélange. Le mélange est stérilisé par une exposition à 121 C pendant 15 minutes afin d éliminer toute trace de bactérie ou de moisissure qui pourrait être présent, puis on verse le bouillon chaud additionné d agar dans un récipient (vase de Petri) pour l ensemencement ou le repiquage d échantillons bactériens (voir la figure 4). Divers milieux permettent de cultiver diverses lignées de bactéries. Dans cette activité, nous utiliserons, trois milieux différents : le milieu au soya tryptique, le milieu WL nutritif et le milieu WL différentiel. Le milieu au soya tryptique. Milieu nutritif utilisé pour cultiver une vaste gamme de micro-organismes. Composition : Caséine hydrolysée (source de nutriments azotés) Soya hydrolysé (source de nutriments azotés de carbone et d énergie) NaCl (maintient l équilibre osmotique) Agar (agent solidifiant) ph : 7,0 Agar WL Nutritif vert simple (WLN) Culture des levures, moisissures et bactéries présentes dans les procédés de brasserie et de fermentation industrielles. Extrait de levure (source de vitamines, et autres facteurs essentiels) Digestion pancréatique de caséine (source d acides aminés) Dextrose (source de carbone) Monopotassium Phosphate Potassium Chloride Calcium Chloride Magnesium Sulfate Ferric Chloride Manganese Sulfate LAB JAA 05 -bact_enviro_est-h11.doc page 6 sur 17

Agar (agent solidifiant) Vert Bromcresol (indicateur de ph) ph 5,5 ± 0,2 Agar WL différentiel (WLD) Isolation des bactéries présentes dans les procédés de brasserie et de fermentation industrielles. Ajoutez 4,0 mg/l de cycloheximide à la recette du l agar WL nutritif. C est un inhibiteur de la croissance des mycètes (levures et moisissures). 5. LA TECHNIQUE ASEPTIQUE La technique aseptique est un ensemble de comportements qui permettent d éviter de contaminer les échantillons ou l utilisateur lors de la manipulation de microorganismes. L environnement de travail devrait être : Dans une enceinte de sécurité biologique ou près d une flamme dans un local aux portes fermées. Sur une surface propre et désinfectée. Muni des instruments à portée de main. La personne devrait : avoir les mains propres; ne pas parler durant les manipulations; porter un sarrau propre. LA TECHNIQUE SERA DÉMONTRÉE AU LABORATOIRE (FIGURE 4). MATÉRIEL 1 e semaine 1 gélose WL nutritif 1 gélose WL différentielle 5 géloses nutritives(au soya tryptique) en vase de Pétri Désinfectant pour tables Fil bouclé (ose) Étaloir «hockey» Bécher d éthanol Brûleur Écouvillons stériles Crayon gras Allumeur Pipettes sérologiques 1 ml stériles (3) Pro-pipette 1 culture de E. coli. 1 bière sur lie Lames préparées «Bacteria three types» Microscopes Huile à immersion Désinfectant pour tables LAB JAA 05 -bact_enviro_est-h11.doc page 7 sur 17

Cartes de démonstration diverses 2 e semaine Désinfectant pour tables Lames de microscope à bout dépoli propres Colorants de Gram Eau distillée Carte de démonstration de la paroi bactérienne et autres modèles RAPPEL DES RÈGLES DE SÉCURITÉ Les manipulations de microbiologie doivent être effectuées avec grand soin, gardant à l esprit le danger toujours présent qu entraîne l utilisation de cultures microbiennes. Quelques règles particulières s appliquent donc lorsqu on travaille en laboratoire de microbiologie puisque nous allons travailler avec des bactéries vivantes et ce, pour 2 raisons principales : 1) Pour ne pas se contaminer nous-mêmes avec les cultures des bactéries. 2) Pour ne pas contaminer les cultures avec lesquelles nous allons travailler. Ce sont des cultures pures que l on doit préserver des microorganismes qu on retrouve un peu partout dans l environnement extérieur (c est en principe ce que l on devrait découvrir au cours de cette activité). Les règlements qui suivent doivent être respectés RIGOUREUSEMENT: Le port du sarrau est obligatoire. Il devra être propre. Il faut désinfecter la table avant et après le laboratoire. Se laver les mains avant et après la séance de laboratoire. L étudiant(e) aux cheveux longs doit les attacher. Éviter de porter ses doigts ou tout objet à sa bouche. Ne pas manger ou boire au laboratoire. Les instruments de travail contaminés seront déposés dans des récipients spéciaux, jamais sur la table sauf après désinfection ou stérilisation. Ne rien jeter dans les éviers ou les poubelles. Jeter les déchets là où on l indiquera. Pendant le laboratoire, éviter de parler surtout en faisant des ensemencements. Éviter de se déplacer inutilement. Afin d éviter les contaminations extérieures, ne rien transporter hors du laboratoire sans autorisation. Il faut toujours que les vases de Pétri et les tubes dans lesquels on fait les ensemencements soient très bien identifiés avant de les placer à l incubateur. LAB JAA 05 -bact_enviro_est-h11.doc page 8 sur 17

Figure 4. La technique aseptique. Traduit d après BENSON, H. J. 2002. LAB JAA 05 -bact_enviro_est-h11.doc page 9 sur 17

MANIPULATIONS PREMIÈRE SEMAINE 1) Nettoyez bien votre espace de travail et vos mains afin d éliminer le plus possible de source de contamination 2) Lisez bien le protocole puis effectuez les ensemencements de la façon décrite. 3) Placez les boîtes dans l incubateur à 22 C (la boite 7 doit être incubée à 30 C) pendant 48h. Les boîtes doivent être placées le fond au dessus (à l envers) afin que la condensation ne s accumule pas sur la gélose. (Le technicien s occupera de les sortir et de les conserver au réfrigérateur jusqu à la prochaine séance). 4) Observations microscopiques : Observez les trois types de bactéries présentes sur la lame «Bacteria three types» Notez vos observations dans la section «rapport de laboratoire». Boîte Ensemencement Soulevez le couvercle et exposez la gélose à l air ambiant pendant 30 1 min. Prélèvement buccal : introduisez un écouvillon stérile dans l arrière 2 bouche et frottez le palais ou le tour des dents. Étalez sur la gélose. 3 Frottez un doigt ou le coude sur la surface de la gélose. À l aide d un écouvillon stérile imbibé de solution saline, frottez la table 4 ou un endroit poussiéreux puis étalez votre récolte sur la gélose. Faites un épuisement sur gélose comme démontré dans la figure 5 5 avec E. coli. Prélevez 0,5 ml de bière sur lie avec une pipette stérile et étalez sur une 6 gélose WLN (voir page 6) avec le «hockey». Prélevez 0,5 ml de bière sur lie avec une pipette stérile et étalez sur une 7 gélose WLD (voir page 7) avec le «hockey». Discussion en classe : Que croyez-vous obtenir sur les milieux de culture après l incubation? LAB JAA 05 -bact_enviro_est-h11.doc page 10 sur 17

Figure 5. Épuisement sur gélose. Utilisez un fil bouclé que vous stériliserez entre chaque étape (1, 2, 3) pour isoler des cellules bactériennes. DEUXIÈME SEMAINE 5) Faites l observation des 7 boîtes. Choisissez une colonie de la boîte 5 (E. coli) et une autre de votre choix (les colonies de la boite #1 donnent souvent de bons résultats) puis effectuez un frottis de chacune. a) Le frottis : en utilisant le fil bouclé, prélevez une colonie puis étalez-la dans une goutte d eau placée sur une lame de microscope propre. Laissez sécher à l air libre. b) Fixez le frottis à la chaleur en passant la lame de microscope dans la flamme d un brûleur à 4 ou 5 reprises. 6) Effectuez la coloration de Gram sur votre frottis en suivant rigoureusement la méthode présentée à la page 12. 7) Identifiez la forme et le Gram de cette bactérie à l aide du microscope. Vous devrez utiliser l objectif 100X et l huile à immersion. Dessinez vos observations dans l espace prévu à cette fin. 8) Faites l observation de la lame préparée intitulée «Bacteria Three types» et dessinez les trois formes courantes de bactéries observées. 9) Répondez aux questions de compréhension placées à la fin du document. LAB JAA 05 -bact_enviro_est-h11.doc page 11 sur 17

LA COLORATION DE GRAM La lecture du concept 27.1 de CAMPBELL et REECE (2007) est recommandée. En particulier la section : «Des adaptations structurales» et «Les structures de la surface cellulaire.» (pp. 577 à 579). Figure 6. Coloration de Gram et structure de la surface cellulaire chez les procaryotes. Tiré de CAMPBELL et REECE. 2007. Protocole pour la coloration de Gram 1) Placez le frottis séché à la chaleur dans le bac de coloration violet. Laissez reposer pendant 1 minute et rincez à l eau du robinet. 2) Placez dans le mordant, l iode de Gram, laissez reposer pendant 1 minute. Rincez à l eau. 3) Placez le frottis dans le mélange alcool-acétone pendant 30 secondes ou jusqu à ce que la couleur qui s enlève soit complètement partie. Rincez à l eau. 4) Recolorez avec la safranine pendant 1 minute. Rincez à l eau. 5) Laissez sécher ou épongez délicatement avec un papier brun avant d observer au grossissement maximum. LAB JAA 05 -bact_enviro_est-h11.doc page 12 sur 17

Oculaire Tube binoculaire Objectif Grossissement Identification (qu y a-t-il sur la gélose?) Description Gram : Couleur Oculaire Tube binoculaire Objectif Grossissement Identification (qu y a-t-il sur la gélose?) Description Gram : Couleur LAB JAA 05 -bact_enviro_est-h11.doc page 13 sur 17

Identification : Bacteria Three types Description Gram : Couleur Oculaire Tube binoculaire Objectif Grossissement ***FAITES VÉRIFIER VOS DESSINS PAR VOTRE PROFESSEUR AVANT DE QUITTER LE LABORATOIRE.*** LAB JAA 05 -bact_enviro_est-h11.doc page 14 sur 17

QUESTIONS DE COMPRÉHENSION Le corrigé sera mis en ligne à votre disposition. Toutes ces questions sont susceptibles de se retrouver dans l examen de laboratoire. 1) Pourquoi faut-il passer la lame de microscope dans la flamme après que le frottis ait séché? La chaleur permet de fixer le frottis sur la lame (faire coller) 2) Donnez deux précautions que vous pourriez prendre pour assurer une meilleure asepsie lors des prélèvements microbiologiques que l on fait régulièrement en laboratoire médical? Citez les résultats obtenus dans la gélose 1 à 4 pour soutenir vos suggestions. L élève doit faire référence à deux résultats pour appuyer ses suggestions Présence de bactéries sur la peau, dans l air, dans la salive ou sur les surfaces Ex : porter des gants, travailler dans un environnement propre, éviter de parler, porter un masque, désinfecter la peau avant d introduire une aiguille, etc. 3) Distinguez les termes Colonie et U.F.C. Tiré de ce document : «Chacune de ces colonies est réputée issue d une seule bactérie ou Unité Formatrice de Colonie (UFC) qui s est divisée à des centaines de reprises de façon asexuée et constitue donc un clone.» 4) Dans la coloration de gram, quel est le rôle de? a. Le crystal violet Colore les bactéries sur le frottis en violet b. Le mélange alcool-acétone Décolore les bactéries gram négatives (G-) c. La safranine LAB JAA 05 -bact_enviro_est-h11.doc page 15 sur 17

Recolore les bactéries G- en rose 5) À partir du vocabulaire présenté dans la figure 1, décrivez ce que vous avez obtenu dans la gélose 1 et 2. Utilisez les termes associé à la description de colonies : taille, élévation, marge, couleur, etc. (ne pas utiliser la forme des bactéries telles que vues au microscope) 6) Avez-vous obtenu des colonies isolées dans l exercice d épuisement sur gélose? Expliquez comment vous avez fait. Si oui, l utilisation du fil bouclé stérilisé entre chaque étape permet de séparer les nombreuses bactéries en ufc séparées les unes des autres entre les étapes. 7) D après l analyse des géloses WLN et WLD, que pouvez-vous affirmer quant à la qualité de la bière que vous avez analysé? La gélose WLN permet de cultiver tous les microorganismes présents dans la bière (levure ET bactéries). On devrait y retrouver plusieurs colonies blanches au milieu vert) La gélose WLD contient un inhibiteur de croissance des levures (cycloheximide) qui permet de mieux mettre en évidence les bactéries de la bière pour les examens de routine faits en brasserie. Attention : la bière ne devrait pas contenir de bactéries 8) Pourquoi faut-il utiliser l éthanol pour stériliser l étaloir (Hockey) au lieu du bruleur? Le bruleur ferait chauffer l étaloir qui à son tour risquerait de tuer les bactéries ou levures qu on veut faire croitre sur notre milieu. Le choc thermique doit être évité. C est pourquoi on utilise l éthanol, un excellent désinfectant. Il faut toutefois attendre que l éthanol soit complètement évaporé du hockey pour éviter d en ajouter au milieu de culture, ce qui pourrait tuer nos sujets d expérience! LAB JAA 05 -bact_enviro_est-h11.doc page 16 sur 17

MÉDIAGRAPHIE BENSON, Harold J. 2002. Microbiological applications; laboratory manual in general microbiology, complete version. 8th edition. New-York, McGraw Hill. 478 p. Cote QR63.B65 2002.( ISBN 0-07-231888-0) CAMPBELL, Neil A. et Jane B. REECE. (2007). Biologie 3 e édition. Adaptation française : René Lachaine et Michel Bosset. Montréal, ERPI. 1364 p. ISBN 978-2-7613-1783-2 PRESCOTT, HARLEY et KLEIN. (1995). Microbiologie, éd. traduite de l anglais par Claire-Michelle CACQ-CALBERG, Jacques COYETTE, Philippe HOET et Martine NGUYEN-DISTÈCHE. Bruxelles, De Boeck-Université. 1010 p. SINGLETON, P. (1999). Bactériologie, 4e éd. Paris: Dunod, 415 p. TORTORA, Gerard J., Berdell R. FUNKE et Christine L. CASE (2003). Introduction à la microbiologie. Adaptation française de la 7 e édition: Louise MARTIN, St-Laurent, ERPI, 952 p. LAB JAA 05 -bact_enviro_est-h11.doc page 17 sur 17