CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE
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- François-Xavier Laperrière
- il y a 8 ans
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1 CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE I - PRINCIPE La chromatographie est une méthode physique de séparation de mélanges en leurs constituants; elle est basée sur les différences d affinité des substances à l égard de deux phases, l une stationnaire ou fixe, l autre mobile. La chromatographie sur couche mince, ou sur plaque (CCM), est effectuée surtout en vue d une analyse d un mélange. La phase stationnaire solide est fixée sur une plaque, et la phase mobile liquide, nommée éluant, est un solvant ou un mélange de solvants. On dépose sur la phase fixe une petite quantité du mélange à séparer et on met cette phase au contact de la phase mobile. La phase mobile migre de bas en haut, par capillarité, le long de la phase fixe en entraînant les constituants du mélange. C est le phénomène d élution, qui permet la séparation des constituants du mélange à analyser. Chaque constituant migre d une certaine hauteur, caractéristique de la substance, que l on appelle rapport frontal ou rétention frontale (Rf) : Rf = hauteur de la tache hauteur du front du solvant Chaque tache correspond à un constituant et on l identifie par comparaison du Rf avec un témoin (une même substance migre à la même hauteur dans des conditions opératoires identiques; même Rf). II - ETUDE DE SUBSTANCES COLOREES Le but est de séparer trois colorants alimentaires : - Le jaune de tartrazine; E 102, - Le rouge d azorubine; E 122, - Le vert; E 102 (jaune de tartrazine) et E 131 (bleu patenté).
2 - Remplir la cuve chromatographique du mélange de solvants (hauteur 0,5 cm). (60 ml de butan-1-ol + 15 ml d acide éthanoïque + 15 ml d eau) - La recouvrir, afin que l atmosphère dans la cuve reste saturée en vapeurs d éluant. - Sur la plaque chromatographique, tracer au crayon de papier un trait horizontal à 1 cm environ du bord inférieur. Ce trait ne doit pas tremper dans le solvant d élution contenu dans la cuve. - Déposer sur le trait, à l aide de cure-dents, à 0,5 cm d intervalle, une microgoutte de : * jaune de tartrazine, * rouge d azorubine, * vert, * mélange des trois colorants. - Laisser sécher les taches avant d éluer (ou sèche-cheveux). - Déposer la plaque verticalement dans la cuve et la couvrir. - Lorsque le solvant a atteint les ¾ environ de la hauteur de la plaque (1 cm du bord supérieur), sortir la plaque de la cuve et marquer immédiatement le front du solvant (car le solvant s évapore très vite). - Lorsque le solvant s est évaporé, mesurer : * la hauteur du front, * les Rf des substances différentes (centre des taches). III - ETUDE D UNE SUBSTANCE INCOLORE Le but est de réaliser une analyse d un produit de synthèse : le paracétamol obtenu à partir du para-aminophénol. - Saturer une cuve chromatographique avec l éluant suivant : mélange toluène / éthoxyéthane / acide éthanoïque / méthanol (60/30/9/1 ml). - Réaliser, dans des petits tubes à hémolyse ou sur une plaque à godets, les trois solutions dans l éthanol : * du para-aminophénol de départ, * du paracétamol brut obtenu, * du paracétamol pur obtenu. - Sur la même plaque chromatographique, faire un dépôt de chaque solution. - Développer le chromatogramme. - Révéler en exposant la plaque sous une lampe UV.
3 IV - IMPORTANCE DE LA GROSSEUR DES TACHES Le but est de tirer des conclusions sur la grosseur des taches à déposer sur les plaques CCM. Réaliser des essais avec un des colorants alimentaires (jaune ou rouge). V - INFLUENCE DE LA CONCENTRATION Le but est de tirer des conclusions sur la concentration du produit à déposer sur les plaques CCM. Réaliser des essais avec du paracétamol pur. Rq : la manipulation de solvants organiques volatils, inflammables et à odeur piquante nécessite l utilisation de la ventilation.
4 CHROMATOGRAPHIE SUR COLONNE / CCM I - GENERALITES Les techniques chromatographiques sont utilisées pour la séparation de mélanges en leurs constituants. Les deux techniques chromatographiques utilisées au cours de cette manipulation sont : - la chromatographie sur colonne, qui permet de séparer un mélange en vue d isoler de petites quantités de chacun des constituants séparés de ce mélange. - la chromatographie sur couche mince (CCM), qui est destinée surtout à la séparation en vue d analyse d un mélange. II - BUT On veut séparer et récupérer isolément les constituants d un mélange de deux colorants : la fuchsine et le rouge de méthyle, puis les analyser. Ces substances ont l avantage d être colorées, ce qui permet de suivre facilement la séparation. La séparation s effectue par chromatographie sur colonne et l analyse par chromatographie sur couche mince.
5 III - CHROMATOGRAPHIE SUR COLONNE D ALUMINE 1 - Principe La chromatographie est une méthode physique de séparation dans laquelle les composés à séparer sont répartis en deux phases : - une phase fixe, de grande surface, appelée phase stationnaire. - une phase mobile, constituée par un fluide, qui traverse la phase stationnaire. Dans notre cas, la phase mobile est liquide et la phase fixe est solide : c est une chromatographie d adsoption. La séparation est due à la différence d adsorbabilité des divers composants du mélange : ceux-ci, étant plus ou moins fortement adsorbés par la phase stationnaire solide, migreront donc plus ou moins rapidement au travers de la colonne. La phase stationnaire est un solide adsorbant : l alumine. Un tube, contenant l adsorbant, est parcouru par un courant d éluant liquide dans lequel on introduira, à un instant donné, une certaine quantité du mélange à séparer. Ce mélange est entraîné par l éluant et est séparé dans la colonne au contact avec l adsorbant. On favorise souvent le pouvoir de séparation en augmentant progressivement le pouvoir éluant de la phase mobile; on est donc généralement conduit à modifier la nature de l éluant en cours de séparation. a - Préparation de la colonne Remplir le tube de la colonne (d une hauteur de 6 cm environ) d éther de pétrole; puis, à l aide d un petit entonnoir sec placé en haut de la colonne, introduire lentement de l alumine (jusqu à une hauteur de 4-5 cm environ) tout en restant recouvert d éther de pétrole. L alumine versée doit s écouler lentement et sédimenter uniformément. La surface supérieure de l alumine sera ensuite nivelée à l horizontale en tapotant légèrement le tube. Ouvrir le robinet pour laisser s écouler l éther de pétrole, jusqu à ce que le niveau de ce dernier soit de 1 à 2 mm environ au-dessus de la couche d alumine; puis refermer le robinet. La colonne est ainsi prête à l emploi. Attention : Il faut toujours du liquide au-dessus de la colonne, sinon celle-ci pourrait se fissurer en séchant! b - Utilisation de la colonne pour la séparation Introduire dans la colonne environ 5-6 gouttes du mélange à séparer (fuchsine-rouge de méthyle, 1/1) en déposant ce dernier (prélevé à l aide d une pipette graduée) avec précautions près de la surface d alumine : il faut introduire la pipette lentement dans le tube de la colonne, en s aidant des deux mains pour éviter de toucher les parois internes du tube, jusqu à ce que la pointe de la pipette soit à quelques millimètres au-dessus de l alumine. Ouvrir le robinet et laisser s écouler du liquide jusqu à ce que le mélange soit adsorbé à la surface supérieure de la couche d alumine, puis refermer le robinet. Verser lentement, le long des parois internes du tube, un peu (1 à 2 ml) d éther de pétrole de façon à rincer ces parois, et laisser à nouveau s écouler du liquide jusqu à la surface supérieure de l alumine. On fera s écouler ensuite, successivement et dans l ordre indiqué ci-dessous, les éluants suivants, en veillant : - à ne rajouter un nouvel éluant que lorsque le précédent ne sera plus qu à 1 ou 2 mm au-dessus de la couche d alumine;
6 - à verser les liquides lentement, le long des parois internes du tube, pour éviter de perturber par turbulence la couche d alumine. - 5 ml d éther de pétrole - 5 ml de propanone - 5 ml d un mélange 1/1 d éther de pétrole - toluène - 5 ml d éthanol - 5 ml d un mélange 1/1 de toluène - éther diéthylique - 5 ml d eau. - 5 ml d éther diéthylique - 5 ml d un mélange 1/1 d éther diéthylique - propanone Les deux fractions colorées seront recueillies séparément dans des tubes à hémolyse. Les fractions non colorées (éluants) seront toutes collectées dans le même erlenmeyer : récupération des solvants usés. Ne pas les jeter à l évier! IV - ANALYSE PAR CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE 1 - Principe La chromatographie sur plaque est également une chromatographie d adsorption que l on effectue surtout en vue d une analyse d un mélange. Sur une plaque chromatographique, tracer, au crayon de papier, un trait à 1 cm environ du bord inférieur et parallèlement à ce dernier. Déposer sur le trait, à l aide de tubes capillaires, à 0,5 cm d intervalle, une microgoutte de : - solution de fuchsine témoin - solution de fuchsine obtenue - solution de rouge de méthyle témoin - solution de rouge de méthyle obtenue - solution du mélange témoin - solution du mélange obtenue. Laisser sécher les taches avant d éluer. On fait monter le long de la plaque, par capillarité, le solvant d élution choisi : mélange à 30% d acétate d éthyle + 70% de cyclohexane. Couvrir le bac d élution par une plaque de verre, afin que l atmosphère, dans le bac, reste saturée en vapeurs d éluant. Attention : Le trait, dessiné sur la plaque, ne doit pas tremper dans le solvant d élution contenu dans le bac! Lorsque le solvant qui monte a atteint les ¾ environ de la hauteur de la plaque (front du solvant), sortir la plaque et marquer immédiatement (car le solvant s évapore très vite) la hauteur du front à l aide d un crayon de papier, puis laisser évaporer le solvant. Mesurer ensuite, avec une règle graduée : - la hauteur du front du solvant; - les Rf des substances différentes (centre des taches). Rq : la manipulation de solvants organiques volatils et inflammables nécessite l utilisation de la ventilation.
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