Analyse d images numériques en microscopie

Analyse d images numériques en microscopie Yves Usson Reconnaissance et Microscopie Quantitative, Laboratoire TIMC UMR5525 CNRS Institut d Ingénierie et d Information de Santé (IN3S), La Tronche Traitement d images cours 1-1 Yves Usson

1 INTRODUCTION... 2 2 SEGMENTATION... 2 2.1 BINARISATION... 2 2.1.1 APPROCHE RÉGIONS... 2 2.1.2 APPROCHE FRONTIÈRES... 3 2.2 FILTRAGE DE FORMES... 3 2.3 ETIQUETAGE EN COMPOSANTES CONNEXES... 5 3 EXTRACTION DE MESURES OU PARAMÉTRISATION... 6 3.1 MORPHOMÉTRIE... 6 3.2 PHOTOMÉTRIE... 7 3.2.1 MESURE DE L INTENSITÉ... 7 3.2.2 FLUOROGRAMMES... 8 Traitement d images cours 1-1 Yves Usson

1 Introduction Analyse d images numériques en microscopie L analyse d images est la séquence d opérations qui va permettre d extraire des mesures quantitatives objectives d une image numérique. Pouvant être précédée d une étape de traitement dans un but de restauration du signal, elle peut-être décomposée en trois étapes successives : 1 ) la segmentation qui va permettre de spécifier les structures d intérêts de l image et de les extraire sous la forme de masques de mesure, 2 ) l extraction de mesures s appuyant sur les masques de segmentation, et enfin 3 ) l analyse des données qui relève plus du domaine des statistiques que de l analyse d image à proprement parler. 2 Segmentation Définition : Phase d interprétation d une image sous forme d entités décrites en terme de régions et de contours. La segmentation porte sur l élaboration de processus de détection, suivie d une mise en correspondance. La détection inclut l intégration d un indice visuel couramment décrit en terme de similarité (région) ou de dissimilarité (frontière). La mise en correspondance concerne le regroupement des points appartenant à une même entité. La segmentation est de loin la phase la plus délicate de l analyse d images car elle doit permettre d interpréter la scène aussi bien (voir mieux) que le ferait un observateur. Elle conditionne la pertinence des mesures effectuées. Elle vise donc à définir les zones d'intérêt dans une image. Deux types d'approches sont habituellement utilisées: l'approche par régions et l'approche par frontières. Le but de ces approches est de créer des images binaires à partir d'images niveaux de gris. C'est-à-dire des images dans lesquelles il n'existe que deux classes de pixels: les pixels objets qui correspondent aux zones d'intérêts et les pixels fonds qui correspondent à tout ce qui n'est pas zone d'intérêt. Les pixels objets définissent des masques binaires qui seront mis à profit pour les mesures morphologiques et photométriques. Remarque : Il n existe pas d algorithme universel de segmentation, à chaque type d images correspond une approche spécifique. 2.1 Binarisation 2.1.1 Approche régions Dans le chapitre précédent, nous avons vu que la distribution des niveaux de gris dans l'image constitue déjà une information précieuse que l'on peut mettre à profit pour identifier des régions particulières de l'image. pixels objets Figure 2.1 - Segmentation, approche par régions. Seuillage de l histogramme des niveaux de gris. Traitement d images cours 1-2 Yves Usson

Il est donc possible d'extraire les masques binaires de régions en appliquant un simple seuillage des niveaux de gris. Ainsi tous les pixels dont les niveaux de gris sont compris entre deux seuils sont considérés comme des pixels "objets" et tous les autres comme des pixels "fonds". La Figure 2.1 illustre cette méthode. Sur l'histogramme, on définit une plage (ou fenêtre) de seuillage, avec un seuil minimum à 60 et un seuil maximum à 255. Le masque binaire obtenu est représenté avec les pixels objets en noir. Comme le laissait prévoir l'allure de l'histogramme on a isolé les noyaux fluorescents. 2.1.2 Approche frontières Dans certains cas, il est difficile de distinguer des zones par leur valeur de niveaux de gris. Cependant il est possible d'en distinguer les frontières. La méthode de segmentation devra tirer parti de cette propriété. Dans ce cas, un prétraitement de l'image au moyen d'un filtre numérique permet de mettre en évidence les frontières. Différents filtres (Sobel, Prewitt, Laplacien ) ont été développés pour ce type de traitement et tous se basent sur la détection des gradients d'intensité. Ils procèdent en recherchant dans l'image les zones de plus fortes variations d'intensité. Figure 2.2 - Segmentation, approche par frontières. Détection des frontières par un filtre de gradient puis seuillage des niveaux de gris. La Figure 2.2 montre le résultat du traitement par un filtre de Sobel. Les zones de fort gradient apparaissent en clair. Il est ensuite possible de seuiller les niveaux de gris de l'image des gradients pour obtenir un masque binaire des frontières. 2.2 Filtrage de formes Les masques binaires obtenus par les méthodes de segmentation précédemment exposées ne sont pas toujours parfaits. Ils peuvent en effet comporter de nombreuses imperfections: éléments artéfactuels, trous dans les structures, contours déchiquetés Ces masques de segmentation ne peuvent donc pas être utilisés directement pour effectuer des mesures. Il faut les corriger afin d'éliminer les éléments artefactuels, boucher les trous dans les masques et éventuellement lisser les contours des masques. Ces différentes manipulations sont réalisées à l'aide d'opérateurs morphologiques. Il existe principalement deux opérateurs morphologiques: l'érosion et la dilatation. D'autres opérateurs peuvent être construits en combinants les deux précédents. Traitement d images cours 1-3 Yves Usson

L'érosion est une opération qui va avoir tendance à réduire la masse des objets. On considère que dans une image binaire tous les pixels objets ont une valeur de 1 et les pixels du fond ont une valeur de 0. Pour chaque pixel (Fig. 2.3) considéré individuellement, on regarde sa valeur et la valeur des 4 pixels immédiatement voisins (c'est-à-dire ceux partageant une face avec le pixel considéré). Parmi ses valeurs, on recherche la plus petite. Puis, on remplace dans l'image résultat la valeur du pixel considéré par cette valeur minimum. Pour une image binaire, le résultat de ce traitement revient à transformer en pixels du fond les pixels objets en contact direct avec des pixels du fond. Cela revient à "raboter" d'une couche de pixels les masques des objets. Figure 2.3 - Filtrage morphologique: érosion. A gauche le masque original: les pixels blancs correspondent au fond, les noirs à l objet. Les pixels grisés sont ceux qui seront convertis en pixels du fond par l érosion. L érosion consiste donc à propager le fond au détriment de l objet. La dilatation est l'opération complémentaire de l'érosion. Dans ce cas (Fig.2.4), on recherche la valeur la grande du voisinage. Pour une image binaire, le résultat de ce traitement revient à transformer en pixels objets, les pixels du fond en contact direct avec des pixels objets. Cela revient donc à épaissir d'une couche de pixels les masques des objets. Figure 2.4 - Filtrage morphologique: dilatation. A gauche le masque original: les pixels blancs correspondent au fond, les noirs à l objet. Les pixels grisés sont ceux qui seront convertis en pixels objets par la dilatation. La dilatation consiste donc à propager l objet au détriment du fond. Les opérations de dilatation et d'érosion peuvent être appliquées itérativement c'est-à-dire de façon répétitive. Par exemple, une érosion de profondeur 3 consistera à appliquer 3 érosions successives à l'image binaire. Ainsi, on peut faire disparaître des structures dont le rayon est inférieur ou égal à 3 pixels. De même, une dilatation de profondeur 3 permettra de boucher les trous dont le rayon est inférieur ou égal à 3 pixels. Traitement d images cours 1-4 Yves Usson

Figure 2.5 - Filtrage morphologique: fermeture morphologiques. En noir: pixels objets; en blanc: pixels du fond. La fermeture consiste à appliquer à l'image binaire une dilatation d'une profondeur donnée suivie d'une érosion de profondeur identique. La dilatation va permettre de boucher les trous des masques. Par exemple Figure 2.5, la dilatation comble tous les trous dans le masque du noyau. Cependant on constate que le noyau a maintenant une forme empâtée et surdimensionnée. La mesure de paramètres morphologiques sur ce masque serait donc surévaluée. L'érosion qui suit permet de compenser cet épaississement. On constate que le masque du noyau a retrouvé ses dimensions originales alors que son contour apparaît moins échancré. La fermeture a aussi effectué un lissage du contour. L'ouverture consiste à appliquer à l'image binaire une érosion d'une profondeur donnée suivie d'une dilatation de profondeur identique. L'érosion va permettre d'éliminer les petites structures isolées. Par exemple Figure 2.6, l'érosion permet de gommer les petits artefacts et ne laisser subsister que le masque du noyau. L'érosion a cependant sensiblement réduit la masse du noyau et les mesures morphométriques seraient sous-évaluées. La dilatation permet de retrouver les dimensions originales du noyau. Figure 2.6 - Filtrage morphologique: ouverture morphologiques. En noir: pixels objets; en blanc: pixels du fond. 2.3 Etiquetage en composantes connexes Une dernière étape est nécessaire avant de passer à la paramétrisation. Le seuillage et le filtrage morphologique permettent de définir quelles sont les régions d'intérêt dans l'image. Cependant il est nécessaire dans de nombreux cas de pouvoir distinguer différentes entités au sein de l'image binaire afin d'individualiser les mesures. Figure 2.7 - Etiquetage en composantes connexes. L'opération consiste à attribuer un numéro unique à tous les pixels appartenant à un objet isolé. Notion de chemin connexe :c et d peuvent être reliés sans avoir à passer par le fond (chemin connexe), alors que a et b ne peuvent être reliés sans avoir à passer sur le fond (chemin non- connexe). Traitement d images cours 1-5 Yves Usson

Par exemple, si l'on souhaite connaître la surface moyenne d un noyau il faut pouvoir extraire un par un chacun des masques correspondant à une hématie. Ceci est rendu possible par un étiquetage préalable de l'image binaire. L'étiquetage consiste à attribuer à chacune des régions séparées (composantes connexes) une étiquette c'est-à-dire un numéro unique qui sera attribué à chacun des pixels appartenant à une même composante connexe (Fig. 2.7). La notion de connexité représente ici la notion de voisinage par contact direct. En général, on utilise deux règles de connexité: -la connexité 4 où sont considérés connexes les quatre voisins latéraux (droite, gauche, dessus, dessous); -la connexité 8 où sont considérés connexes les quatre voisins latéraux (droite, gauche, dessus, dessous) et les quatre voisins diagonaux (Fig. 2.8). 4 connexité 8 connexité 4 connexité 8 connexité Figure 2.8 - Etiquetage et règles de connexité. En connexité 4 deux objets sont identifiés; en connexité 8 un seul objet est étiqueté, les deux plages sont connectées par la diagonale. 3 Extraction de mesures ou paramétrisation 3.1 Morphométrie La morphométrie va consister à effectuer des mesures morphologiques à partir des masques binaires. Après extraction du masque d'un objet étiqueté, il est possible d'obtenir directement un certain nombre de mesures (Fig.3.1). Par exemple la surface de l'objet peut être obtenu par un simple comptage du nombre de pixels appartenant au masque de l'objet. Connaissant la surface d'un pixel il est facile d'obtenir une mesure de surface directement exprimée en µm 2 par exemple. On peut également calculer le barycentre du masque. En effet dans certaines études à caractère histologique il est souvent intéressant de connaître la position des cellules par référence à une structure histologique particulière (bordure d'un tissu, lumière d'une glande ) ou encore d'étudier la disposition relative de cellules dans un tissu sain ou pathologique. Figure 3.1 - Morphométrie. Extraction de mesures morphologiques à partir du masque binaire ou du contour. D'autres mesures peuvent être obtenues après extraction du contour du masque. La mesure du périmètre est dérivée de la séquence de pixels appartenant au contour. Deux pixels consécutifs voisins en connexité 4 représenteront une distance d'une unité; deux pixels consécutifs voisins par la diagonale Traitement d images cours 1-6 Yves Usson

représenteront une distance de racine de deux. Connaissant la dimension latérale d'un pixel il est donc possible de d exprimer directement la mesure du périmètre en µm. On peut également exprimer la complexité de la forme du masque au moyen de l'énergie de courbure, du facteur de forme (ou circularité), des diamètres de ferret 3.2 Photométrie 3.2.1 Mesure de l intensité A partir de l'information photométrique contenue dans l'image des niveaux de gris il va être possible (avec certaines réserves cependant) de mesurer des quantités de matière présente dans les objets. En fluorescence l'intensité de lumière dans chaque pixel renseignera sur la concentration de la sonde fluorescente pour peu que le marquage soit stœchiométrique, et les conditions chimiques et d éclairement soient bien maitrisées. Afin que la quantité de lumière fluorescente ait un sens, il est nécessaire d effectuer un prétraitement aux images (fig.3.2). Figure 3.2 -. Correction de l intensité de fluorescence en chaque pixel. L intensité du pixel est divisée par l intensité du pixel correspondant de l image d une source fluorescente homogène. Deux corrections s avèrent nécessaires. Premièrement il faut soustraire le courant noir des images. Cette soustraction est obtenue en enregistrant l image d un champ parfaitement obscur en fermant l obturateur de la caméra. Cette image noire contient en fait les irrégularités d intensité liés aux défauts de fabrication du capteur. Ensuite on soustrait pixel par pixel cette image noire de l image de fluorescence. Ainsi on élimine les faibles variations de signal dues aux imperfections du capteur. Deuxièmement il faut corriger les défauts liés à l éclairage du microscope. En effet l intensité de la lumière d excitation varie suivant la position à l intérieur du champ du microscope. Aussi des variations d intensité de fluorescence observées en différents points pourraient ne pas être significatives. Pour corriger ce problème on enregistre l image d un champ de fluorescence homogène appelé référence d homogénéité. Ceci est obtenu soit avec des verres spéciaux fluorescents (verre d uranyl) ou bien avec des plaques d altuglass fluorescent (règles d écolier en plastique fluo) ou bien encore avec des solutions de fluorochromes étalées en film entre lame et lamelle. Une fois cette image Traitement d images cours 1-7 Yves Usson

enregistrée on divisera pixel par pixel l image de fluorescence à mesurer par l image de la référence d homogénéité. 3.2.2 Fluorogrammes L'étude de la co-localisation de deux structures protéiques ou nucléiques est une des applications majeures de la CLSM. Les structures sont marquées par des sondes couplées à des fluorochromes ayant des caractéristiques spectrales d'excitation et d'émission différentes, pour pouvoir acquérir leurs images de façon spécifique. La superposition en couleur des deux images visualise le degré de co-localisation. Pour un fluorochrome visualisé en rouge, l'autre en vert, les zones colocalisées apparaissent jaunes. Cette première étape n'est pas toujours suffisante pour estimer le degré de co-localisation. Elle peut se compléter efficacement par la réalisation d'un fluorogramme (ou histogramme bi-paramétrique de fluorescence). Un fluorogramme est un nuage de points correspondant aux pixels ou aux voxels de l'image 2D ou 3D, et dont les coordonnées sont les valeurs de l'intensité de fluorescence de deux fluorochromes analysés, dans le rouge et le vert par exemple (Fig. 3.3). Il donne une représentation graphique de la distribution conjointe des deux fluorescences. Le nuage peut correspondre à la totalité de l'image, à une région comme une cellule en biologie ou à l'environnement immédiat d'un voxel pour construire une carte de corrélations locales. Les points se concentrent autour d'une droite dans une situation de forte co-localisation ou s'écartent du modèle de régression linéaire, quand le niveau de colocalisation s'atténue. C'est une représentation familière en cytométrie de flux pour estimer le pourcentage de cellules doublement positives, le point étant alors une cellule et non un voxel. Figure 3.3 F luorogramme de cellules HeLa transfectées avec un plasmide codant pour le EGFPtopoisomérase II. Le canal rouge correspond à une coloration de l ADN et le canal vert à la GFP. Sur quatre cellules présentes, seules deux expriment la topoisomérase et sont à l origine des nuages de points c 1 et c 2 correspondant à leurs noyaux et v correspondant à leurs cytoplasmes. Le nuage r correspond aux noyaux des cellules n exprimant pas la topoisomérase. Le contraste a été inversé pour faciliter la visualisation des signaux Plusieurs méthodes de quantification sont dérivées du fluorogramme. On évalue, par exemple, le nombre de points situés dans les zones positives, négatives, simplement ou doublement marqués. On calcule le coefficient de corrélation linéaire ou des coefficients similaires proposés pour mieux tenir compte de différences d'intensité ou de proportion entre les deux marquages. Les fluorogrammes permettent d'estimer la co-localisation de deux structures, mais aussi de contrôler les conditions d'acquisitions : correspondance des images, passage de fluorescenced'un canal à l'autre, stabilité de la fluorescence, amélioration du rapport signal/bruit. Ils s'appliquent à des modalités de fluorescence différentes, spectrales mais aussi temporelles. Traitement d images cours 1-8 Yves Usson