1. Les propriétés des biomolécules

1. Les propriétés des biomolécules Acides aminés, peptides et protéines Acides nucléiques et AD Comparaison de la chimie analytique classique et la chimie bioanalytique 1 1.1 Acides aminés, peptides et protéines Les peptides et protéines sont constitués d acides aminés, reliés entre eux par un lien amide. Les acide aminés: 1 2 1 2 Acide αaminé 2 α Acide βaminé 2 β α Les protéines sont constituées d une vingtaine d acides αaminés naturels. D autres acides aminés sont aussi retrouvés dans des peptides qui sont biologiquement actifs et dans certaines protéines. 2

Une chaîne de quelques centaines d acides aminés, dont la masse moléculaire est typiquement < 10 kda constitue un polypeptide. Les protéines sont constituées d un ou plusieurs polypeptides et possèdent des masses moléculaires élevées; la majorité des protéines ayant des masses moléculaires entre 10 et 100 kda (où 1 kilodalton (kda) = 1000 g/mol). La séquence des acides aminés et leur arrangement spatial déterminent la structure ainsi que la fonction des protéines et peptides dans des processus biologiques. 3 1.1.1 Structure et propriétés des acides αamines Structure générale des acides αaminés naturels: forme neutre 2 C C forme zwitterionique à p physiologique 3 C C groupement latéral Les différents groupements latéraux des acides αaminés naturels varient selon leur grandeur, forme, charge, capacité à créer des ponts hydrogène et réactivité chimique. 4

Classification des acides αaminés naturels Groupement latéral basique: charge positive à p neutre 3 C C 3 C C 3 C C 3 Lysine (Lys; K) C 2 2 Arginine (Arg; ) istidine (is; ) 5 Groupement latéral acide: charge négative à p neutre 3 CC 3 CC C Acide aspartique (Asp; D) C Acide glutamique (Glu; E) Groupement latéral amide 3 CC 3 CC C 2 Asparagine (Asn; ) C 2 Glutamine (Gln; Q) 6

Groupement latéral aliphatique 3 CC Glycine (Gly; G) 3 CC C 3 Alanine (Ala; A) 3 CC C C 3 C 3 Valine (Val; V) 3 CC C C 3 C 3 Leucine (Leu; L) 3 CC C C 3 C 3 Isoleucine (Ile; I) (isomère de Leu) 7 Groupement latéral aromatique 3 CC 3 CC Phénylalanine (Phe; F) 3 CC Tyrosine (Tyr; Y) Tryptophane (Trp; W) 8

Groupement latéral sulfuré 3 CC 3 CC S Cystéine (Cys; C) S C 3 Méthionine (Met; M) Groupement latéral hydroxyle 3 CC Sérine (Ser; S) 3 CC C C 3 Thréonine (Thr; T) 9 Acide aminé secondaire C 2 Proline (Pro; P) Acides aminés modifiés C 3 CC 3 CC 2 4ydroxyproline C C C γcarboxyglutamate P Phosphosérine 10

Stéréochimie des acides αaminés Les acides αaminés naturels: sont tous chirals (et donc optiquement actifs), à l exception de la glycine pour laquelle le substituant latéral est un atome d hydrogène sont tous de configuration L selon la convention de Fischer ou S selon la notation de CahnIngoldPrelog, à l exception de la cystéine qui est de configuration. C= centre chiral 3 C C 3 C C C C 3 3 S 2 C C 3 C LAlanine ou (S)Alanine DAlanine ou ()Alanine ()Cystéine 11 Propriétés acidobasiques des acides αaminés Les acides aminés sont des acides polyprotiques. Les acides aminés sont amphotères; ils possèdent à la fois un groupement acide (acide carboxylique, pk a 1.8 2.5) et un groupement basique (amine, pk a 8.7 10.7). 3 C C K 1 3 C C K 2 2 C 3 3 C p 1 p 7 p 11 zwitterion Les groupements latéraux ionisables ont aussi des valeurs de pk a (voir Table 1.1). 12

3 C C K 1 3 C C K 1 = 3 C C 3 C C 3 C C log K 1 = log 3 C C 3 C C pk 1 = p log 3 C C log [ ] 13 3 K 2 C C 2 C C K 2 = 2 C C 3 pk 2 = log K 2 C C 14

Table 1.1 Valeurs de pk a et pi des acides αaminés naturels (D.C. arris, Exploring Chemical Analysis, 2è éd. 2001; A. Manz,. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) Acide αaminé (abréviations) pk 1 αc pk 2 α 3 pk groupement latéral pi Lysine (Lys; K) istidine (is; ) Arginine (Arg; ) Acide aspartique (Asp; D) Acide glutamique (Glu; E) Asparagine (Asn; ) Glutamine (Gln; Q) Glycine (Gly; G) 2.04 1.7 1.823 1.990 2.23 2.14 2.17 2.350 9.08 9.08 8.991 10.002 9.95 8.72 9.01 9.778 10.69 (ε 3 ) 6.02 (imidazole) 12.48 (guanidino) 3.900 (βc) 4.42 (γc) 9.74 7.58 10.76 2.87 3.22 5.41 5.65 5.97 15 Acide αaminé (abréviations) pk 1 αc pk 2 α 3 pk (groupement latéral) pi Alanine (Ala; A) Valine (Val; V) Leucine (Leu; L) Isoleucine (Ile; I) Phénylalanine (Phe; F) Tyrosine (Tyr; Y) Tryptophane (Trp; W) Cystéine (Cys; C) Méthionine (Met; M) Sérine (Ser; S) Thréonine (Thr; T) Proline (Pro; P) 2.348 2.286 2.329 2.319 2.20 2.17 2.35 1.71 2.20 2.187 2.088 1.952 9.867 9.718 9.747 9.754 9.31 9.19 9.33 10.77 9.05 9.209 9.100 10.640 10.47 (phénol) 8.36 (sulfhydryl) 6.02 5.97 5.98 6.02 5.98 5.65 5.88 5.02 5.75 5.68 6.53 6.10 16

Exemple 1.1: Les différentes espèces de l alanine en fonction du p 2 CC C 3 αc, pk 1 = 2.35 α 3, pk 2 = 9.87 p 1.3: 3 CC p 4.0: 3 CC C 3 C 3 p 2.35: 3 CC 50% C 3 3 CC 50% p 7.0: 3 CC C 3 C 3 17 p 9.87: 3 C C 50% C 3 2 C C 50% C 3 p 10.9: 2 C C C 3 18

Exemple 1.2: Les différentes espèces de l acide aspartique en fonction du p 2 CC αc, pk 1 = 1.99 α 3, pk 2 = 10.00 C βc, pk = 3.90 p 1.0: 3 CC p 2.0: 3 CC 50% C C p 3.0: 3 CC 3 CC 50% C C 19 p 3.9: 3 CC 50% p 10.0: 3 C C 50% C C 3 CC 50% 2 C C 50% C C p 7.0: 3 CC p 11.0: 2 C C C C 20

Pour chaque acide aminé, il existe une valeur spécifique du p où la charge globale de la molécule est nulle. Cette valeur de p représente le point isoélectrique où la concentration du zwitterion de l acide aminé est maximale. Au point isoélectrique, il n y a pas de migration de l acide aminé dans un champ électrique appliqué. Le point isoélectrique (pi) peut être estimé à partir de l équation de endersonasselbalch: 1 pi = (pk i pk j) 2 où pk i et pk j sont les constantes de dissociation des étapes impliquées. 21 Ce calcul est simple pour des acides aminés ayant seulement un groupement amine et un acide carboxylique; pk i et pk j étant les valeurs de pk a pour αc et α 3, respectivement. Exemple: pi 1 = 2 ( 2.286 9.718) 6. 00 valine = Pour des acides aminés ayant des groupements latéraux ionisables, le calcul du pi est plus compliqué (voir les Table 1.1 et 1.2 pour les valeurs de pi des acides αaminés naturels et de quelques protéines). Les différences de pi sont utilisées pour séparer les acides aminés, les polypeptides et les protéines dans un champ électrique (i.e. techniques d électrophorèse). 22

% des espèces d alanine existantes vs. p 3 C C C 3 3 C C C 3 2 C C C 3 100 % d espèces 50 pi 6.02 2.35 9.87 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 p (D après S.. Eğe, rganic Chemistry, 3è éd., 1994) 23 Courbe de titrage de l alanine (D après D.J. olme,. Peck, Analytical Biochemistry, 3è éd., 1998) 24

Exemple 1.3: Évolution des différentes espèces de la lysine en fonction du p 3 C C ( ) 4 3 αc, pk 1 = 2.04 α 3, pk 2 = 9.08 ε 3, pk = 10.69 pi= 9.74 3 C C 3 C C 2 C C 2 C C ( ) 4 3 3 ( ) 4 3 3 ( ) 4 3 3 ( ) 4 2 p 1 p 7 p 9.74 p 12 25 Les mêmes notions de propriétés acidobasiques s appliquent aux peptides: LysAlaGly 3 C C ( ) 4 3 C 3 C C CC p=1 3 C C ( ) 4 3 C 3 C C CC p=7 2 C C ( ) 4 C 3 C C CC p=11 2 26

Table 1.2 Valeurs de pi de quelques protéines (A. Manz,. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) p < pi: p> pi: protéine chargée positivement protéine chargée négativement 27 1.1.2 Structure des protéines 1. Structure primaire: La séquence ou l ordre d enchaînement des acides aminés dans une protéine (ou polypeptide) définit la structure primaire de la protéine (ou polypeptide). La structure primaire caractérise une protéine de manière univoque. La simple substitution d un acide aminé pour un autre peut drastiquement affecter l activité et la fonction d une protéine, pouvant ainsi causer des maladies et désordres physiologiques. Les acides aminés sont reliés entre eux par un lien amide: liaison peptidique 1 2 2 1 2 2 2 dipeptide 28

Dû à son caractère de double lien partiel, il n y a pas de rotation du lien C: L unité peptidique C est rigide. Les liens de chaque côté du Cα peuvent tourner (en dedans de contraintes stériques) et jouent un rôle important dans le repliement d une protéine. 2 α rotation rigide rotation 1 α 2 29 Un tétrapeptide de séquence SerAlaCysGly: squelette 3 groupement latéral S C 3 acide aminé terminal acide aminé Cterminal Il est peu probable qu un acide aminé donné excède 10% de la composition totale d une protéine. Avec 20 acides αaminés naturels, il existe un nombre immense de combinaisons et permutations possibles: Dipeptide: 20 2 = 400 arrangements possibles Tripeptide: 20 3 = 8000 arrangements possibles Petite protéine constituée de 100 acides aminés: 20 100 = 1.27 x 10 130 différentes séquences possibles! 30

2. Structure secondaire: La structure secondaire d une protéine se réfère aux régions d une protéine dans lesquelles les chaînes peptidiques sont organisées dans des structures régulières, tels les hélices α et les feuillets plissés β. Ces structures régulières sont déterminées par la conformation du squelette peptidique; l influence des groupements latéraux des acides aminés n est pas tenue en compte. Les hélices α et les feuillets plissés β résultent de la formation de ponts hydrogène entre les groupements C= et du squelette peptidique. δ δ 31 élice α Cette forme hélicoïdale résulte de la formation de ponts hydrogène entre le groupement C= du n ième résidu d acide aminé et le groupement du (n4) ième résidu. axe Chaque tour complet de la spirale est constitué d environ 3.6 résidus d acide aminé pour assurer l alignement des groupements C= (pointant vers le bas) et (pontant vers le haut). Les groupements latéraux sont orientés vers l extérieur, perpendiculairement à l axe de la spirale. 32

Feuillets plissés β Dans un feuillet plissé β, deux chaînes peptidiques sont pliées et alignées l une à côté de l autre. Le repliement β des chaînes peptidiques est favorisé dans le cas d acides aminés portant des petits groupement latéraux nonchargés. Les chaînes peptidiques sont maintenues par des ponts hydrogène. Les groupements latéraux sont orientés vers l extérieur, pointant vers le haut et le bas de chaque feuillet. Les chaînes adjacentes peuvent être alignées, soient dans la même direction (plis parallèle β) ou dans des directions opposées (plis antiparallèle β). 33 3. Structure tertiaire: La structure tertiaire d une protéine décrit la configuration tridimensionnelle (3D) d une chaîne polypeptidique. Elle inclut la relation entre les différents domaines (hélice α et feuillets plissés β) formés par la structure secondaire de la protéine et les interactions des groupements latéraux. La structure 3D est thermodynamiquement stable dans un domaine restreint de température, p et force ionique. Audelà de ce domaine une protéine peut se déplier et perdre sont activité biologique (dénaturation). Structure 3D de la ribonucléase (Escherichia coli) (D après A. Manz,. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 34

4. Structure quaternaire: Une protéine peut être constituée de 2 ou plusieurs chaînes polypeptidiques différentes liées ensemble. (D après A. Manz,. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) Insuline La structure quaternaire décrit comment les différentes chaînes et autres constituants sont liés et interagissent ensemble via des ponts hydrogène, attraction électrostatique et liens disulfures. C C C C 3 C 3 C 3 C 3 C S S S S Cystéine Cystéine Cystine 35