Le Grand Plateau Technique Régional de Génotypage Pierre Mournet Monastir- Colloque EPGV Lundi 10 Octobre 2011
Le Grand Plateau Technique Régional de Génotypage Responsable scientifique: Jean Christophe Glaszmann Fédération de 2 plateaux techniques de l UMR AGAP (Montpellier) Campus de Lavalette (CIRAD) 330 m 2-160 m 2 génotypage extension bâtiment 3 (µsat, AFLP) - 60 m 2 génotypage bâtiment 3 (DArT) - 110 m 2 robotique bâtiment 3 (bactériologie/robotique) Campus de la Gaillarde (INRA): Atelier de Marquage Moléculaire 300 m 2 Analyse de fragment d ADN (microsatellites, AFLP) sur séquenceurs capillaires et gel acrylamide. Détection de SNP en HRM. Séquençage sur séquenceur capillaire (Sanger) Construction de ressources biologiques: banques génomiques enrichies en locus microsatellites, banques cdna, banques BAC, banques DArT. Finalité: Analyse structurale des génomes des plantes, recherche de polymorphismes moléculaires en vue de la connaissance, de la gestion et de l utilisation de la diversité dans des programmes d amélioration génétique.
Le GPTR Génotypage. Le GPTR respecte la charte des plates-formes Gis IBiSa Ouverture, accueil des utilisateurs extérieurs. Tarifs d accueil calculés sur utilisation matériel à plein temps. Personnels dédiés à charge des établissements porteurs: 2.5 ETP IR, 1.5 ETP AI, 2 ETP TR, 1 AT, 0.5 ETP qualité. Comité des utilisateurs, enquête de satisfaction. Conseil de gestion réunissant les responsables. Veille et évolution technologique. Développements méthodologiques et techniques. Gestion des réservations par intranet après accueil et formation des intervenants extérieurs par le personnel plateau. Suivi de l assurance qualité recherche INRA sur le plateau de La Gaillarde, mise en place norme Iso 9001 pour le plateau Cirad Lavalette.
Plateau de Génotypage UMR AGAP/Campus de Lavallette A-M RISTERUCCI Coordinateur plateau de génomique Robotique et Génotypage (UMR AGAP) Xavier SABAU, responsable Génotypage Ronan RIVALLAN, tech. Hélène VIGNES, tech. DArT Pierre Mournet, ing. Hélène VIGNES, tech. Robotique Xavier SABAU, ing. - Production de marqueurs moléculaires (µsat,snp,aflp) - Utilisation pour l analyse du génome et de sa diversité génétique -Equipement: 6 séquenceurs automatiques Li-Cor,1 séquenceur 24 capillaires ABI 3500XL, Roche LC 480, Robots de préparation de PCR Beckman Biomek NX,22 thermocycleurs 96,10 thermocycleurs 384 - Production de ressources DArT - Hybridation de marqueurs DArT - Utilisation pour l analyse du génome et de sa diversité génétique -Equipement: Spotteur Microgrid II, Scanner Tecan LS300 - Production et gestion de banque spécifique (SSR, DArT, BAC, cdna ) -Etudes d expression de gènes par PCR Quantitative -Equipement: Robot QPIX XT Genetix, Robot Q-FILL2 + stacker Genetix, Beckman Biomek 3000, Biorobot 9600 Qiagen
Le GPTR Génotypage: Gestion des réservations Système de réservation directe des équipements après création d un compte sur la Base de données «GRR» (serveur intranet) Permet la facturation des prestations de migration sur génotypeur
Le GPTR Génotypage: Bilans Etudes de diversité génétique et de structuration des génomes Production de cartes génétiques, études de QTL et sélection assistée par marqueurs Riz, sorgho, mil, bananier, olivier, cocotier, caféier, cannes à sucre, igname, vanille, abricotier, teck, karité, dalbergia, moabi, luzerne, vigne, palmier à huile, palmier dattier, figuier, glossines, criquets, goyave, cèphe du blé, tiques etc 52 publications Hévéa, caféier, blé dur, citrus, pommier, soja, goyavier, cacaoyer, bananier, cotonnier, palmier à huile, arachide, riz, sorgho etc.. 41 publications Production de ressources moléculaires Plus de 50 espèces concernées 37 publications Les personnels permanents du GPTR ont signés ou co-signés 76 de ces publications. Participations à des formations sur l utilisations des marqueurs moléculaires, aide au montage de laboratoires à l étranger (Cameroun, Vietnam, Kenya, Sénégal, Mali, Cote d Ivoire, Vénézuéla, Brésil ).
Plateau de génotypage Analyse polymorphisme µsat Pierre Mournet Monastir- Colloque EPGV Lundi 10 Octobre 2011
Intérêts/développement des marqueurs µsatellites Besoin d une quantité limité d ADN Marqueur Co-dominant Spécifique à un locus Hautement polymorphe Facile d utilisation Très bonne répétabilité
Microsatellite : Licor ou ABI? Caractéristiques Capacités Système Li-Cor 4300 à gel acrylamide Gel acrylamide (25cmx25cm) 2 couleurs : IRD700 et IRD800 Système robuste 1920 points de données / jour µsat. (multiplex 4) 1 plaque 96 en 1h30 Système ABI 3500xL à capillaires 24 capillaires Filtre 5 couleurs : 6-FAM, NED, PET, VIC, (LIZ MT) Polymère : pop-7 7600 points de données / jour µsat. (multiplex 8) 1 plaque 96 en 2h25 ; 1 plaque 384 en 9h Coûts Analyse sur logiciels 65 000 euros à l achat Fonctionnement peu onéreux Data point : 0.052 euro (migration) SAGA-GT 3.1 (diploïdes) Quantar Pro (polyploïdes) 175 000 euros à l achat Consommables chers (polymère) Data point : 0.076 euro (migration) GeneMapper 4.1 Exemples de Projets Diversité du Bambou du Sénégal (10 µsat, 50 éch) Sexage et diversité Baleine Méditerranée (20 µsat / 200 ind) Diversité des glossines (tsé-tsé) du Cameroun (8 µsat / 150 ind) Légitimité du Palmier à huile dans plantations (12 µsat / 2000 ind) Etude de QTL Hévéa (200 µsat / 192 ind) Cartographie pour séquençage du Cacaoyer (300 µsat / 192 ind)
Plateforme DArT (Diversity Array Technology) Pierre Mournetc Monastir- Colloque EPGV Lundi 10 Octobre 2011c
Pourquoi des DArT? Développement rapide et peu onéreux de marqueurs : Pas d information de séquence nécessaire. Pas de pré-requis pour commencer le développement. Utilisation des marqueurs DArT aussi bien sur des populations de cartographie que pour des populations de diversité. Possibilité de mener des études sur des plantes orphelines. Possibilité de developper des marqueurs de la méthylation. Capacité d analyses en parallèle de centaines ou de milliers de marqueurs. Coût réduit, quelques centimes d euros par point de données. Automatisation de la lecture des données Evaluation de la qualité des marqueurs et score individuel de confiance
DArT: Comment ça marche Developpement des puces (Création de Banques Dart, Design de puces) Analyses de routine Genepool Individu 1 ADN génomique individu2 Représentation génomique Clone Hybridation DArT chip - 1-0 - - 0-1 - Profil 1 Profil 2
DArT: Diversity Array Technology. Marqueurs dominants révélant un polymorphisme de restriction par hybridation sur microarray. Principe: 1. Création d une banque de clones représentant la diversité de l espèce étudiée et générés par une enzyme de restriction à coupure «rare» (5-6 pb) et une enzyme à coupure «fréquente» (4 pb) et amplifié par réaction PCR: Méthode de Réduction de la complexité du génome. Site PstI CTGCAG GACGTC Site PstI CTGCAG GACGTC Site BstnI TCGA AGCT Site PstI CTGCAG GACGTC ADN génomique Double restriction PstI/BstnI Amorces PstI Site PstI Site PstI Amorces PstI Amplification PCR avec des amorces PstI + Ligation d adaptateur PstI Site BstnI CGA T Site PstI T AGC Aucune amplification PCR Réduction de la complexité du génome X
DArT: Diversity Array Technology. Marqueurs dominants révélant un polymorphisme de restriction par hybridation sur microarray. Principe: 2. Préparation des puces: Dépôts des clones (produits PCR) sur lames de verre (environ 6000 clones par lames) 3. Génotypages de 96 individus : - Traitement des ADNs par le même système de réduction de la complexité que pour la banque (Restriction/Ligation/PCR ). - Hybridations de 96 lames / Lavages des lames/ Scan des lames. ADN génomique Etape 1: Préparation de le représentation génomique Morceau de vecteur marqué avec un fluororchrome FAM (signal de référence pour la normalisation) Etape 2: Marquage des cibles avec un fluorochrome Cy3/Cy5 Etape 3: hybridation des génotypes sur puce (1puce=1génotype) Etape 4: Lavage et scan des puces Analyse des hybridations: ratio bleu/vert pour chaque spots
DArT: Diversity Array Technology. Marqueurs dominants révélant un polymorphisme de restriction par hybridation sur microarray. Principe: 4. Analyse des images, détection automatique des spots hybridés, lecture présence/absence. Trie des marqueurs sur des seuils de qualité P et Q. (en moyenne 7 à 10% de marqueurs polymorphes) Analyses du polymorphisme sur 2 marqueurs et 1 Individu 1 Profil 1-1 - 0-1 0 P= 81.21 Q= 80.99 1 Individu n Profil n - 0-1 - Lecture absence/presence 2 P= 98.33 0 Q= 97.30 Positionnement des grilles de lecture
DArT: Diversity Array Technology. Marqueurs dominants révélant un polymorphisme de restriction par hybridation sur microarray..35 AAB Silk Malaccensis Malaccensis Malaccensis Malaccensis ABcv ABcv Siamea Malaccensis Factorial analysis: Axes 1 / 2.3.25.2 Principal Co-ordinate Analysis of the variation for 153 Musa Genotypes using 86 markers totally absent from the M balbisiana species. (Risterucci et al.,2009) Ibota Ney mannan Bluggoe Buaya Burmanica Buaya Siamea ABB indet Zebrina Zebrina Truncata Siamea AAB Indet Banksii -.45 -.4 -.35 -.3 -.25 -.2 -.15 -.1 -.05.05.1.15.2.25.3.35.4 Monthan Nzumoigne Orotava Saba AAB? Banksii Zebrina Orotava -.05 Microcarpa Zebrina ABB indet Pelipita ABB Peyan/ Pisang Awak AAA Mutika 40.6% for axis 1 10.9% for axis 2 Burmanicoides Wild Banksii.15.1.05 -.1 AAA Indet AAS Banksii Banksii Wild Banksii Wild Banksii -.15 AS AS Wild Banksii Iholena AAB Plantain AS -.2 -.25 Nadan AAB? AAB Popoulou/Laknao Pome/Prata Cav. AAA Cav. Missore/P ceylan Cav. AS Cav. Pome/Prata Ambon Nendra padathithi Mlali Red Mlali Gros Michel Gros Michel Ambon Cav. Cav. Banksii AAB? Rio Microcarpa P Rajah Cav. Banksii Microcarpa Microcarpa Microcarpa Errans Banksii Cav. AAB? Ibota Ibota Ibota Red Gros Michel AAA indet AA cv AA wild AB AS AAA AAB ABB
Marqueurs de méthylation DArT Site PstI CTGCAG GACGTC Site PstI CTGCAG GACGTC Site HpaII méthylé Met CCGG GGCC Met Site PstI CTGCAG GACGTC ADN génomique Double restriction PstI/ HpaII + Ligation d adaptateur PstI Amorces PstI Met CCGG GGCC Met Amorces PstI Amplification PCR avec des amorces PstI CCGG GGCC CCGG GGCC Site HpaII / MspI conservé dans la représentation CCGG GGCC
Pourquoi des marqueurs de méthylation DArT? Choc génomique chez les Citrus Micrantha (C. micrantha) Mandarines (C. reticulata) Pamplemousses (C. maxima) Bigarades (C. aurantium) Oranges (C. sinensis) Limes (C. aurantifolia) Etude des polymorphismes de méthylation de l ADN en situation intra ou interspécifiques par la technique DArT Citrons (C. limon) Pomelos (C. paradisi)
Equipements DArT Spotteur BioRobotics MicroGrid II (capacité de production de 120 lames/24 heures). Scanner Tecan LS300 (Capacité de lecture de 200 lames/24 heures). Acquisitions d images sous 3 longueurs d ondes: 635 nm Cy5; 532 nm Cy3, 488 nm FAM. 2 séries de 12 chambres d hybridations. DArTdb: LIMS + Logiciel d analyse d image DArTsoft: Logiciel d analyse du polymorphisme. Création des ressources et génotypage: ~1 mois pour la préparation d une banque d environ 6000 clones. Génotypage de 2 X 96 individus en 3 jours. ~ 100 000 points de données / jour - Data point < ~0.02 euro (2 X 96 individu) DArTsoft DArTdb
Merci