Cytosquelette. I. Organisation générale. II. Microtubules A. Tubuline et microtubules

Cytosquelette 6 I. Organisation générale II. Microtubules III. Microfilaments IV. Filaments intermédiaires I. Organisation générale Contrairement à l'impression de rigidité évoquée par le terme de squelette, les trois structures qui composent le cytosquelette sont des édifices moléculaires en perpétuel renouvellement avec un comportement très dynamique et une grande plasticité structurale. Le cytosquelette est constitué de trois types de structures : les microtubules (MT), les microfilaments (MF) et les filaments intermédiaires (FI). II. Microtubules A. Tubuline et microtubules La sous-unité élémentaire des MT est un dimère de α et de β -tubuline où chaque monomère présente un site de liaison nucléotidique. Le site de la sous-unité α est bloqué sous forme GTP. L'état nucléotidique global du dimère ne dépend que du site de β qui peut lier le GTP ou le GDP et est qualifié d'échangeable. La β -tubuline est aussi une GTPase. Sous forme GTP, le dimère de tubuline est rectiligne tandis que sous forme GDP, elle présente une légère angulation. La structure théorique formée par l'enchaînement de dimères ab-ab-ab est appelée protofilament. La juxtaposition latérale de 13 protofilaments selon un arrangement cylindrique de 25 nm de diamètre forme un MT. L'extrémité des MT qui expose des α - tubulines est appelée extrémité moins ( ); celle qui expose des β -tubulines est l'extrémité plus (+). Les extrémités (+) et ( ) des MT présentent des propriétés différentes. L'extrémité (+) change de conformation selon l'état du polymère. Un MT en phase de croissance incorpore la tubuline-gtp sous la forme d'un feuillet dont les bords se rapprochent pour fermer le MT. L'incorporation de nouvelles sous-unités stimule l'activité GTPase des dimères incorporés récemment (la tubuline est sa propre GAP). Un MT en phase de croissance présente donc au bout (+) une coiffe de tubuline-gtp tandis que le reste du polymère est essentiellement sous forme GDP. Cette coiffe empêche le désassemblage spontané d'un MT. Si elle est perdue, les protofilaments deviennent libres de se courber vers l'extérieur du cylindre et de se dissocier en sous-unités de GDP-tubuline libres ( fig. 6.1A ). UE2- La cellule et les tissus 2012, Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés 81

6 Structure générale de la cellule Fig. 6.1 Microtubules. A. Assemblage et désassemblage des microtubules. B. Organisation du centrosome et nucléation des microtubules. 82

Cytosquelette 6 B. Centrosome, nucléation et élongation des microtubules, notion de concentration critique Dans la cellule, les MT croissent à partir de centres organisateurs, le plus connu étant le centrosome. C'est une structure proche du noyau qui comprend deux centrioles perpendiculaires et un matériel protéique péricentriolaire amorphe. Un centriole est formé de neuf triplets de MT assemblés en un supercylindre. Chaque triplet comprend un MT complet (tubule A) et deux tubules incomplets (B et C) qui lui sont accolés longitudinalement. Des liens protéiques unissent latéralement les neuf triplets pour former le supercylindre centriolaire. Dans le matériel péricentriolaire, la cellule concentre des complexes de γ -tubuline organisés en anneaux ouverts (un tour avec un décalage de trois sous-unités) qui servent de matrice pour nucléer (= initier l'assemblage) de nouveaux MT. Le bout ( ) des MT est au contact de la γ -tubuline, son extrémité (+) est donc orientée vers la périphérie cellulaire ( fig. 6.1B ). La phase de nucléation est suivie d'une phase de croissance ou d'élongation. In vitro, la vitesse d'élongation de MT nucléés sur un centrosome est fonction de la disponibilité de la tubuline-gtp soluble ( fig. 6.2A gauche). Remarque À concentrations très élevées ( > 20 μ M), une nucléation spontanée donne naissance à des MT indépendants du centrosome. À la concentration critique, la vitesse d'assemblage nette s'annule. À des concentrations inférieures, elle devient négative : la dilution favorise le désassemblage des MT. Des tracés semblables peuvent être obtenus pour les extrémités (+) et ( ) ( fig. 6.2A droite). La concentration critique du bout (+) est plus faible que celle du bout ( ). Dans une cellule, la tubuline est à une concentration de 5 à 10 μ M soit entre les concentrations critiques des bouts (+) et ( ). Ceci implique que l'extrémité ( ) de tout MT non lié au centrosome dépolymérise, alors que son extrémité (+) peut croître. C. Modalités de la dynamique microtubulaire 1. Instabilité dynamique Le comportement des MT caractéristique de leur bout (+) est l'instabilité dynamique ( fig. 6.2B haut). Elle consiste en une alternance de phases de polymérisation et de dépolymérisation qui opèrent indépendamment pour chaque MT. L'historique de longueur d'un MT au cours du temps permet de visualiser ces phases, de situer les transitions (catastrophes vers le désassemblage et sauvetages vers la croissance). Dans la cellule, un MT nouvellement nucléé croît sans accident jusqu'à la périphérie cellulaire où il peut entrer en instabilité dynamique pendant quelques centaines de secondes et finit par se désassembler complètement. Ceci permet aux MT d'explorer le cytoplasme en le parcourant depuis leur site de nucléation jusqu'à la périphérie cellulaire sous la MP. 83

6 Structure générale de la cellule Fig. 6.2 Propriétés des extrémités et modalités de la dynamique microtubulaire. A. Rôle de la concentration en tubuline sur l'assemblage des microtubules et notion de concentration critique. B. Modalités de la dynamique microtubulaire. 84 0001559082.INDD 84 8/24/2012 12:13:09 PM

Cytosquelette 6 Remarque Cette exploration s'effectue sans déplacement de tubuline vers la périphérie ou vers le centre de la cellule (voir ci-dessous). 2. Treadmilling La génération d'une nouvelle extrémité ( ) libre (par détachement du centrosome ou par coupure interne d'un MT) conduit au comportement de treadmilling qui propage un MT vers la périphérie cellulaire ( fig. 6.2B bas). De nouvelles sous-unités de tubuline incorporées au bout (+) à un instant t0 vont se trouver dans le corps du MT à t1 et libérées par dépolymérisation du bout ( ) à t3. Parallèlement, le MT progresse vers la périphérie cellulaire sans déplacement net des sous-unités de tubuline dans le cytoplasme. Elles sont juste passées transitoirement par un état polymère. Le terme treadmilling s'applique aux MT mais caractérise aussi le comportement de certaines protéines régulatrices de la dynamique associées au bout (+) des MT en croissance. D. Protéines se liant aux microtubules La dynamique des MT résulte des propriétés intrinsèques de la tubuline. Dans la cellule cependant, ce comportement est amplifié et régulé par de nombreuses protéines associées aux MT. Parmi ces microtubuleassociated proteins (MAPs), on distingue des MAPs structurales qui copolymérisent avec la tubuline, des protéines qui se lient transitoirement au bout (+), les plus-end tracking proteins (+TIPs) et des moteurs moléculaires capables de se déplacer le long des MT. 1. MAPs et +TIPs Les MAPs structurales liées à la surface du MT stabilisent le polymère. Ces protéines comme MAP1, MAP2, MAP4 ou tau présentent un domaine d'interaction avec la tubuline et un domaine qui se projette perpendiculairement à la surface des MT et qui prévient leur rapprochement trop important. La cellule module la liaison des MAPs à la surface des MT par phosphorylation (inhibitrice) et déphosphorylation ( fig. 6.3A ). Si la phosphorylation est excessive comme avec tau dans la maladie d'alzheimer, une déstabilisation délétère des MT peut se produire. Les +TIPs sont des protéines qui font pour la plupart du treadmilling à l'extrémité des MT et régulent leur comportement dynamique. Certaines opèrent pendant la croissance, d'autres pendant la dépolymérisation. Certaines +TIPs sont des régulateurs de la dynamique qui peuvent stimuler la croissance (EB1 ), d'autres peuvent aider à stabiliser les MT ou à capturer leur extrémité en croissance en périphérie cellulaire ; certaines favorisent les catastrophes et stimulent la dépolymérisation tandis que d'autres sont des facteurs de sauvetage (CLIP-170 ). 2. Moteurs moléculaires Les moteurs moléculaires transforment l'énergie issue de l'hydrolyse de l'atp en mouvement pour assurer un déplacement orienté vers le bout ( ) ou le bout (+) des MT (voir fig. 6.3A ). Les moteurs transportent 85

6 Structure générale de la cellule Fig. 6.3 MAPs et moteurs moléculaires impliqués dans les fonctions du réseau de MT interphasique et dans l organisation du fuseau mitotique. A. MAPs et moteurs moléculaires. B. Organisation du fuseau mitotique et des microtubules astraux, dynamique microtubulaire en mitose. 86 0001559082.INDD 86 8/24/2012 12:13:13 PM

Cytosquelette 6 diverses cargaisons comme des vésicules membranaires, des organites entiers, des MT préassemblés ou des complexes protéiques ou d'arnm. Les moteurs qui se déplacent vers l'extrémité ( ) appartiennent à la famille des dynéines. Ceux qui se déplacent vers le bout (+) sont des kinésines. Tels des nano-bipèdes, ces moteurs alternent des déplacements de pas constants de 8 nm (kinésines) ou variables de 8 à 32 nm (dynéines) de leurs têtes motrices à la surface des MT. La capacité de marcher sur un MT sans se décrocher après un ou deux pas est appelée processivité du moteur. Il existe deux grands types de dynéines : la forme cytoplasmique possède deux têtes motrices, tandis que la forme ciliaire ou flagellaire en possède trois. Les têtes motrices sont situées à l'extrémité des chaînes lourdes. Celles-ci s'assemblent avec des chaînes intermédiaires, des chaînes légères et un complexe de dynactine qui constitue un appui supplémentaire sur le MT et accroît la processivité. Les kinésines constituent un vaste ensemble moléculaire : il en existe plus d'une quarantaine chez l'homme. Certaines assurent du transport moléculaire ou vésiculaire, d'autres sont impliquées dans le transport de MT, l'assemblage du fuseau mitotique, la liaison des chromosomes aux MT ou encore la dépolymérisation des MT. E. Dynamique microtubulaire in vivo 1. Pendant l'interphase Les MT présentent une dynamique fondée sur les propriétés intrinsèques de la tubuline. Dans la cellule en interphase, cette dynamique est fortement amplifiée par intervention simultanée de facteurs stabilisant les MT et/ou stimulant leur croissance (MAPs et certaines + TIPs comme EB1 ou CLIP-170) et de facteurs déstabilisants qui stimulent la dépolymérisation comme la mitotic centromere associated kinesin (MCAK). 2. Pendant la mitose La cellule met en place le fuseau mitotique, une structure bipolaire de MT maintenus entre les centrosomes dupliqués. Chaque centrosome nuclée aussi un aster de MT polaires qui permet le positionnement du fuseau. Les chromosomes dupliqués peuvent nucléer des MT au voisinage du centromère par un complexe protéique appelé kinétochore qui comprend des moteurs de type dynéine et des kinésines spécialisées (CENP-E) accrochant ces MT latéralement au voisinage du bout (+). Du côté ( ), les MT du fuseau forment un faisceau très dense à proximité des pôles. Ils sont liés latéralement par des dynéines réunies par la protéine NuMA (nuclear matrix antigen). Dans la partie centrale du fuseau, les MT sont antiparallèles. Ils sont aussi liés latéralement par des kinésines spécialisés (kinésines-5) qui présentent quatre têtes motrices (deux sur un MT et deux autres sur un MT antiparallèle) et qui maintiennent l'écartement des pôles du fuseau. En mitose, la dynamique des MT s'accélère de 4 à 10 fois par rapport à l'interphase avec plus de catastrophes et moins de sauvetages. Avec les moteurs kinétochoriens qui peuvent tirer et pousser les chromosomes, cette dynamique favorise leur positionnement sur la région équatoriale du fuseau. 87

6 Structure générale de la cellule Des kinésines non kinétochoriennes appelées chromokinésines redressent aussi les chromosomes pour les aligner sur l'équateur grâce à d'autres MT polaires. L'alignement équatorial des chromosomes est essentiel pour franchir le point de contrôle mitotique, enclencher l'anaphase et achever la division cellulaire. Un treadmilling accéléré des MT du fuseau (le flux polaire de tubuline ) maintient l'alignement pendant le contrôle. Ici cependant les MT sont immobiles car ils sont maintenus latéralement au voisinage des pôles ( fig. 6.3B ). Une fois le point de contrôle franchi, les chromatides dupliquées se séparent tout en restant attachées aux MT kinétochoriens par la kinésine CENP-E. Leur migration vers les pôles résulte essentiellement de la dépolymérisation rapide du bout (+) des MT kinétochoriens. F. Agents antimitotiques La dynamique des MT est une cible majeure en thérapeutique antitumorale. Les molécules utilisées sont des poisons de la tubuline dont les prototypes sont le Taxol (stabilisateur de MT) et la colchicine ou les alcaloïdes de la pervenche (vinblastine, vincristine ) qui déstabilisent les MT en empêchant l'incorporation de la tubuline soluble dans les MT sans affecter leur dépolymérisation. Ces effets sont observés à des concentrations proches de celles de la tubuline cellulaire (micromolaires), mais aux concentrations thérapeutiques (submicromolaires), toutes ces molécules stabilisent les MT en bloquant instabilité dynamique et treadmilling. La cellule est donc incapable d'aligner convenablement et de maintenir les chromosomes sur la plaque équatoriale en métaphase, ne peut franchir le point de contrôle mitotique et déclenche alors un programme de mort apoptotique. G. Cils et flagelles Ce sont des structures généralement motiles, qui sous-tendent des extensions de la MP et qui sont liées à des centrioles sous-membranaires appelés corpuscules basaux. La partie qui émerge de la cellule est appelée axonème. Celui-ci est organisé autour d'une paire de MT centraux (dans les cils motiles et les flagelles mais qui est absente des cils primaires). Ces MT sont liés latéralement par des ponts protéiques et entourés d'un manchon. Le doublet central est relié à neuf doublets de MT périphériques dont l'organisation rappelle celle des centrioles : un tubule cylindrique (tubule A) et un tubule accolé ouvert (tubule B). Ces doublets de MT sont liés au manchon central par des fibres protéiques radiales et possèdent à leur surface des dynéines ciliaires qui les font glisser les uns sur les autres. L'attachement de ces doublets entre eux à la base de l'axonème empêche tout glissement des doublets vers l'intérieur de la cellule. Les forces de glissement engendrées dans l'axonème imposent alors une courbure aux cils ou aux flagelles, permettant ainsi leur battement. III. Microfilaments De nombreuses notions qui s'appliquent au comportement des microfilaments (MF) comme le treadmilling ou la notion de concentration critique ont déjà été décrites dans la partie sur les MT. Elles ne sont pas reprises dans cette partie. 88

Cytosquelette 6 A. Actine et son cycle d'assemblage L'actine est une ATPase qui s'assemble pour former les MF. L'actine soluble qui est dite globulaire (ou actine G) lie l'adp. L'actine polymérisée (filamentaire ou actine F) le fait sous forme liée à l'atp. À l'image de ce qui a déjà été décrit avec les MT, l'incorporation de nouvelles sousunités d'actine ATP à un MF stimule l'activité ATPase de l'actine déjà incorporée. L'assemblage de l'actine conduit à la formation de polymères à deux protofilaments qui s'enroulent l'un autour de l'autre pour former une structure de 6 nm de diamètre. L'extrémité ( ) d'un MF est dite pointue. Si elle est libre, elle libère de l'actine-adp. L'extrémité (+) est l'extrémité barbue. Si elle n'est pas bloquée par des protéines de coiffe, elle recrute les monomères d'actine-atp ( fig. 6.4A ). B. Protéines associées à l'actine, organisation des microfilaments Diverses protéines interagissent avec l'actine pour contrôler son assemblage ou pour organiser les MF. Deux protéines principales sont impliquées dans le contrôle d'assemblage. La β -tymosine se lie à l'actine et la bloque sous forme ADP empêchant échange nucléotidique et nucléation spontanée. L'échange ADP/ATP nécessite la profiline qui se lie temporairement au complexe actine - β - thymosine. En présence d'une extrémité (+) libre, l'interaction avec les protéines partenaires est rompue et l'actine ATP s'incorpore dans le nouveau filament. Les MF peuvent être organisés en une grande variété de superstructures en fonction de la nature des protéines associées. Cette diversité permet à la cellule de contrôler sa morphologie à une échelle globale ou locale. Les MF peuvent être organisés en gel anisotrope réticulé par des protéines de pontage comme l' α - actinine ou les filamines. Les MF peuvent présenter une organisation parallèle ou arborescente maintenue par des protéines comme la villine, la fimbrine, la fascine ou la protéine ARP2/3 (ARP = actin-related protein ). La plasticité des MF et leur organisation en superstructures différentes permettent à la cellule de créer : des câbles (appellés fibres de tension ) constitués de nombreux MF associés qui s'ancrent au niveau des points d'adhérence focale, qui sont les régions spécialisées de la MP où la cellule établit des liens avec la matrice extracellulaire ; des replis dynamiques formant des vagues à la surface de la MP ; des protrusions cellulaires impliquées dans la migration et orientées vers le front de migration, les lamellipodes ; des extensions membranaires très fines, les filopodes ; des structures plus spécialisées comme les microvillosités membranaires. C. Clivage, coiffage et transformations gel sol L'élongation des MF peut être limitée par blocage du bout (+) par des protéines de coiffe comme CapG, CapZ ou la gelsoline. 89

6 Structure générale de la cellule Fig. 6.4 Dynamique et organisation des microflaments. A. Cycle d'assemblage-désassemblage des microfilaments. B. Transition gel-sol. C. Régulation de l'assemblage des microfilaments. 90 0001559082.INDD 90 8/24/2012 12:13:19 PM

Cytosquelette 6 La fonction de ces protéines est contrôlée par le calcium ou par des inositol-phosphates. Contrairement à CapG et CapZ, la gelsoline peut aussi cliver des MF. Le clivage est combiné au coiffage, ainsi la gelsoline reste fixée à la nouvelle extrémité (+) générée par le clivage ( fig. 6.4B ). Ce mécanisme de clivage coiffage permet à la gelsoline d'accroître la fluidité d'un gel de MF pontés (voir plus haut). Le cytoplasme peut ainsi passer d'un état «gel» à un état «sol» pour soluble important pour l'émission de protrusions membranaires. D. Nucléation dendritique et migration cellulaire L'organisation des MF dans les lamellipodes au cours de la migration cellulaire repose sur un modèle arborescent appelé nucléation dendritique. Après activation par un stimulus extracellulaire, la protéine ARP2/3 se fixe sur des MF existants et nuclée des MF orientés à 70 par rapport aux précédents. Cet assemblage constitue un réseau avec de nombreuses extrémités (+) orientées vers la MP où les MF peuvent exercer une action mécanique. Le réseau dendritique de MF est dynamique : il s'allonge vers la périphérie pour pousser la MP puis les MF sont coiffés ce qui limite leur élongation. Parallèlement, le clivage des MF dans leurs parties les plus anciennes par la protéine ADF/Cofiline accélère la dépolymérisation du réseau à l'arrière. Cette dynamique du réseau dendritique en direction du front de migration exerce une poussée mécanique sur la MP et permet la progression du lamellipode ( fig. 6.5A ). E. Régulation par les protéines G L'organisation des MF d'actine dans la cellule dépend de la nature des protéines associées, mais elle est aussi contrôlée par trois protéines G régulatrices : Rho, Rac et Cdc42. L'activation de ces protéines G sous forme GTP stimule pour Rho la formation des fibres de tension, pour Rac la formation des lamellipodes et pour Cdc42 la formation des filopodes ( fig. 6.4C ). F. Liaison microfilaments membrane plasmique : l'exemple des microvillosités Le maintien d'une morphologie cellulaire différenciée implique souvent l'interaction des MF avec la MP comme avec les jonctions adhérentes ou les microvillosités. Ces dernières qui accroissent la surface d'échange avec le milieu extracellulaire sont sous-tendues par des MF accrochés à la MP et liés latéralement entre eux. La liaison à la MP nécessite des protéines ERM (Ezrine Radixine Moesine). Ces protéines présentent une conformation inactive repliée, mais elles s'ouvrent après phosphorylation pour lier des MF au domaine cytoplasmique de protéines membranaires. Cette liaison combinée avec le pontage latéral de MF voisins par la villine et la fimbrine permet la création de microvillosités ( fig. 6.5B ). 91

6 Structure générale de la cellule Fig. 6.5 Organisation des MF sous la membrane plasmique. A. Polymérisation dendritique de l'actine. B. Protéines ERM et formation des microvillosités. G. Myosine II musculaire La famille des myosines comprend de nombreux moteurs se déplaçant vers le bout (+) des MF d'actine. La myosine musculaire (myosine II) est organisée sous forme de polymères (les filaments épais) desquels émergent les paires de têtes motrices qui marchent sur les filaments fins d'actine pour assurer la contraction. La myosine peut se trouver dans quatre états nucléotidiques : sans nucléotide, liée à l'atp, à l'adp-pi ou à l'adp. La myosine-atp est peu affine pour l'actine (n) d'un MF. L'hydrolyse de l'atp ouvre alors la conformation d'une tête motrice 92 0001559082.INDD 92 8/24/2012 12:13:23 PM

Cytosquelette 6 pour l'aligner avec l'actine voisine (n + 1). La libération du Pi accroît l'affinité myosine actine et la libération d'adp permet le retour à la conformation initiale, ce qui permet la traction du MF. La liaison d'une nouvelle molécule d'atp permet de répéter ce cycle. IV. Filaments intermédiaires A. Organisation moléculaire Contrairement aux MT et aux MF, les FI sont formés de protéines différentes selon le type cellulaire. L'organisation des FI repose cependant toujours sur le même principe : une(des) protéine(s) s'assemble(nt) en dimères avec des régions terminales globulaires et une région centrale hélicoïdale. Deux dimères s'assemblent tête-bêche en un tétramère avec un décalage longitudinal. La polymérisation linéaire de ces tétramères forme des fibres qui se groupent par huit pour constituer un FI de 10 nm de diamètre. L'arrangement des fibres en torons (comme dans un câble) donne aux FI une grande résistance mécanique. B. Classification des filaments intermédiaires et différenciation cellulaire Les plus importants types de protéines de FI sont les suivantes : les cytokératines de type I (acide) et II (basique) exprimées dans les cellules épithéliales s'assemblent pour former des hétéropolymères. La diversité de ces kératines (une dizaine de chaque type) permet l'assemblage de couples différents selon le type cellulaire ; les protéines de type III qui forment des homopolymères sont exprimées dans des cellules mésenchymateuses : les fibroblastes et les cellules dédifférenciées comme des cellules tumorales expriment la vimentine, les cellules musculaires expriment la desmine ; le type IV contient les protéines de FI (NF-H, NF-L et NF-M) qui copolymérisent dans les neurones pour former les neurofilaments ; le type V est particulier car il contient les trois lamines nucléaires qui sont ubiquitaires. Elles s'assemblent pour constituer la trame de soutien de l'enveloppe nucléaire. C. Dynamique des filaments intermédiaires Les FI n'échangent pas de sous-unités aux extrémités des polymères. Leur dynamique comprise très tardivement opère par échange latéral de sous-unités, coupures et raboutage de FI. L'échange des sous-unités est contrôlé par phosphorylation déphosphorylation. D. Fonctions mécaniques Grâce à leur solidité, les FI assurent un rôle mécanique majeur : dans les épithélia, ils constituent un réseau de câbles parallèles ancrés à des jonctions membranaires établies entre cellules adjacentes (les desmosomes ) ainsi qu'entre les cellules et la matrice extracellulaire (hémidesmosomes ). Ils assurent ainsi la cohésion du tissu et sa résistance 93

6 Structure générale de la cellule mécanique au déchirement. Dans les neurones, les FI présentent des projections latérales des protéines NF-L et NF-M. Cette organisation empêche les FI de s'approcher trop près les uns des autres et participe au contrôle du diamètre axonal, lui-même essentiel pour assurer une vitesse de conduction nerveuse suffisante. 94