BIOLOGIE Durée : 4 heures

Concours B ENSA B-0108B BIOLOGIE Durée : 4 heures L usage de la calculatrice, d abaques et de tables est interdit pour cette épreuve. Si, au cours de l épreuve, un candidat repère ce qui lui semble être une erreur d énoncé, il le signale sur sa copie et poursuit sa composition en expliquant les raisons des initiatives qu il a été amené à prendre. L épreuve comprend deux parties indépendantes comptant chacune pour la moitié de la note. Première partie : question de synthèse Les enzymes : des biocatalyseurs N.B. Il est rappelé aux candidats que la notation prendra en compte non seulement la clarté, la précision et la concision de l exposé, mais également la qualité de l expression, de l illustration et de la présentation. 1/8

Deuxième partie : étude de documents L acétylcholine estérase (AChE) met fin à la transmission synaptique au niveau des synapses cholinergiques dans le système nerveux par hydrolyse rapide du neurotransmetteur acétylcholine. La réaction catalysée par l enzyme est la suivante : acétylcholine + eau acide acétique + choline En raison de son rôle physiologique, l AChE constitue une cible privilégiée pour de nombreux insecticides, dont les carbamates, une classe de pesticides utilisés en agriculture et en santé publique. Or une résistance à ces composés a été décrite pour de nombreuses espèces, en particulier pour Culex pipiens, vecteur de la fièvre du Nil. L étude qui suit consiste à caractériser l activité AChE du moustique Culex pipiens, ainsi que le mécanisme à l origine de la résistance décrite, dans le but de mettre au point un test diagnostic de cette résistance. 1 - Un extrait cellulaire, préparé à partir de la souche de référence S-LAB de Culex pipiens, est ultracentrifugé en gradient de saccharose dans un tampon en présence (ronds noirs) ou en absence (ronds blancs) d un détergent, le Triton X-100. L activité AChE des différentes fractions est présentée Figure 1. Figure 1 GAL PAL Activité AChE (unités arbitraires) 1,0 0,5 0 0 10 20 30 40 Fractions Les flèches verticales indiquent les positions de la phosphatase alcaline bovine (PAL) et de la -galactosidase d Escherichia coli (GAL), qui sont utilisées comme étalons internes et ont pour coefficients de sédimentation respectivement 6,1S et 16S. Expliquer, en une dizaine de lignes au maximum, le principe de l ultracentrifugation en gradient de saccharose. Quel est le rôle du détergent? Que vous suggère la comparaison des profils d activité AChE obtenus en présence et en absence de détergent? 2/8

2 - Afin de caractériser l activité AChE de la souche S-LAB, les fractions 24 & 25 du pic obtenu en présence de détergent (cf. Figure 1) sont collectées, puis sont traitées (+) ou non (-) par la phospholipase C spécifique du phosphatidylinositol (PIPLC) avant d être analysées par électrophorèse en conditions non dénaturantes. La PIPLC est une enzyme qui libère spécifiquement les protéines liées à un phospholipide membranaire, le glycosyl-phosphatidylinositol (GPI). Après migration, l activité AChE est déterminée par la méthode de Ellman : le gel est découpé en deux parties, l une est colorée en utilisant l acétylthiocholine (AcSCH), à une concentration égale à 10-3 M, comme analogue de substrat et l autre en utilisant AcSCH en présence de propoxur (un carbamate) à une concentration égale à 5x10-4 M (Figure 2). L apparition de la coloration révèle la présence d une activité AChE. Figure 2 AcSCH 10-3 M AcSCH 10-3 M Propoxur 5.10-4 M - PIPLC + PIPLC - PIPLC + PIPLC 1 2 3 4 Les têtes de flèche indiquent l origine de migration, la flèche verticale indique le sens de migration La quantité de protéines déposées dans chaque piste est identique Expliquer, en une dizaine de lignes au maximum, le principe de la séparation de protéines par électrophorèse non dénaturante en gel de polyacrylamide. Que permet de mettre en évidence l utilisation de PIPLC? Quel est l effet du propoxur? Conclure quant à la nature des bandes 1, 2, 3 & 4? 3 - L activité AChE des mêmes fractions est ensuite étudiée avec des doses croissantes de propoxur (Figure 3). Figure 3 Activité AChE résiduelle (%) 100 80 60 40 20 0 10-10 10-8 10-6 10-4 10-2 Propoxur (M) Que permet de confirmer ce résultat? Justifiez votre réponse. 3/8

4 - Les effets de différentes concentrations en propoxur sur la mortalité des moustiques sont étudiés pour la souche de référence S-LAB, étudiée jusque là, et pour une autre souche nommée MSE (Figure 4A). L activité AChE de ces deux souches est ensuite étudiée in vitro en gel non dénaturant selon le protocole présenté à la question 2 (Figure 4B). Figure 4A 98 95 90 80 Mortalité (%) 70 60 50 40 30 S-LAB MSE 20 10 5 2 5.10-8 5.10-7 5.10-6 5.10-5 5.10-4 5.10-3 Propoxur (M) Figure 4B S-LAB MSE S-LAB MSE Sans Propoxur Propoxur 5.10-4 M Les têtes de flèche indiquent l origine de migration, la flèche verticale indique le sens de migration La quantité de protéines déposées dans chaque piste est identique Etablir une corrélation entre la viabilité des souches et les différentes activités AChE présentes dans chaque souche. Emettre une hypothèse permettant d expliquer les différences de viabilité observées. 5 Le séquençage des génomes de nombreuses espèces animales a permis de rechercher les gènes ace codant pour des AChE. Deux tels gènes, ace-1 & ace-2, ont ainsi été mis en évidence chez Culex pipiens. Le Tableau 5A présente le polymorphisme nucléotidique de l exon 3 du gène ace-1 de différents moustiques Culex pipiens. Dans cette figure les échantillons sont classés selon la sousespèce (C. p. pipiens ou C. p. quinquefasciatus), la présence d AChE résistante (Ri) ou non (Si) au propoxur et le pays d origine. Seuls les sites de polymorphisme sont indiqués et un tiret indique la similitude avec la première séquence du tableau, c est-à-dire avec la séquence «Burkina Faso». La séquence nucléotidique complète de l exon 3 de l échantillon S1, ainsi que la séquence protéique correspondante, sont données dans le Tableau 5B. En vous appuyant sur les données des tableaux 5A & 5B, ainsi que sur les annexes, émettre une hypothèse permettant d expliquer l origine de la résistance au propoxur du produit du gène ace-1 dans les souches de moustiques R? Justifiez votre réponse. 4/8

Tableau 5A 4 4 4 4 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 6 6 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 8 8 5 5 7 9 1 2 6 7 9 0 5 6 8 8 9 9 1 3 3 4 4 5 6 7 7 8 9 1 4 0 3 1 8 3 8 4 3 7 3 1 0 1 4 1 6 4 2 9 1 7 6 3 4 7 0 0 3 6 C. pipiens quinquefasciatus Pays Nom Burkina Faso R1 T C A T C G G G G C G G G C C C C C A C C T C C C C G A T Zimbabwe R2 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Côte d Ivoire R3 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Mali R4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Martinique R5 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Brésil R6 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - USA S1 - T - C - - - - - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - G USA S2 - T - C - - - - - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - G USA S3 - T - - - - - A - - - - - - - - - - G - - - - - - - A - - USA S4 - T - - - - - A - - - - - - - - - - G - - - - - - - A - - Chine S5 - T C C - - - - - - - - - - - - - - G - - - - T - - - - - Chine S6 - T C - - - - - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - - Thaïlande S7 - T C C - - - - - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - G Inde S8 - T - C - - A - - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - G Afrique du sud S9 - T C C - - - - - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - G Afrique du sud S10 - T - - - - - A - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - - Côte d Ivoire S11 - T C - - - - - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - - Congo S12 - T C C - - - - - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - G Brésil S13 - T C - - - - - - - - - - - - - - G - T - - - - - - - G Polynésie française S14 - T - - - - - - - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - G C. pipiens pipiens Tunisie R7 A T - C - - - A - - C - - - A G T T - - - - T - T T - G - Portugal R8 A T - C - - - A - - C - - - A G T T - - - - T - T T - G - Italie R9 A T - C - - - A - - C - - - A G T T - - - - T - T T - G - France R10 A T - C - - - A - - C - - - A G T T - - - - T - T T - G - Belgique S15 A T - C - - - A - - C - - - A G T T G - - - T - T T - G - Belgique S16 A T - C - - - A - - C - - - A G T T G - - - T - T T - G - Australie S17 A T - C - - - A - A C - - - A G T T G - - - T - T T - G - France S18 A T - C - - - A - - C - - - A G T T G - - - T - T T - G - Légende : 4 indique la position du 450 ème nucléotide du gène ace-1 5 0 Tableau 5B 451 agtggaaaga aggtggacgc atggatgggc attccgtacg cgcagccccc gctgggtccg 23 S G K K V D A W M G I P Y A Q P P L G P 511 ctccggtttc gacatccgcg accggccgaa agatggaccg gtgtgctgaa cgcgaccaaa 43 L R F R H P R P A E R W T G V L N A T K 571 ccgcccaact cctgcgtcca gatcgtggac accgtgttcg gtgacttccc gggggccacc 63 P P N S C V Q I V D T V F G D F P G A T 631 atgtggaacc cgaacacacc gctctcggag gactgtctgt acatcaacgt ggtcgtgcca 83 M W N P N T P L S E D C L Y I N V V V P 691 cggcccaggc ccaagaatgc cgccgtcatg ctgtggatct tcgggggtgg cttctactcc 103 R P R P K N A A V M L W I F G G G F Y S 751 gggactgcca cgctggacgt gtacgaccac cggacgctgg cctcggagga gaacgtgatc 123 G T A T L D V Y D H R T L A S E E N V I 811 gtagtttcgc tgcagtaccg tgtcgcaagt cttggg 143 V V S L Q Y R V A S L G Légende : agt indique que le codon agt code pour un résidu Ser S 5/8

6 - L ADNc du gène ace-1 de la souche S1 a été cloné dans un vecteur d expression eucaryote pour donner la construction pace1-s. La mutation précédemment identifiée dans les souches R a ensuite été introduite par mutagenèse dirigée dans l ADNc pour donner le vecteur pace1-r. Des cellules S2 de mouche du vinaigre, Drosophila melanogaster, n exprimant pas d AChE de manière constitutive sont utilisées pour produire les différentes protéines recombinantes. La Figure 6 illustre la quantification de l activité AChE-1 en présence de concentrations croissantes de propoxur de lysats de cellules S2 transfectées avec le vecteur vide (rond noir), de cellules S2 transfectées avec pace-1-r (carré noir) et de cellules S2 transfectées avec pace-1-s (losange blanc). Parallèlement, l activité AChE-1 de lysats de cellules de moustiques Culex pipiens résistants (losange noir) et sensibles (carré blanc) au propoxur est testée dans les mêmes conditions. Figure 6 Activité acétylcholine estérase (%) 140 120 100 80 60 40 20 0 0 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 Propoxur (M) Rappeler ce qu est un vecteur d expression. Que démontre cette expérience? 7 - Un test permettant la mise en évidence de la mutation du gène ace-1 responsable de la résistance au propoxur a été développé. Ce test de polymorphisme de longueur de fragments de restriction (RFLP) repose sur la comparaison des profils de coupure, par des enzymes de restriction, de l exon 3 du gène ace-1 préalablement amplifié par PCR. Grâce aux résultats obtenus au cours de l ensemble de l étude précédente, expliquer les grandes étapes de la réalisation pratique de ce test en justifiant comment un tel test permet concrètement de distinguer les moustiques sensibles et résistants. Quel intérêt pratique présente un tel test? 8 - La résolution de la structure cristallographique de l AChE de raie électrique, Torpedo californica, a permis d identifier au sein du site actif les trois acides aminés essentiels à la catalyse : Ser 200, Glu 327 et His 440 (Figure 8A). Figure 8A 6/8

Sur la base de cette structure et des homologies entre les séquences protéiques de l AChE de Torpedo californica et de l AChE-1 de Culex pipiens il a été possible de construire un modèle tridimensionnel de cette dernière (Figure 8B). Des agrandissements des sites catalytiques d une forme enzymatique sensible au propoxur et d une forme résistante sont présentés respectivement Figures 8C et 8D. L acide aminé muté, identifié précédemment, ainsi que les acides aminés Ser 200, His 440 et Glu 327, responsables de l activité catalytique, y sont représentés sous forme de sphères de van der Waals. Figures 8B,C,D B C D Quelle famille d enzymes présente la même triade catalytique au niveau de son site actif? Par analogie avec cette famille, présenter le mécanisme catalytique de l AChE. Proposer une explication à la résistance au propoxur de l enzyme mutée sur la base de ces données structurales et de vos connaissances du mécanisme catalytique de l AChE. 7/8

Annexes Annexe 1 - Tableau du code génétique Première lettre Deuxième lettre (extrémité 5 ) U C A G Troisième lettre (extrémité 3 ) U C A G Phe Ser Tyr Cys U Phe Ser Tyr Cys C Leu Ser Stop Stop A Leu Ser Stop Trp G Leu Pro His Arg U Leu Pro His Arg C Leu Pro Gln Arg A Leu Pro Gln Arg G Ile Thr Asn Ser U Ile Thr Asn Ser C Ile Thr Lys Arg A Met Thr Lys Arg G Val Ala Asp Gly U Val Ala Asp Gly C Val Ala Glu Gly A Val Ala Glu Gly G Annexe 2 - Code à une lettre des acides aminés A : alanine G : glycine M : méthionine S : sérine C : cystéine H : histidine N : asparagine T : thréonine D : acide aspartique I : isoleucine P : proline V : valine E : acide glutamique K : lysine Q : glutamine W : tryptophane F : phénylalanine L : leucine R : arginine Y : tyrosine 8/8