Contrôle de l'expression génétique : Les régulations post-transcriptionnelles

Transcription

1 Contrôle de l'expression génétique : Les régulations post-transcriptionnelles utilisateur : biochimie mot de passe : 2007

2 L'ARNm, simple intermédiaire entre le génome et les protéines? «How is gene expression controlled in eukaryotes? As in prokaryotes, control is exerted primarily at the level of transcription» Lubert Stryer, Biochemistry III, 1988 ARNm ARNm

3 Les ARN sont intégrés dans le contrôle de l'expression génétique stabilité "Monde" de l'arn traductibilité épissage transport localisation

4 Vue "classique" de l'expression génétique

5 Vue "contemporaine" de l'expression génétique

6 Les protéines de liaison aux ARN contrôlent le devenir d'un pré-arnm et d'un ARNm Les protéines de liaison aux ARN se lient à des séquences régulatrices présentes sur le pré-arnm ou l'arnm et servent d'adaptateurs aux différentes machineries cellulaires. Formation de complexes mrnp hautement dynamiques

7 Les protéines de liaison aux ARN contrôlent le devenir d'un pré-arnm et d'un ARNm

8 Les protéines de liaison aux ARN - Les protéines à domaines RRM (RNA Recognition Motif) ou RBD (RNA Binding Domain) Caractéristiques : 80 à 90 acides aminés avec deux motifs très conservés appelés RNP1 (R/K-G-F/Y-G/A-F/Y-V-X- F/Y) et RNP2 (L/I- F/Y-V/L-G/K-G/N-L) 1 à 5 domaines par protéine Structure : ARN cibles : 1 feuillet β formé de 4 chaînes antiparallèles (β4 β1 β3 β2) + 2 hélices α Topologie : βαββαβ ARN simples brins, tiges boucles, boucles internes

9 Les protéines de liaison aux ARN - Les protéines à domaines RRM (RNA Recognition Motif) ou RBD (RNA Binding Domain) Caractéristiques : 80 à 90 acides aminés avec deux motifs très conservés appelés RNP1 (R/K-G-F/Y-G/A-F/Y-V-X- F/Y) et RNP2 (L/I- F/Y-V/L-G/K-G/N-L) 1 à 5 domaines par protéine Structure : ARN cibles : 1 feuillet β formé de 4 chaînes antiparallèles (β4 β1 β3 β2) + 2 hélices α Topologie : βαββαβ ARN simples brins, tiges boucles, boucles internes

10 Les protéines de liaison aux ARN - Les protéines à domaines KH (hnrnp K homologue) Caractéristiques : 60 à 70 acides aminés avec un motif très conservé : V I G X X G X X I 1 à 10 domaines par protéine Structure : 1 feuillet β formé de 3 chaînes antiparallèles + 3 hélices α Topologie : βααββα ARN cibles : ARN simples brins

11 Les protéines de liaison aux ARN - Les protéines à domaines Ds-RBD (Double strand RNA Binding Domain) Caractéristiques : Environ 70 acides aminés Structure : 1 feuillet β formé de trois chaînes antiparallèles + 2 hélices α Topologie : αβββα ARN cibles : ARN partiellement ou complètement doubles brins

12 Maturation différentielle du pré-arnm : l'épissage alternatif

13 Maturation du pré-arnm ADN génomique transcription coiffe coiffage AUG polyadénylation pré-arnm exon intron exon épissage stop (A)n ARNm coiffe AUG stop (A)n export NOYAU CYTOPLASME coiffe AUG stop (A)n dégradation traduction proteine

14 Rappels sur la maturation du pré-arnm Le coiffage

15 Rappels sur la maturation du pré-arnm La polyadénylation Complexe de clivage AAUAAA Site de clivage CA U/GU-riche Site de Clivage nt 30 nt Clivage USE AAUAAA Site poly(a) DSE Aux DSE 5 3 AAUAAA Riche en U Hautement CA Riche en U conservée et GU U/GU-riche Dégradation Addition de la queue poly(a) AAUAAA

16 L Epissage Rappels sur la maturation du pré-arnm exon SR intron exon GU site 5 Site de branchement queue polypyrimidine AG site 3 S. Cerevisiae Vertébrés GUAUGU GUA A G U (GURAGU) UACUAAC C C C U G A C (YNCURAY) Réalisé au sein d'un complexe ribonucléoprotéique : le spliceosome Comprend : - 5 ARNsn : U1, U2, U4, U5, U6 associés à des protéines pour former les snrnp U1, U2, U5 et la disnrnp U4/U6. - Une centaine de protéines appelées facteurs d'épissages

17 Rappels sur la maturation du pré-arnm snrnp U1

18 L Epissage Rappels sur la maturation du pré-arnm exon SR intron exon GU site 5 Site de branchement queue polypyrimidine AG site 3 S. Cerevisiae Vertébrés GUAUGU GUA A G U (GURAGU) UACUAAC C C C U G A C (YNCURAY) Réalisé au sein d'un complexe ribonucléoprotéique : le spliceosome Comprend : - 5 ARNsn : U1, U2, U4, U5, U6 associés à des protéines pour former les snrnp U1, U2, U5 et la disnrnp U4/U6. - Une centaine de protéines appelées facteurs d'épissages

19 Rappels sur la maturation du pré-arnm complexe E Mise en place séquentielle du spliceosome complexe A complexe B (+ATP) (+ATP) 1ère réaction de transestérification complexe C (+ATP)

20 Rappels sur la maturation du pré-arnm complexe E Mise en place séquentielle du spliceosome complexe A complexe B (+ATP) (+ATP) 2ème réaction de transestérification complexe C (+ATP)

21 Intron définition versus exon définition SR 70K U U2AF ex 5 U1 ex 3 U2 U2AF SR 70K U SR Intron définition Exon définition - levure - vertébrés - drosophile

22 Intron définition versus exon définition Intron définition SR U2 U1 U2 U2 5' 3' 3' 3'

23 Intron définition versus exon définition Intron définition U2 U1 SR U2 5' 3' 3' U2 3'

24 Intron définition versus exon définition Intron définition SR U1 U2 3' 5' 3' 3' Exon définition SR U2 U2 U1 U2 3' 3' 5' 3'

25 Intron définition versus exon définition Intron définition SR U2 U1 U2 U2 3' 5' 3' 3' Exon définition U2 U2 SR 3' 3' 5' 3' U1 U2

26 Intron définition versus exon définition Intron définition SR U1 U2 3' 5' 3' 3' Exon définition SR U2 U2 U1 3' 3' 5' 3'

27 Exon définition des exons terminaux

28 Les différents évènements d épissage alternatifs exon cassette exons mutuellement exclusifs site 5' alternatif site 3' alternatif intron alternatif

29 Les différents évènements de polyadénylation alternative pa1 pa2 AUG stop 1 2 Signaux de polyadénylation en tandem pa1 AUG stop stop pa Exons 3' terminaux alternatifs pa1 AUG stop stop pa ' 3 Exon composite interne/terminal site 5'

30 Plusieurs groupes d'exons alternatifs peuvent être présents dans un préarnm 12 X 48 X 33 X 2 = combinaisons théoriques!

31 Prévalence de l épissage alternatif par analyse de séquences EST Séquence EST : Expressed Sequence Tag : Séquence partielle d'un ADNc issue d'un séquençage massif et systématique des clones contenus dans une banque ADNc 5' 3' Les séquences EST sont représentatives de l'expression d'un gène dans un tissu donné.

32 Prévalence de l épissage alternatif par analyse de séquences EST EST muscle squelettique EST cerveau 1 ) comparaison des séquences EST entre elles

33 Prévalence de l épissage alternatif par analyse de séquences EST 2 ) comparaison des séquences EST avec le génome Muscle squelettique Cerveau

34 Fonctions biologiques de l épissage alternatif Synthèse de protéines différentes Ex : le pré-arnm CT/CGRP inhibiteur de la résorption osseuse neurotransmetteur + vasodilatateur

35 Fonctions biologiques de l épissage alternatif Synthèse de nombreuses isoformes Les exons correspondent souvent à des domaines fonctionnels

36 Fonctions biologiques de l épissage alternatif Synthèse de nombreuses isoformes Changement de localisation Ex : le pré-arnm des immunoglobulines

37 Fonctions biologiques de l épissage alternatif Synthèse de nombreuses isoformes Modification de l activité enzymatique, de la capacité de liaison Ex : le pré-arnm FGFR2 IIIb IIIc IIIb IIIc Isoforme liant le FGF Isoforme liant le FGF et le KGF

38 Fonctions biologiques de l épissage alternatif Synthèse de nombreuses isoformes Modification de la capacité d interaction protéines/protéines Ex1 : le pré-arnm du facteur de transcription kruppel

39 Fonctions biologiques de l épissage alternatif Synthèse de nombreuses isoformes Modification de la capacité d interaction protéines/protéines Ex2 : le pré-arnm du facteur de transcription Pbx2

40 Fonctions biologiques de l épissage alternatif Régulation de l expression d un gène via le NMD Le NMD (Nonsense Mediated Decay) : mécanisme de surveillance de l ARNm qui reconnaît et dégrade rapidement les ARNm contenant un codon stop prématuré. Règle du NMD chez les vertébrés

41 Fonctions biologiques de l épissage alternatif Régulation de l expression d un gène via le NMD Les jonctions exons/exons sont marquées par le dépôt d un complexe protéique : EJC (Exon Junction Complex) ADN génomique transcription pré-arnm cap AUG exon intron exon stop (A)n épissage ARNm cap AUG EJC stop (A)n L EJC comporte plusieurs protéines Il s assemble : - durant l épissage NOYAU CYTOPLASME - 24 nt en amont de la jonction exon/exon - indépendamment de la séquence en ARN

42 Fonctions biologiques de l épissage alternatif Régulation de l expression d un gène via le NMD pre-arnm épissage Le noyau de l'ejc est formé de 4 protéines ARNm ARNm Magoh eif4aiii noyau cytoplasme Y14 MLN51

43 Fonctions biologiques de l épissage alternatif Régulation de l expression d un gène via le NMD Pre-ARNm cap AUG exon intron exon stop (A)n splicing EJC ARNm cap AUG TAP/p15 stop (A)n La composition de l'ejc évolue au cours de la vie de l'arnm Upf3 export Noyau Cytoplasme Upf2 traduction cap AUG stop (A)n cap AUG stop (A)n

44 Fonctions biologiques de l épissage alternatif Régulation de l expression d un gène via le NMD

45 Comparaison du NMD chez la levure, la drosophile et les vertébrés

46 Fonctions biologiques de l épissage alternatif Régulation de l expression d un gène via le NMD Ex 1 : le pré-arnm FGFR2 IIIb IIIc stop IIIb IIIc IIIb stop IIIc NMD isoforme isoforme NMD

47 Fonctions biologiques de l épissage alternatif Régulation de l expression d un gène via le NMD Ex 1 : le pré-arnm FGFR2 IIIb IIIc CAU GGA CGC... AG A CGCAAA CAU GGA CGC... AG A CGCAAA

48 Fonctions biologiques de l épissage alternatif Régulation de l expression d un gène via le NMD Ex 2 : le pré-arnm PTB PTB PTB stop

49 Fonctions biologiques de l épissage alternatif Régulation de l expression d un gène via le NMD Ex 3 : les pré-arnm des protéines SR autorégulation par l'épissage d'un exon "poison" stop + protéine SR

50 Fonctions biologiques de l épissage alternatif Production d'arn possédant des séquences 3' UTR différentes stop stop 3' UTR1 3' UTR2 Conséquences sur : - La stabilité de l'arnm - La localisation de l'arnm - La traductibilité de l'arnm

51 Le contrôle tissulaire de l'épissage complexe E complexe A (+ATP) complexe B (+ATP) complexe C (+ATP)

52 Le modèle de la drosophile X 2L 2R 3L 3R 4 X Y Sexe déterminé par : nombre de chromosome X / nombre de jeu d autosomes ratio 0,5 ratio 1

53 Une cascade d'épissages alternatifs contrôle la détermination du sexe

54 Synthèse du facteur sxl (sex lethal) chez la femelle

55 sxl contrôle l'épissage de son propre pré-arnm sxl sxl sxl stop stop

56 sxl contrôle l'épissage du pré-arnm tra (transformer)

57 sxl contrôle l'épissage du pré-arnm tra (transformer) 1 sxl 2 U 2 AF 2' 3 1 2' 3 tra stop 1 U 2 AF 2 2' 3 stop 1 2 2' 3

58 tra contrôle l'épissage du pré-arnm dsx (double sex)

59 tra contrôle l'épissage du pré-arnm dsx (double sex)

60 Les exons alternatifs sont définis par des sites faibles AAUAAA U ou G/U riche distance

61 Exon définition et enhancer exonique (ESE)

62 Les protéines SR SRp20 SC 35 SRp46 SRp54 9G8 SRp30c ASF/SF2 SRp40 SRp55 SRp75

63 Les protéines SR Les protéines SR se concentrent dans des régions inter chromatiniennes du nucléoplasme : les speckles

64 Exon définition et enhancer exonique (ESE) Recrutement de facteurs : fonction dépendante du domaine RS Inhibition : fonction indépendante du domaine RS

65 Recherche de séquences ESE par SELEX fonctionnel (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) Principe du SELEX fonctionnel Séquences reconnues par les protéines SR

66 Exon définition et enhancer exonique (ESE) Recrutement de facteurs : fonction dépendante du domaine RS Inhibition : fonction indépendante du domaine RS

67 Les protéines SR et hnrnp

68 Modèles de répression

69 Le couplage entre la transcription et l'épissage Gènes placés sous le contrôle de promoteur pol I ou pol III - Pas d'épissage et de clivage/polyadénylation Transcription dirigée par une ARN pol II tronquée du domaine CTD - Pas d'épissage et de clivage/polyadénylation Interaction directe entre le domaine CTD de l'arn pol II et les facteurs de maturation du pré-arnm

70 Régulation co-transcriptionnelle de l'épissage alternatif Comparaison des profils d'épissage obtenus à partir de minigènes ou de pré-arnm transcrits in vitro. Effets de la structure des promoteurs sur le profil d'épissage EDI Exon EDI du pré-arnm de la fibronectine (FN)

71 Régulation co-transcriptionnelle de l'épissage alternatif Différence dans la vitesse d'élongation de la transcription Effet de la cinétique est dépendant de l'exon alternatif

72 Régulation co-transcriptionnelle de l'épissage alternatif Effet du complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF (BRM) sur l'épissage du pré-arnm CD 44

73 Régulation co-transcriptionnelle de l'épissage alternatif SRp20 augmente le saut de l'exon EDI EDI Srp20 SRp20 - +

74 Régulation co-transcriptionnelle de l'épissage alternatif La délétion du domaine CTD augmente l'inclusion de l'exon EDI

75 Régulation co-transcriptionnelle de l'épissage alternatif SRp20 augmente le saut de l'exon EDI via le domaine CTD

76 Régulation co-transcriptionnelle de l'épissage alternatif Recrutement différentiel de facteurs d'épissage

77 Le saut d'exon thérapeutique (exon skipping) Espoir pour la myopathie de Duchenne... Dystrophine : Pré-ARNm : 79 exons ORF : nt Protéine : 427 kda X Mutations : Codon stop prématuré NMD pas de protéine Décalage du cadre de lecture protéine non fonctionnelle Objectif sauter l'exon pour restituer le bon cadre de lecture

78 Le saut d'exon thérapeutique (exon skipping) Espoir pour la myopathie de Duchenne... Plusieurs stratégies : - Cibler les séquences consensuelles d'épissage - Produire un ARN antisens à partir d'une construction virale

79 Le saut d'exon thérapeutique (exon skipping) Espoir pour la myopathie de Duchenne... Plusieurs stratégies : - Cibler les séquences ESE (plus spécifique) X - Injection d'oligonucléotides synthétiques tels que les morpholino oligonucléotides ARN antisens ciblant un ESE