Hauts champs et plateformes cryogéniques : Des outils de choix en élucidation structurale Séminaire «A quoi sert» 25 mai 2017 Aurélien Lebrun Ingénieur d Etudes en R.M.N Laboratoire de Mesures Physiques
Principale contrainte de la RMN - Faible sensibilité // spectrométrie de masse -> Concentration élevée (ordre du 10-3 M) -> Durée d analyse très longue (expériences 29 Si ou 13 C >> 10 h) Intérêt des cryosondes : «uvrir le champ des possibles» -> Concentration réduite (ordre du 10-4 10-5 M) -> Durée d analyse réduite (expériences 29 Si ou 13 C ) -> Nouvelles expériences accessibles :INADEQUATE = CSY 13 C- 13 C etc
Exemples de l apport des cryosondes en RMN sur 2 problématiques rencontrées au Laboratoire de Mesures Physiques - Identification d une substance naturelle (faible concentration) - Etude d un polymère (expériences longues)
Identification de substance naturelle LCMS à 480 nm SYNAPT G2-S#UEB205 Z-Cirad17011801 4.0e-2 1 3.31 3 Sample 5 18-Jan-2017 3: Diode Array 480 Range: 5.855e-2 3.0e-2 1.32 2 AU 2.0e-2 1.84 1.0e-2 0.0 3.15-1.0e-2 Time 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 3 pics identifiés à 480nm
SPECTRES UV SYNAPT G2-S#UEB205 Sample 5 Z-Cirad17011801 3992 (3.346) 4.0e-2 207.81 462.81 18-Jan-2017 3: Diode Array 4.528e-2 3 AU 2.0e-2 263.81 0.0 nm 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 Z-Cirad17011801 2186 (1.841) 3: Diode Array 3.538e-2 2 AU 0.0 nm 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 Z-Cirad17011801 1561 (1.320) 3: Diode Array 5.604e-2 201.81 4.0e-2 1 AU 2.0e-2 2.0e-2 209.81 267.81 267.81 0.0 nm 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
SPECTRES MS SYNAPT G2-S#UEB205 Sample 5 Z-Cirad17011801 445 (3.322) 100 549.14 18-Jan-2017 1: TF MS ES+ 7.69e4 % 3 550.14 130.16 387.08 182.90 275.14 294.04 341.08 388.09 0 537.13 551.14 685.02730.73 748.70 930.08 888.70 955.53 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 Z-Cirad17011801 248 (1.856) 100 551.15 987.77 m/z 1: TF MS ES+ 6.05e4 389.10 552.15 390.10 130.16 275.14 373.10 182.90 236.15 505.14551.11 553.16 615.08 657.06 767.21 794.18 920.07967.22 0 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z Z-Cirad17011801 176 (1.322) 1: TF MS ES+ 100 551.15 9.91e4 % 2 % 1 389.10 552.15 130.16 182.90 264.09 343.09 390.10 539.15 553.16 713.20 863.04 979.47 644.41 754.07 824.47 935.15 0 m/z 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950
HRMS CMPSÉS 1 ET 2 Les deux composés 1 et 2 donnent une masse exacte respectivement de 551,1511 Da et 551,1512 Da Ce qui correspond à la formule brute : C24 H27 N2 13 Proposition d identification : Betanine 1 et 2 sont des isomères : betanine, isobetanine
MSMS CMPSÉ 1 SYNAPT G2-S#UEB205 Z-Cirad17011803 55 (1.230) Cm (54:58) 100 H N H Sample 5-MS/MS 389.10 18-Jan-2017 1: TF MSMS 551.15ES+ 6.06e4 H 150.06 Da % H H N + H H H H 389.10 Da 390.10 150.06 551.15 132.04 343.09 92.05 104.05 195.05 253.06 297.09 389.06 391.10 325.08 470.35 553.16 431.44 483.42 551.13 0 m/z 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550
HRMS CMPSÉ 3 Le composé 3 donne une masse exacte de 549,1359 Da Ce qui correspond à la formule brute : C24 H25 N2 13 Proposition d identification : Betanine avec une insaturation supplémentaire (position possible en rouge)
MSMS CMPSÉ 3 SYNAPT G2-S#UEB205 Z-Cirad17011803 145 (3.236) Cm (144:147) 100 H N H Sample 5-MS/MS 387.08 18-Jan-2017 2: TF MSMS 549.14ES+ 3.91e4 H % H H H H H N + 387.10 Da H 148.04 Da 295.07 388.09 549.13 267.08 313.08 228.05241.10 342.08 550.14 56.34104.05 132.05 148.04 176.07 389.09 452.01 387.04 429.09 474.93 531.12 0 m/z 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 341.08
La MSMS semble indiquer que la double liaison se situe dans le cycle à 6 avec un fragment caractéristique à 148 Da Afin de confirmer cela, le composé 3 est isolé par HPLC semi-prep pour être analysé par RMN Fraction récupéré pour la RMN estimée à quelques dizaines de μg
Approche sur RMN 600 MHz cryosonde TCI Prodigy - Contrainte liée à la quantité de produit disponible : produit inconnu dans D2 + calibrant HD DSS : 2,2-dimethyl-2-silapentane-5- sulfonate de sodium permet de calibrer un spectre 1H fait dans le D 2 DSS
Approche RMN 1D - Elimination du signal de «l eau» par présaturation Irradiation simple 1 h d acquisition au 600 MHz cryo DSS Produit inconnu
Approche RMN 1D H N H H H N + H H H H H
Approche RMN 2D HSQC 1H-13C «quels H sont portés par quels C?» 10 h d acquisition au 600 MHz cryo H N H H H N + H H H H H
Approche RMN 2D HSQC 1H-13C «quels H sont portés par quels C?» H N H H H N + H H H H H
Approche RMN 2D CSY 1H-1H «quels H sont voisins via les liaisons?» H N H CH H 3 h d acquisition au 600 MHz cryo H N + H H H H H CH-CH 2
Approche RMN 2D HMBC 1H-13C «quels C voient quels H à longue distance via les liaisons?» 20 h d acquisition au 600 MHz cryo
Approche RMN à température (50 C) 1H HSQC
d 13,3 Hz = trans Par ailleurs, La présence de la double liaison sur le cycle à 6 explique aussi l équivalence des 2 H «pyridine» qui sortent au même déplacement chimique (7,89 ppm) pour une intégration de 2.
Faisceau d indices - Spectre UV : signal à 462,8 nm (conjugaison d insaturations) - Fragmentation MSMS : pic à 148 (m/z) - Confirmation par RMN
ANALYSE D UN PLYMERE - Estimer le poids moléculaire d un polymère - Déterminer le degré de polymérisation (DP) - Déterminer la proportion de chaque monomère dans un copolymère - Etudier la cinétique de polymérisation - Etc
Exemple Copolymère PLA-PEG bjectif : déterminer la proportion de blocs PEG et de blocs PLA par RMN 1 ère étape: spectre 1H CH 3 facilement repérable Présence de signaux de faible intensité = bouts de chaine / monomères?
Exemple Copolymère PLA-PEG bjectif : déterminer la proportion de blocs PEG et de blocs PLA par RMN 2 ème étape : Attribution des signaux HSQC 1 H- 13 C Dmso-d6 Taches bleues = CH / CH3 Taches rouges = CH2
Exemple Copolymère PLA-PEG bjectif : déterminer la proportion de blocs PEG et de blocs PLA par RMN 2 ème étape : Attribution des signaux Déplacements chimiques 13C plus bas que les taches intenses (formes éthers ou esters) CH ou CH 2 à proximité d un alcool H? CH 2 se dédouble = H non équivalents = environnement différent? Bouts de chaine! (sûr à 100 %?) ou monomère restant en solution? (pas de spectre RMN des monomères!)
Exemple Copolymère PLA-PEG bjectif : déterminer la proportion de bloc PEG et la proportion de bloc PLA par RMN 2 ème étape : Attribution des signaux Monomères ou bouts de chaine? => DSY (15 min au 600 MHz) Diffusion HD DMS Petits signaux appartiennent au polymère car même coefficient de diffusion D = bouts de chaine
Exemple Copolymère PLA-PEG 3 ème étape : Détermination de la proportion de chaque bloc Ma RMN 1H était-elle quantitative? Mesure du T1
Exemple Copolymère PLA-PEG 3 ème étape : Détermination de la proportion de chaque bloc Ma RMN 1H était-elle quantitative? Mesure du T1 Massif à 5,2 ppm (CH PLA) T1 = 2,12s Massif à 3,51 ppm (CH2 PEG) T1= 0,77 s Massif à 1,29 ppm (CH3 PLA) T1= 0,82 s Pour être quantitatif, il faut optimiser le D1 à 10,5s (=5*T1)
Exemple Copolymère PLA-PEG 3 ème étape : Détermination de la proportion de chaque bloc Analyse des blocs n intègre les bouts de chaine pour 3 H CH (PLA) = 46,50 (pour 1H) CH2 (PEG) = 46,29 (pour 4H) = 46,29 / 4 = 11,57 CH3 (PLA) = 142,44 (pour 3H) = 142,44 /3 = 47,48 Soit m=48,00 blocs PLA (79% molaire) pour n=12,57 blocs PEG (21% molaire)
Exemple Copolymère PLA-PEG 4 ème étape : Détermination de la masse molaire moyenne Analyse des blocs n intègre les bouts de chaine pour 3 H MM (LA) = 73 g/mol MM (PLA) = 72 g/mol MM (EG) = 45 g/mol MM (PEG) = 44 g/mol MM (polymère) = ((47,0*72)+73) + (11,57*44)+45) = 3457,00 + 554,08 + 16 = 4027,08 g/mol k mais si on regarde les autres bouts de chaines entourées on obtient des intégrales de 2,07 pour 2H et 3,80 pour 3H. Autre méthode plus précise?
Exemple Copolymère PLA-PEG 5 ème étape : Mesure du temps de relaxation longitudinal T1 en RMN 13C - Sélection des signaux d intérêt pour l analyse quantitative - Prise en compte du T1 le plus élevé - T1 (C=) à 0,45 s!!!! Étrange - La courbe ne se finit pas, la calibration du T1 n a pas été optimisé pour le C= - En général : T1(Cq) > T1(CH) > T1 (CH 2 ) T1 (CH 3 ) varie selon les molécules
Exemple Copolymère PLA-PEG 6 ème étape : Spectre RMN 13C quantitatif Signaux proches en 13C entre CH (PLA) et CH2 (PEG), comment être sûr de qui est qui? => HSQC 13C-1H
Exemple Copolymère PLA-PEG 6 ème étape : Attribution des pics 13C Cf DSY
Exemple Copolymère PLA-PEG 6 ème étape : Détermination Masse molaire moyenne CH (PLA) = 49,32 (pour 1C) CH2 (PEG) = 24,61 (pour 2C) = 24,61 / 2 = 12,30 CH3 (PLA) = 49,63 (pour 1C) Soit m=50,47 blocs PLA (79% molaire) pour n=13,30 blocs PEG (21% molaire) MM(polymère) = 4237,04 g/mol
Exemple Copolymère PLA-PEG 6 ème étape : Conclusions Par RMN 1 H et 13 C : ratio molaire est identique 79% PLA 21% PEG En RMN 1 H : MM(polymère) = 4027,08 g/mol En RMN 13 C : MM(polymère) = 4237,04 g/mol MM (polymère) = 4132,1 g/mol 105 g/mol (incertitude à, %
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