Dardonville Billaud Bactério : 17 février 2011 (Chiron) Suite du cours IV Antiseptiques et désinfectants Cette partie traite les agents chimiques. 1) Généralités Les formulations ou spécialités qui contiennent des agents chimiques antimicrobiens sont utilisés dans la lutte contre les microorganismes. L activité microbienne est un terme au sens large : on parle d anti-tout : contre les bactéries, fongiques, virus et spores. Les termes antiseptiques et désinfectants sont employés dans des cas différents selon les pays : En France, aux USA et en Angleterre les antiseptiques sont appliqués sur des tissus vivants et les désinfectants sur des surfaces inertes. Tandis qu en Allemagne les produits pour les mains sont des désinfectants des mains et non des antiseptiques. Les objectifs de l activité antimicrobienne sont des résultats momentanés. C est un domaine à problème notamment pour les désinfectants (certains sont bons et d autres médiocres) car certains produits qui sont efficaces in vitro et qui ont une mauvaise utilisation sur le terrain deviennent inefficaces. 2) Statuts (juridique et définition actuelle) On se place dans le cadre européen. Les antiseptiques qui sont de véritables médicaments dépendent des directives des médicaments et devront obtenir une autorisation de mise sur le marché (AMM) soit par l agence européenne du médicament (EMA) dont le siège se situe à Londres ou par l AFSSaPS : ils répondent donc à des critères galéniques, toxicologiques, pharmacologiques et font l objet d études cliniques. Les antiseptiques à visée préventive sont utilisés dans le domaine médical ou vétérinaire rattaché à la directive BIOCIDE 98/8 établie par le conseil et parlement européen. Cette directive a mis de l ordre dans les antiseptiques, désinfectant, antimicrobiens, antiparasitaires, produit de conservation du bois. Il y a 23 types de produits dans l annexe. Cette directive a mis longtemps à être traduite en France. Actuellement on parle de pays rapporteurs, les fabricants déposent des dossiers sur la matière active pour être utiliser ultérieurement dans le cadre de la formulation. D ici 2012-2013 une liste devrait être établie mais elle a déjà du retard : cela va permettre le nettoyage d un grand nombre de produits, certaines industries risquent de fermer. Les désinfectants généraux rattachés à la directive biocide sont les désinfectants utilisés dans le cadre des dispositifs médicaux par exemple : liquide nettoyant les lentilles portent la marque CE sur l emballage et n ont pas bénéficié d autorisation de mise sur le marché, c est le fabricant qui est responsable car il n y a pas eu d instance évaluative du produit. Bientôt les lingettes et autres produits désinfectants vont aussi bénéficier d un grand nettoyage. Parmi les désinfectant utilisés qui ne sont pas sous la directive biocide, ils sont évalués par l AFFSSa ( Agence française de la sécurité sanitaire) et par l AFSET ( agence française de la sécurité de
l environnement et du travail), car il existe des produits dans le cadre du dossier qui sont bon mais sur le terrain sont médiocres : c est la problématique des infections nosocomiales. 3) Composition et Classification -La composition est une formulation complexe principalement pour les désinfectants car ils ont une activité antimicrobienne mais aussi d autres aspects : détergents, nettoyants. Les excipients qui complètent la formulation de la matière active ne sont pas neutres : il peut exister des interférences. Par exemple deux fabricants qui utilisent un même principe actif à une même concentration mais pas avec les mêmes excipients peuvent avoir des effets opposés : l un peut potentialiser la matière active et l autre peut très bien l inhiber. La composition varie également si le produit est prêt à l emploi ou si il doit être au préalable dilué avant d être utiliser (encore une fois la dilution n est pas toujours précise et respectée par différentes personnes ce qui peut engendrer des problèmes). -La Classification : - Les Oxydants : ANTI TOUT : bactéricide, fongicide, virucide, fongicide, sporicide. On retrouve parmi ces oxydants : L eau oxygénée à 10% classique mais aussi à 3% (plutôt dans la catégorie antiseptique en France) mais aussi le permanganate de potassium et l acide peracétique qui libèrent de l O 2. Le chlore et ses dérivés : sous forme gazeuse (très dangereux), avec combinaison chimique. Le chlore est le désinfectant le plus utilisé (piscine, eau du robinet). Il est surtout utilisé en milieu alcalin pour éviter les problèmes de corrosion. On retrouve essentiellement les hypochlorites et les chloramines : L hypochlorite de sodium (eau de Javel) possédant un titre chlorométrique de 10 à 20 ( le degré exprime le titre de chlore dégagé par Kg de produit) exemple : liqueur de Labarraque ou soluté de Dakin. Les chloramines sont des composés ou l hydrogène est remplacé par un chlore sur l amine. Ils ont une activité plus prolongé dans le temps que les hypochlorites mais ils sont moins efficaces. L Iode : bactéricide et fongicide essentiellement, il est peu soluble dans l eau mais soluble dans l alcool, on retrouve des solutions de iodure de sodium ou de potassium, des solutions iodo-iodurée (teinture d iode) mais l iode présente des propriétés de toxicité et causticité : problèmes entrainant des brûlures. Un produit connu à base d iode : la Bétadine. - L alcool : le pouvoir antimicrobien des alcools est proportionnel à leur masse moléculaire et leur solubilité dans l eau. Il y a donc un compromis entre la masse molaire et la solubilité. Par exemple : le méthanol est soluble dans l eau mais il est moins actif. Souvent on trouvera de l éthanol à 50 jusqu à 70.Aux USA on retrouve l isopropanol. L alcool est utilisé aussi comme conservateur : exemple : fruit.
- Les métaux lourds et leurs sels : la ionisation du métal et l affinité des ions avec les protéines cellulaires explique leur mécanisme d action : les sels d argent sont utilisés dans les collyres avec du nitrate d argent, les sels de mercure, cuivre, zinc et or précipitent avec les protéines ou ont une action au niveau des groupements thiols mais le problème c est qu ils attaquent aussi la cellule hôte ils ne sont pas sélectifs aux bactéries. De plus il existe aussi des bactéries possédant un plasmide de résistance aux métaux lourds (même problème que les plasmides qui ont une résistance aux antibiotiques). - Les phénols et composés phénoliques : bactéricide car le phénol est un inhibiteur enzymatique ou un inhibiteur énergétique qui fragilise la membrane plasmique des bactéries entrainant la fuite des constituants cellulaires de celle-ci. Cependant, l emploi de ces composés est néfaste pour la peau et les muqueuses respiratoires et oculaires. Ils ont un effet allergisant et auto sensibilisant. - Aldéhydes : agissent en dénaturant les protéines et acides nucléiques. On emploie soit du formaldéhyde soit du glutaraldéhyde : ils rejoignent le spectre des oxydants. exemple le glutaraldéhyde 2% est utilisé mais très contraignant car ses vapeurs sont toxiques. Si on classe par ordre d activité les premiers sont les oxydants et les deuxième sont les aldéhydes. - La Chlorexidine : biguanide insoluble dans l eau présentant un caractère basique : lorsqu on l utilise on remarque une très grande variabilité des résultats car elle est insoluble dans l eau. La variation des résultats à l intérieur d un même laboratoire est importante mais elle est encore plus importante lorsqu on compare les résultats de 2 labos. Elle agit aussi bien sur les Gram + que Gram et en fonction de sa concentration elle provoquera soit un effet bactériostatique soit un effet bactéricide. - Salicylanilide (dérivé bromé) et les Carbanilides (dérivé trichloré) : Ils présentent une faible toxicité chez les bactéries à Gram +. - Les savons et détergents synthétiques : sels sodiques ou potassiques d acides gras (acide linoléique par exemple). Grande variabilité en fonction des espèces : action de type mécanique des excipients mais pas de la matière active. Intérêt : pouvoir mouillant qui facilite la biodisponibilité de la matière active aussi appelé surfactant ou détergent anionique/cationique. Les détergents cationiques sont souvent des ammoniums quaternaires. Exemple : le glutaraldéhyde 2% et 1 à 2 ammoniums quaternaires. Les détergents non ioniques ont aucune activité antimicrobienne mais jouent un rôle de potentialisation exemple : mercryl laurylé. - Les colorants antiseptiques : à usage locale ou par voie digestive : activité diverse et degré variable. Exemple : bleu de méthylène, vert brillant, vert malachite sont des antibactériens. 4) Mode d action : Spectre d action : le spectre d action peut être large (toutes les bactéries, les microorganismes fongiques, les virus, les algues, les protozoaires). Cependant «l anti-tout» n existe pas. [les ammoniums quaternaires ont un spectre beaucoup moins large et peuvent donc être contaminés par certains germes comme par exemple pseudomonas aeruginosa]
Temps d action : L action doit se faire dans un temps le plus réduit possible (environ 5 minutes pour les bactéries, 15 minutes pour les fongiques et 1 heure pour les virus (sauf pour les antiseptiques pour les mains à base d hydrogène ou l action doit se faire 1 minute après l application)). Par ailleurs différentes actions sont possibles : l effet statique (simple inhibition) ou l effet létal. Taux de réduction des bactéries : 5 logarithmes (passage de 1OOOOO bactéries à 1 bactérie) Activité antiseptique bactéricide : 4 logarithmes Principaux mécanismes : Oxydation et dénaturation des protéines Coagulation des protéines (par l alcool) Désorganisation de la membrane cytoplasmique => fuite des constituants (par les agents liposolubles, les composés phénolés ou les savons) Action sur le métabolisme (cyanures et fluorure qui agissent sur le métabolisme respiratoire, les colorants basiques cytoplasmiques qui agissent sur l ARN, les dérivés quinoléiques qui sont des chélateurs, l acridine qui est mutagène) Interférences et substances interférentes : Interférences physiques (T et PH) [1 log de gagné par augmentation de 10 C et inversement] Tentions actives : les ions Ca²+ et Mg²+ provoquent des interférences et la non disponibilité des sites actifs La présence de matière organique peut interférer et faire varier l action d un facteur 10 (par exemple les matières organiques interférentes peuvent être : l alcool, les dérivés chlorés et les ammoniums quaternaires. La dureté de l eau => les produits doivent être dilués Problématique de la résistance : la résistance est relativement rare aujourd hui mais peut être est-ce dû au fait que très peu de recherches sont réalisées pour prouver cette résistance. Cependant une résistance est aujourd hui bien connue, la résistance des bactéries aux métaux lourds (cette résistance est une résistance plasmidique) [il n existe pas de corrélation entre la résistance des bactéries aux antibiotiques et aux agents chimiques désinfectants ou stérilisants]
5) Méthodes d études : La France est une pionnière en la matière et les 1ères règles ont été normalisées dans les années 70. Ensuite dans les années 90 l union européenne a elle aussi mis en place une normalisation. Cette normalisation reprend la normalisation française des années 70. Le principe d étude est de mettre en contact le produit, une suspension calibrée de bactéries (ou tout autre agent pathogène) et une substance interférente (on ne met pas forcément cette dernière). Si le produit est utilisé prêt à l emploi alors les dilutions sont faites à l eau distillée. Si le produit est concentré et devant être dilué alors les dilutions sont réalisées à l eau dure ( = eau du robinet) Après le contact on neutralise le produit (avec une dilution de neutralisation ou une filtration sur membrane) et on observe le nombre de bactéries viables. Par exemple : Ces normes sont utilisées dans 3 domaines différents : Médical Vétérinaire Domestique, collectif, industriel, agro-alimentaire Les seules différences entre ces 3 domaines sont les souches de référence utilisées, les température de contact, les temps de contacts et les substances interférentes. (depuis 3 à 4 ans il existe en plus des normes spécifiques pour certaines espèces comme mycobactérium ou les légionelles). Schéma des différentes phases de contrôle des normes européennes :
V) Antibiotiques et sulfamides : 1) méthodes d études : Basées sur la croissance bactérienne. De plus ces méthodes doivent être faites sur une seule espèce bactérienne (= culture pure. Et malgré tout même en culture pure on peut voir apparaitre des mutations et ainsi avoir une culture on homogène). On utilise des systèmes de lecture qui ont un seuil (on utilise d ailleurs très souvent l œil) Incidence sur l inoculum : 10^6 bactéries en milieu liquide et 10^4 en milieu liquide On peut étudier les actions d un antibiotique seul ou d une association d antibiotiques. Différents méthodes d études existent : La concentration minimale inhibitrice (CMI) où l on réalise une série de dilutions (dilution en cascade) de l antibiotique (avec un facteur ½), on ensemence les boites de pétri (ou les tubes) avec des bactéries et on place une concentration d antibiotique différente dans chaque boite (ou tube). Après incubation on observe la 1 ère boite (ou tube) où l on ne retrouve pas de colonies. La concentration en antibiotique de cette boite (ou tube) correspond à la CMI. La concentration minimale bactéricide (CMB) L antibiogramme : détermination de la résistance ou sensibilité d une espèce pour un antibiotique. Les conditions expérimentales, les inoculum, le temps de pré-incubation sont définis. Dans cette méthode on dépose des disques d antibiotiques sur une gélose ensemencée. Ceux-ci vont s hydrater et vont laisser diffuser leur antibiotique dans un cône sous-jacent ; une migration horizontale va ensuite s opérer selon le gradient de concentration de l antibiotique. Après incubation on observe les résultats (on observe le diamètre du cercle d inhibition des bactéries pour chaque antibiotique. On compare ces résultats avec ceux de l ABAC (livre de référence) et on conclue si les bactéries sont sensibles, résistantes ou intermédiaires à l antibiotique. Remarque : - un temps de pré-incubation est nécessaire avant de placer la gélose à l étuve. -un antibiotique actif in vitro n est pas forcément actif in vivo. Cependant l inverse est vrai.
Le E-test : on ensemence une gélose puis on place sur cette gélose une bandelette possédant une graduation d une charge d antibiotique. Après incubation on obtient une zone d inhibition en ellipse. La CMI correspond à la concentration indiquée sur la bandelette de l endroit où la zone d inhibition s interrompt. Remarque : Des associations d antibiotiques sont possibles pour le E-test et l antibiogramme. Les antibiotiques peuvent alors renforcer leurs activités ou au contraire s inhiber. Le titrage d un sérum : détermination de la concentration minimale bactéricide du sérum. Le titrage des antibiotiques : titrage physico-chimique ou microbiologique.