SOMMAIRE REMERCIEMENTS...1 RESUME..2 LISTE DES ABREVIATIONS...4 INTRODUCTION GENERALE. 5 ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE..8 I. LES PESTICIDES : RÉGLEMENTATION, UTILISATION ET DEVENIR DANS L ENVIRONNEMENT...9 I.1 Aspects réglementaires... 9 I.1.1 Normes européennes, françaises et portugaises sur les pesticides cas de l atrazine... 9 I.1.2 Programmes de maîtrise et de réduction des pollutions d origine agricole... 10 I.2 Caractéristiques de l atrazine... 12 I.2.1 Généralités... 12 I.2.2 Mode d utilisation et mode d action de l atrazine... 12 I.2.3 Aspects Toxicologiques... 14 I.3 Dispersion des herbicides dans l environnement... 15 I.3.1 Introduction... 15 I.3.2 Devenir dans le sol... 16 I.3.2.1 Rétention des pesticides dans le sol... 17 I.3.2.1.1 Facteurs de l adsorption... 18 I.3.2.1.2 Formation de résidus liés... 21 I.3.2.2 Dégradation des pesticides dans le sol... 22 I.3.2.2.1 Dégradation abiotique... 23
I.3.2.2.2 Dégradation biologique... 24 I.3.2.2.3 Minéralisation... 26 I.3.3 Volatilisation... 27 I.3.4 Contamination des milieux aquatiques... 28 I.3.4.1 Le Ruissellement : contamination des eaux de surface... 29 I.3.4.2 Le lessivage: contamination des eaux souterraines... 29 II. PROCÉDÉS DE TRAITEMENT DE L EAU POUR L ÉLIMINATION DES PESTICIDES...31 II.1 Introduction... 31 II.2 Elimination de l atrazine dans la filière classique de traitement des eaux usées... 31 II.3 Procédés physico-chimiques dégradatifs... 32 II.3.1 Oxydation à l ozone... 32 II.3.2 Oxydation au peroxyde d hydrogène... 34 II.3.3 Traitement au réactif de Fenton (AFT, Anodic Fenton Treatment)... 34 II.3.4 Dégradation photochimique... 35 II.4 Procédés non dégradatifs : adsorption sur matrice poreuse ou membrane... 35 II.4.1 Procédés d adsorption sur charbon actif en poudre ou en grains... 35 II.4.1.1 Généralités... 35 II.4.1.2 Application à l adsorption de l atrazine sur charbon actif (CA)s... 36 II.4.2 Procédés membranaires : microfiltration, ultrafiltration et nanofiltation... 38 II.4.3 Valorisation des déchets verts pour le traitement de l eau... 39 II.4.3.1 Une solution économique... 39 II.4.3.2 Quelques exemples... 39 II.4.3.3 Cas de l écorce de pin... 40 II.5 Procédés de dégradation biologique... 43 II.5.1 Caractéristiques générales des bioréacteurs... 43 II.5.2 Traitements biologiques appliqués aux eaux contaminées par l atrazine... 44 II.6 Procédés combinés... 47 II.6.1 Généralités... 47 II.6.2 La biofiltration... 49 II.6.2.1 Introduction... 49 II.6.2.2 Principales propriétés des biofilms... 49 II.6.2.3 Comportement des micro-organismes en biofilm... 50
II.6.2.4 Formation des biofilms... 50 II.6.3 Facteurs influençant la formation et l activité des biofilms... 52 II.6.3.1 Caractéristiques des micro-organismes... 52 II.6.3.2 Le support d adsorption... 53 II.6.3.2.1 Caractéristiques physiques du support d adsorption... 55 II.6.3.2.2 Caractéristiques chimiques du support d adsorption... 57 II.6.3.2.3 Caractéristiques microbiologiques du support d adsorption... 57 II.6.3.3 Composition du fluide... 58 II.6.3.4 Effet de la vitesse de circulation du fluide... 59 II.6.3.5 Effet de la température... 60 II.6.4 Cinétique de biodégradation d un substrat... 60 III. BIODÉGRADATION DE L ATRAZINE PAR PSEUDOMONAS ADP SP......62 III.1 Introduction... 62 III.2 Isolement de Pseudomonas ADP sp... 64 III.3 Taxonomie et exigences métaboliques... 65 III.4 Mécanisme de dégradation de l atrazine et isolement des gènes de Pseudomonas ADP sp. impliqués dans la minéralisation de l atrazine... 67 III.5 Différentes applications... 68 III.5.1 Traitement des eaux résiduelles d usine de fabrication de pesticides... 68 III.5.2 Traitement des sols pollués... 69 III.5.3 Décontamination de sédiments et aquifères pollués... 69 IV. DESCRIPTION MATHÉMATIQUE DU PROCESSUS D ADSORPTION...71 IV.1 Modélisation de l équilibre d adsorption... 71 IV.2 Ecoulement dans un milieu poreux... 74 IV.2.1 Organisation du milieu poreux... 74 IV.2.2 Hétérogénéité de l écoulement... 76 IV.2.3 Loi de Darcy... 76 IV.2.4 Vitesse d écoulement et tortuosité... 77
ETUDE EXPERIMENTALE 78 I. ETUDE DU SUPPORT D ADSORPTION : L ÉCORCE DE PIN «PINUS PINASTER»...79 I.1 Origine et répartition... 79 I.2 Chimie générale des écorces... 80 I.3 Caractéristiques physico- chimiques de l écorce de pin... 81 I.3.1 Caractéristiques physiques... 82 I.3.1.1 Principe de la méthode BET... 82 I.3.1.2 Principales caractéristiques... 82 I.3.2 Caractéristiques chimiques... 84 I.3.3 Analyse Infra Rouge des fonctions de surface... 85 I.3.3.1 Principe de l analyse Infra Rouge... 86 I.3.3.2 Protocole expérimental... 86 I.3.3.3 Interprétation du spectre IR... 86 I.4 Observations de la structure l écorce de pin au MEB... 87 I.5 Préparation de l écorce en vue des études d adsorption... 87 I.6 Préparation d un extrait aqueux d écorce de pin... 88 I.7 Méthode de stérilisation... 88 II. ADSORPTION DE L ATRAZINE SUR L ÉCORCE DE PIN...90 II.1. Matériel et Méthodes... 90 II.1.1 Etude de l adsorption en batch... 90 II.1.1.1 L atrazine : caractéristiques générales et méthodes d analyses... 90 II.1.1.1.1 Caractéristiques physico-chimiques... 90 II.1.1.1.2 Méthodes d analyse... 92
(a) Chromatographie Liquide Haute Pression... 92 (b) Dosage par Immuno-essai... 92 (c) Suivi des essais avec des molécules marquées au 14 C... 93 II.1.1.2 Cinétique d adsorption... 93 II.1.1.3 Isothermes d adsorption... 94 II.1.1.4 Extraction de l atrazine adsorbée sur l écorce de pin... 94 II.1.2 Etude de l adsorption en colonne... 95 II.1.2.1 Courbes d élution d un soluté... 95 II.1.2.2 Caractérisation de l écoulement à l aide de traceurs... 97 II.1.2.2.1 Choix du traceur... 97 II.1.2.2.2 Suivi du traceur en sortie de colonne... 97 II.1.2.3 Méthodes expérimentales d adsorption en colonne... 98 II.1.2.3.1 Préparation des colonnes... 98 II.1.2.3.2 Suivi du COD, du ph et de la conductivité en sortie de colonne... 100 II.1.2.3.3 Adsorption de l atrazine en colonne... 101 II.2 Résultats et discussion... 102 II.2.1 Etude de l adsorption en batch... 102 II.2.1.1 Cinétiques d adsorption... 102 II.2.1.2 Isothermes d adsorption... 103 II.2.1.2.1 Influence de la granulométrie de l écorce de pin sur l adsorption de l atrazine... 103 II.2.1.2.2 Influence du ph sur l adsorption de l atrazine... 104 II.2.1.2.3 Isotherme d adsorption de l atrazine sur l écorce de pin dans une large gamme de concentrations... 105 II.2.2 Etude de l adsorption en colonnes abiotiques... 107 II.2.2.1 Etude hydrodynamique des colonnes... 108 II.2.2.2 Suivi du COD, ph et conductivité en sortie de colonne... 109 II.2.2.3 Adsorption de l atrazine en colonne d écorce de pin en conditions abiotiques... 111 II.2.3 Conclusion... 113 III. BIODÉGRADATION DE L ATRAZINE EN CULTURE PURE DE PSEUDOMONAS ADP SP....115 III.1 Matériel et méthodes... 115 III.1.1 Milieux de culture... 115 III.1.1.1 Les milieux liquides... 115 III.1.1.1.1 Milieu minéral MM... 115 III.1.1.1.2 Milieu riche complexe LB... 116 III.1.1.1.3 Extrait aqueux d écorce de pin... 116
III.1.1.2 Les milieux solides... 117 III.1.2 Préparation et utilisation des cellules congelées... 117 III.1.2.1 Préparation de cellules congelées... 117 III.1.2.2 Utilisation de stocks congelés ou de précultures... 118 III.1.3 Suivi de la croissance des micro-organismes et de l activité respiratoire... 120 III.1.3.1 Suivi de la croissance cellulaire... 120 III.1.3.1.1 Mesure de turbidité... 120 III.1.3.1.2 Dénombrement sur boite de Pétri... 121 III.1.3.1.3 Dosage des protéines par la méthode de Folin- Lowry :... 121 III.1.3.1.4 Dosage des protéines par la méthode Bradford :... 121 III.1.3.2 Suivi de l activité respiratoire (ou Demande Biochimique en Oxygène DBO)... 122 III.1.3.2.1 Principe de la mesure... 122 III.1.3.2.2 Protocole expérimental... 123 III.1.3.3 Détermination du taux de croissance maximal... 123 III.1.4 Suivi de la biodégradation de l atrazine... 124 III.1.4.1 Biodégradation primaire de l atrazine... 124 III.1.4.2 Minéralisation de l atrazine... 125 III.1.4.2.1 Préparation des solutions mères d atrazine marquée... 126 III.1.4.2.2 Principe des essais de minéralisation... 126 III.1.4.2.3 Protocole expérimental... 127 III.1.5 Influence de paramètres physico-chimiques... 128 III.1.5.1 Influence des sources de carbone... 128 III.1.5.2 Influence de la température et du ph... 128 III.1.5.3 Influence d une source additionnelle d azote... 129 III.1.5.3.1 Croissance bactérienne et dégradation primaire de l atrazine... 129 III.1.5.3.2 Minéralisation de l atrazine... 129 III.1.5.4 Influence des composés solubles de l écorce de pin... 130 III.1.5.4.1 Influence sur l Activité Respiratoire de Pseudomonas ADP sp.... 130 III.1.5.4.2 Influence sur la croissance de Pseudomonas ADP sp.et la biodégradation de l atrazine 131 III.2 Résultats et dissussion... 132 III.2.1 Introduction... 132 III.2.2 Influence de paramètres physico-chimiques... 132 III.2.2.1 Croissance et biodégradation de l atrazine à différentes températures... 132 III.2.2.2 Croissance et biodégradation de l atrazine à différents ph... 134 III.2.2.3 Influence d une source additionnelle d azote... 135 III.2.2.3.1 Influence sur la dégradation primaire de l atrazine... 136 III.2.2.3.2 Influence sur la minéralisation de l atrazine... 137 III.2.3 Influence des composés solubles de l écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp... 138
III.2.3.1 Activité respiratoire de Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux d écorce de pin.. 139 III.2.3.2 Croissance de Pseudomonas ADP sp. et biodégradation de l atrazine en extrait d écocre de pin... 140 III.3 Conclusions... 144 IV. CARACTÉRISATION ET RÔLE DE LA MICROFLORE INDIGÈNE DE L ÉCORCE DE PIN...146 IV.1 Matériel et méthodes... 146 IV.1.1 Isolement et identification des micro-organismes de l écorce de pin... 146 IV.1.2 Capacité de la flore indigène à dégrader l atrazine... 147 IV.1.2.1 Biodégradation de l atrazine en consortium ou en cultures pures... 147 IV.1.2.2 Minéralisation de l atrazine par la flore indigène de l écorce de pin... 147 IV.1.3 Influence de la microflore de l écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp... 148 IV.1.3.1 Croissance de Pseudomonas ADP sp.... 148 IV.1.3.2 Biodégradation de l atrazine... 148 IV.1.3.2.1 Suivi de la dégradation primaire de l atrazine en extrait aqueux d écorce de pin 148 IV.1.3.2.2 Suivi de la minéralisation de l atrazine... 149 IV.2 Résultats et discussion... 150 IV.2.1 Isolement de la microflore de l écorce de pin... 150 IV.2.2 Capacité de la flore indigène de l écorce à biodégrader l atrazine... 151 IV.2.2.1 Biodégradation primaire de l atrazine... 151 IV.2.2.2 Minéralisation de l atrazine... 152 IV.2.3 Influence de la microflore de l écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp... 154 IV.2.3.1 Croissance de Pseudomonas ADP sp. et biodégradation de l atrazine en présence de la microflore de l écorce de pin... 154 IV.2.3.2 Minéralisation de l atrazine par Pseudomonas ADP sp. en présence de la microflore de l écorce... 156 IV.3 Conclusion... 158 V. ETUDE DU TRAITEMENT COMBINÉ...160 V.1 Matériel et méthodes... 160 V.1.1 Essais en batch... 160 V.1.1.1 Protocole expérimental... 160 V.1.1.2 Distribution de la radioactivité dans les essais en batch... 162
V.1.1.2.1 Radioactivité en solution... 163 V.1.1.2.2 Radioactivité associée à l écorce... 164 V.1.1.3 Devenir à long terme de l écorce à l issue du traitement combiné... 165 V.1.2 Essais en colonnes... 166 V.1.2.1 Choix des paramètres... 166 V.1.2.2 Inoculation et caractérisation du biofilm et de l hydrodynamique des colonnes... 167 V.1.2.2.1 Observation au MEB des micro-organismes sur l écorce de pin... 167 (a) Inoculation des colonnes... 168 (b) Traitement des échantillons pour observation au MEB... 168 V.1.2.2.2 Influence des micro-organismes sur le comportement hydrodynamique des colonnes 169 V.1.2.3 Protocole expérimental des essais de biofiltration... 170 V.2 Résultats et discussion... 173 V.2.1 Etude du traitement combiné en batch... 173 V.2.1.1 Minéralisation de l atrazine en présence d écorce de pin... 173 V.2.1.2 Analyses des composés radioactifs en solution en cours d incubation... 176 V.2.1.3 Répartition de la radioactivité résiduelle en fin de traitement... 179 V.2.1.4 Devenir à long terme de l écorce à l issue du traitement... 181 V.2.1.5 Conclusions... 184 V.2.2 Etude en colonne du traitement combiné... 186 V.2.2.1 Etude du développement de Pseudomonas ADP sp. en colonne d écorce de pin... 186 V.2.2.2 Influence du biofilm sur l hydrodynamique de la colonne... 187 V.2.2.3 Traitement combiné en colonne... 188 V.2.2.4 Conclusions... 194 CONCLUSION GENERALE ET PERPECTIVES... 196 ANNEXES...199 ANNEXE 1 : Spectre IR de l écorce de pin en poudre Identification des fonctions de surface.200 ANNEXE 2 : Observation au MEB d écorce de pin et de charbon actif 201 ANNEXE 3 : Caractéristiques des colonnes Etude hydrodynamique 203 ANNEXE 4 : Caractéristiques des colonnes Adsorption de l atrazine en conditions abiotiques...204 ANNEXE 5 : Observation au MEB de Pseudomonas ADP sp. en colonne d écorce de pin.205 ANNEXXE 6 : Caractéristiques des colonnes Influence d un biofilm sur l hydrodynamique.211
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES.212 LISTE DES FIGURES..227 LISTE DES TABLEAUX..234