Identification de récepteurs r endothéliaux stades vasculaires visualisés in vivo par échographie Doppler

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1 Identification de récepteurs r endothéliaux à différents stades vasculaires visualisés in vivo par échographie Doppler S.Lavisse 1, V. Lazar 2, P. Opolon 3, P. Dessen 2, A. Roche 1, N. Lassau 1 Équipes de recherche de l Institut Gustave-Roussy : 1 UPRES EA4040, Université Paris-Sud, Orsay 2 Unité de Génomique Fonctionnelle 3 UMR8121 Vectorologie et transfert de gènes 1

2 IMAGERIE Applications actuelles des agents de contraste échographiques Diagnostic: augmentation du signal en mode B ou Doppler : amélioration de la caractérisation de lésions tumorales malignes/bénignes Suspicion de sténoses/thromboses Évaluation de l efficacité de molécules anti-angiogéniques ou anti-vasculaires (mode Doppler et nouveaux modes de détection) Agents de contraste non spécifiques Axes actuels de recherche Ciblage des agents de contraste pour les rendre spécifiques d un tissu Vectorisation par agents de contraste encapsulant des molécules thérapeutiques THERAPIE Produit de contraste agent thérapeutique couple ligand-récepteur tumeur néovascularisée sonde d échographie 2

3 Objectif de l étude Corréler l expression de gènes préférentiellement exprimés par les cellules endothéliales avec le stade de vascularisation tumorale (B16F10) observée par échographie Doppler. Applications: : Optimisation du diagnostic et de la thérapeutique clinique : en terme de diagnostic: ces nouveaux marqueurs de la vascularisation permettront d optimiser le ciblage des agents de contraste ultrasonores en fonction du degré de vascularisation. lors de l administration de thérapeutiques ciblées, le traitement le mieux adapté sera choisi en fonction du stade vasculaire détecté par échographie pour cibler les marqueurs les plus nombreux et ainsi optimiser l efficacité de la thérapie. 3

4 Approche méthodologique Deux groupes G1 et G2 de souris Nude porteuses de tumeurs de mélanome B16F10 implantées en sous-cutané : Objectif pour G1 Par PCR quantitative détermination du profil d expression de facteurs connus de par la littérature tels que les intégrines α v β 3, l aminopeptidase N (APN) ou le VEGF. Objectif pour G2 Par la technologie des puces à ADN, mise en évidence de nouveaux marqueurs dont l expression était croissante avec le développement vasculaire. 4

5 Déroulement de l étude Échographies-Doppler des souris: détermination du stade vasculaire et répartition des souris suivant ce stade Sacrifice des animaux Prélèvement et préparation paration des tumeurs Extraction et préparation paration des ARN Analyses en génomique fonctionnelle 5

6 Déroulement de l étude Étude préliminaire de faisabilité sur un modèle de mélanome B16 Protocole échographique - mode B: volume des tumeurs : mesures des Longueur, largeur et Épaisseur) puis calcul du volume selon L*l*E/2 en mm3 -mode Doppler puissance: quantification de la vascularisation périphérique et intratumorale par balayage de toute la tumeur en transversal et en longitudinal. -mode harmonique (VRI-Toshiba): Injection de Sonovue (Bracco) puis quantification de la nécrose ( % prise de contraste Sonovue ) Sacrifice des souris et répartition dans 4 groupes suivant le stade vasculaire Analyses des tumeurs Première étape: Génomique - RT-PCR : Vérification de l expression de marqueurs connus (intégrines, VEGF-R) - Puces à ADN: Mise en évidence de gènes dont expression croît avec stade vasculaire Deuxième étape: Immunohistochimie Avec anticorps spécifiques des nouvelles cibles : visualisation de la localisation des protéines codantes correspondantes 6

7 Répartition des souris suivant 4 stades de développement vasculaire V1- aucun vaisseau V2- vaisseaux en périphérie de la tumeur V3-1 vaisseau intratumoral V4-plusieurs vaisseaux intratumoraux 7

8 Prélèvement des tumeurs et préparation des ARN Prélèvement des tumeurs: Chaque tumeur est coupée en 3 parties suivant le volume, et les différentes parties sont placées dans : de l azote liquide pour l analyse génomique, du Tissue-Tek puis azote liquide pour coloration en immunohistochimie des vaisseaux + récepteurs identifiés du fixateur liquide de Bouin pour le contrôle histologique de la nature du tissu prélevé. Extraction et préparation paration des ARN: Broyat des tumeurs Homogénéisation par un réactif permettant la séparation de la solution en trois phases l ARN est récupéré à partir de la phase aqueuse. Purification de l ARN à l aide d une membrane en gel de silicate. Contrôle de la qualité électrophorèse miniature 8

9 Analyses en génomique fonctionnelle Sondes et puces génomiques RT-PCR PCR: Les sondes d hybridation sont choisies pour suivre l évolution de gènes relatifs à des marqueurs connus de la littérature : VEGF-R, l aminopetidase N et l intégrine α v β 3. Puces à ADN (Agilent Technology) : Puces oligonucléotides de spots dont 2500 de contrôle 9

10 Groupe G1: Analyses RT-PCR des 3 gènes connus de la littérature Pour les 3 gènes VEGF-R, aminopetidase N et intégrine α v β 3 Évolution stationnaire dans les stades V1, V2 et V3. Expression diminuée de façon significative à V4 Résultat en contradiction avec l idée d une croissance vasculaire progressive associée à une augmentation de l expression de certains récepteurs sur-exprimés par les cellules endothéliales 10

11 Groupe G1: Analyses RT-PCR du gène CD34 Analyse des lames histologiques : Diminution de la densité vasculaire lors du développement tumoral du modèle B16F10 : malgré le développement progressif des vaisseaux induisant une augmentation du nombre de cellules endothéliales, Rapport croissant entre la masse des cellules tumorales et celle des cellules endothéliales. Connaître l évolution de l expression d un marqueur spécifique de ces cellules permet de suivre ce phénomène. RT-PCR du marqueur CD34. Diminution quasi linéaire de l expression de CD 34 11

12 Groupe G2: Normalisation des profils d expression sur puces à ADN Mêmes observations que l analyse par RT-PCR Profil d expression d un certain nombre de marqueurs connus et spécifiques des vaisseaux tumoraux, diminue avec l avancée de la vascularisation tumorale. Pour palier à la «dilution» des cellules endothéliales parmi les cellules tumorales, nous avons alors «normalisé» les profils d expression obtenus par les puces à ADN avec le profil d expression du CD34 obtenu par RT-PCR. 12

13 Conditions mathématiques d étude Expression des gènes g croissante en fonction de l avancement de la vascularisation sauf pour le groupe V1 où la tumeur ne présente pas de vaisseau ni en périphérie ni à l intérieur. L expression des gènes du groupe V4 doit donc être significativement supérieure à l expression dans le groupe V3 qui elle même doit être significativement supérieure à l expression dans le groupe V2. Probabilité p-value au niveau de chaque spot des puces inférieure à

14 Application des conditions mathématiques Une liste de 162 gènes g d intd intérêts a été obtenue via Gene Ontolongy et ces gènes ont été classés selon la localisation cellulaire de la protéine correspondante. Parmi les différentes localisations, nous nous sommes intéressés en particulier aux récepteurs membranaires: via UniProt, 12 gènes g codent pour une protéine intra-membranaire membranaire. Parmi les 162 gènes d intérêts, 4 gènes g ont une fonction inconnue (peu d annotations disponibles). Profils d expression des 12 gènes d intérêt codant pour une protéine membranaire 14

15 Étude histologique Objectifs : définir la nature des tissus prélevés et transférés à l UGF déterminer la densité vasculaire par marquage CD34. Analyses: Densité vasculaire décroissante de V1 à V4, Tissus tumoraux envahis par cellules stromales et musculaires. Invasion prévisible sans la réalisation de microdissection. Phénomène d autant plus prononcé que la taille des tumeurs est petite (groupe V1 et V2) avec prélèvement inévitable de tissus adjacents. Collaboration avec l unité UMR

16 Conclusion générale Mise en évidence plusieurs difficultés s d ordre d technique et biologique Étude spécifique des cellules endothéliales travail sur des fragments tumoraux complets (pas de microdissection), en se basant sur l hypothèse d augmentation du nombre des cellules endothéliales dans les tumeurs des groupes 1 à 4 du modèle expérimental: cette hypothèse ne s est pas révélée vraie pour le mélanome B16. Dissection des petits volumes tumoraux contaminations de cellules musculaires et stromales, inhérentes à la manipulation des petites tumeurs. Malgré la mise en évidence des 12 gènes g intra-membranaires, les difficultés s rencontrées es illustrent la nécessitn cessité de travailler au sein d une d équipe pluridisciplinaire ayant des compétences complémentaires mentaires en physique, biologie moléculaire, histologie, imagerie, expérimentation animale, et bio-informatique. informatique. 16