EXPOITATION PEDAGOGIQUE DE TRAVAUX PRATIQUES

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1 EPREUVE PRATIQUE ET ORALE D ADMISSION SESSION : 2004 EXPOITATION PEDAGOGIQUE DE TRAVAUX PRATIQUES Durée : 8 heures Coefficient : 2 - Travaux pratiques de biochimie, durée 3h, coefficient Travaux pratiques de microbiologie, durée 3h, coefficient Exposé et entretien : durée 1h, coefficient 1, préparation 1h Cette année, l épreuve orale d exposé et d entretien portait, au choix du candidat, soit sur les techniques de biochimie, soit sur les techniques de microbiologie. L épreuve se subdivise en trois parties: Première partie: travaux pratiques de biochimie (3h) Deuxième partie: travaux pratiques de microbiologie (3h) Troisième partie: exploitation pédagogique de travaux pratiques de biochimie ou de microbiologie (2h) Première partie : travaux pratiques de biochimie Durée 3 heures ( Documents personnels non autorisés ) ANALYSE D UN VIN BLANC DOUX Les vins blancs doux, tels que Sauternes, Barsac, Montbazillac, Côteaux du Layon, etc.. sont obtenus à partir de raisins atteints de pourriture noble ( Bothrytis cinerea ) qui provoque une évaporation partielle du jus contenu dans les grains restés sur les souches. La fermentation du jus ainsi concentré naturellement est lente; il reste du sucre naturel et les vins obtenus ont une saveur particulière. Ces vins ont une composition caractéristique: en plus de leur teneur élevée en glucose et fructose, ils peuvent contenir des quantités élevées d acide malique (la fermentation malo-lactique dans le cas de ces vins étant très incomplète), c est pourquoi leur acidité totale est relativement élevée. On se propose d analyser quelques uns de ces paramètres sur le vin blanc fourni. I- Dosage des sucres du vin par méthode colorimétrique au 3-5 DNS Le glucose et le fructose sont dosés grâce à leurs propriétés réductrices en milieu alcalin et à chaud, vis à vis de l acide 3-5 dinitrosalycilique (3-5 DNS), par méthode colorimétrique.

2 1-1- Etalonnage Dans une série de six tubes à essais, introduire des volumes variables de 0 à 1 ml d une solution étalon mixte de glucose et de fructose (1,4 g/l de chaque ose). Compléter les tubes à 3 ml avec de l eau distillée. Ajouter 2 ml de réactif au 3-5 DNS. Mélanger. Boucher les tubes avec du coton cardé et du papier aluminium. Incuber dans un bain thermostaté à 100 C pendant exactement 5 minutes. Refroidir dans un bain d eau froide. Ajouter dans chaque tube 15 ml d eau distillée. Homogénéiser. Laisser reposer environ 15 minutes, puis lire les absorbances à 530 nm (coloration stable plusieurs heures) Essais: deux essais E1 et E2 - Réaliser le dosage sur une prise d essai de 1 ml de vin convenablement dilué, dans les mêmes conditions que l étalonnage. Donnée: la teneur totale en sucres des vins de cette catégorie est comprise entre 40 et 100 g/l 1-3- Compte rendu Indiquer la (ou les) dilution(s) du vin choisies pour les essais. Compléter le tableau de colorimétrie ( tableau n 1 fourni en annexe). Tracer, à l aide de l outil informatique, la courbe d étalonnage. Déterminer la concentration massique du vin en hexoses. II- Dosage de l acide malique du vin par méthode enzymatique Ce dosage est réalisé comme indiqué dans la fiche technique fournie en annexe (page 5/6 : dosage enzymatique de l acide malique ). On réalisera: - le dosage de l acide malique libre du vin - le dosage de l acide malique total (après hydrolyse alcaline de l acide malique estérifié) 2-1- Hydrolyse de l acide malique estérifié Dans un ballon, introduire: - 20 ml de vin - 6 ml de solution d hydroxyde de sodium à 2 mol/l. Surmonter le ballon d un réfrigérant droit. Porter à ébullition (à l aide d un chauffe-ballon) et chauffer à reflux pendant 30 minutes. Après refroidissement, neutraliser avec une solution d acide sulfurique à 1 mol/l (papier ph). Transvaser quantitativement dans une fiole jaugée de 200 ml (eau distillée qsp 200 ml): on obtient la solution S 2-2- Dosage spectrophotométrique: 2 essais pour chaque échantillon Réaliser le dosage en utilisant la fiche technique en opérant sur des dilutions convenables du vin (essais V et V ) et de la solution S (essais S et S ).

3 Donnée: la teneur totale en acide malique total des vins de cette catégorie est comprise entre 2 et 8 g/l et l acide malique estérifié représente moins de 20 % de l acide malique total Compte rendu et résultats - Indiquer les dilutions choisies pour le vin et la solution S. - Compléter le tableau de mesures (tableau n 2 fourni en annexe) - Etablir la formule de calcul permettant de déterminer la concentration massique en acide malique d un échantillon. - Déterminer les concentrations en acide malique libre et acide malique estérifié du vin analysé III- Détermination de l acidité totale du vin par méthode ph-métrique La méthode de référence pour la détermination de l acidité totale d un vin consiste en un dosage potentiométrique: par convention, on amène le ph du vin à 7,0, la titration étant suivie au ph-mètre. L acidité due au dioxyde de carbone n est pas comprise dans la définition de l acidité totale, avant le dosage, on réalisera une décarbonication : élimination du dioxyde de carbone par agitation du vin sous pression réduite. 3-1-Elimination du dioxyde de carbone du vin Réaliser le montage nécessaire, la dépression étant obtenue grâce à une trompe à eau. Agiter environ 2 minutes, jusqu à ce que vin ne mousse plus Dosage potentiométrique (1 essai) Etalonner le ph-mètre Introduire 10 ml de vin décarboniqué dans un bécher (additionné d un peu d eau distillée, si nécessaire) et verser à la burette la solution d hydroxyde de sodium de concentration molaire exacte de 0,05 mol/l, pour amener le ph du vin à Compte rendu et résultats Compléter le tableau n 3 fourni en annexe. Déterminer l acidité totale du vin exprimée en concentration molaire en protons dans le vin. Exprimer le résultat de la façon conventionnelle (utilisée en œnologie) en g d acide sulfurique par litre de vin. Donnée: masse molaire de l acide sulfurique : 98 g/mol

4 DOSAGE ENZYMATIQUE DE L ACIDE MALIQUE (d après Boehringer) Principe L-MDH (1) L-malate + NAD + ææ oxaloacétate + NADH + H + (2) ASAT oxaloacétate + L-glutamate æææ L-aspartate + 2-oxoglutarate L acide malique (L-malate) est oxydé en oxaloacétate par le NAD sous l action de la L-malate déshydrogénase (L- MDH). L équilibre de cette réaction est déplacé dans le sens (1) sous l action de l ASAT (aspartate aminotransférase) qui catalyse, en présence de L-glutamate, la transformation de l oxaloacétate en L-aspartate. C est le NADH libéré qui est dosé par spectrophotométrie. Réactifs solution 1: glutamate en solution tampon ph=10 solution 2: solution de NAD + suspension 3: suspension d ASAT solution 4: solution de MDH Préparation des échantillons Le vin peut être analysé directement après une dilution adéquate Mode opératoire Opérer directement dans des cuves de trajet optique de 1 cm (cuves UV ) Introduire dans les cuves Blanc Echantillon Solution 1 1,00 1,00 Solution 2 0,20 0,20 Suspension 3 0,01 0,01 Solution échantillon - 0,10 Eau distillée 1,00 0,90 Mélanger. Après environ 3 minutes, lire les absorbances des solutions (A1) contre l air. Solution 4 0,01 0,01 Mélanger. Après fin de la réaction (5-10 minutes), lire les absorbances (A2). Conditions de mesure et valeurs de calculs Longueur d onde: 340 nm e NADH = 6,3 L. mmol -1. cm -1 pour une longueur d onde de 340 nm Masse molaire de l acide malique: 134 g/mol Facteur de dilution: f Variation d absorbance corrigée: A = A échantillon - A blanc Linéarité: 0-0,35 gramme par litre de solution échantillon.

5 RELEVE DE VALEURS EXPERIMENTALES: A compléter et à joindre à la copie n poste: Tableau n 1: Dosages des hexoses du vin Tubes E1 E2 Masse d hexoses par tube (en 0 mg/tube) Solution étalon 0 Echantillon (ml) Eau distillée (ml 3,0 Absorbances lues à 530 nm Tableau n 2: dosage de l acide malique Absorbances lues à 340 nm blanc V V S S A1 A2 A2 A1

6 Tableau n 3: Acidité totale Volume de solution d hydroxyde de sodium versé =

7 Deuxième partie Travaux pratiques de microbiologie Premier jour Durée 2h Documents personnels non autorisés Contrôles microbiologiques d un produit cosmétique Liste du matériel spécifique mis à la disposition du candidat pour réaliser l ensemble des manipulations prévues le premier jour - un flacon de 20 ml de lotion C - un flacon de 90 ml de tryptone-sel stérile - 2 tubes de 9 ml de tryptone-sel stériles - 6 tubes de 15 ml de gélose PCA stériles en bain thermostaté à 55 C - 6 tubes de 5 ml de gélose PCA stériles en bain thermostaté à 55 C - 6 boîtes de Petri stériles - une culture de Staphylococcus aureus ATCC 9144 sur gélose nutritive inclinée - une gélose trypticase-soja coulée en boîte de Petri stérile - un étalon 0.5 de Mac Farland - 1 tube à hémolyse contenant environ 3 ml d eau distillée stérile - 2 disques de papier filtre stériles - une gélose nutritive en boîte de Petri stérile - un tube de 10 ml d eau physiologique stérile - un tube d environ 10 ml de bouillon cœur-cervelle stérile - un test d agglutination pour Staphylococcus aureus - une anse calibrée de 10µL 1. Dénombrement de la flore mésophile aérobie totale (FMAT) Réaliser 100 ml de suspension-mère A partir de la suspension-mère, préparer deux dilutions décimales en cascade. Réaliser des ensemencements en double et dans la masse à partir de la suspension-mère et de chacune des dilutions. Incuber les boîtes 24h à 37 C. Le candidat montrera la réalisation des dilutions à un examinateur. 2. Recherche du pouvoir inhibiteur intrinsèque (PII) vis à vis de la souche-test de Staphylococcus aureus ATCC 9144 On appelle PII d un produit cosmétique, la faculté que possède ce produit d empêcher le développement des micro-organismes dans les conditions de l expérience. Ce pouvoir inhibiteur peut être dû à la présence d une substance chimique spécifique ou être consécutif à la formulation. Réaliser une suspension de la souche-test en bouillon ordinaire de densité environ 10 5 bactéries ml -1. Inoculer la surface d une gélose TS avec 0.1 ml de cette suspension et étaler uniformément à l aide d un étaleur en verre. -1 Déposer sur la boîte, un disque imprégné de la lotion C à la dilution 10 préparée en 1. (dénombrement de la flore

8 mésophile totale) et un disque servant de témoin négatif. Incuber 24h à 37 C. Donnée : l étalon 0.5 de l échelle Mac Farland est équivalent à environ 1 à UFC.mL -1. Préciser le rôle du témoin négatif. Le candidat réalisera l imprégnation et le dépôt d un disque devant un examinateur. 3. Contrôle de l identité et de la pureté de la souche-test Staphylococcus aureus ATCC Vérifier la pureté de la souche. - Vérifier les caractéristiques morphologiques et effectuer le test enzymatique adapté. Staphylococcus aureus possède une coagulase libre et des molécules de surface facilement détectables par agglutination sur lame. - Vérifier que la souche-test possède ces caractéristiques. Le candidat présentera tous les examens ou/et tests effectués à un examinateur.

9 Deuxième partie Travaux pratiques de microbiologie Deuxième jour Durée 1h Documents personnels non autorisés Contrôles microbiologiques d un produit cosmétique 1. Dénombrement de la flore mésophile aérobie totale (FMAT) Analyser les ensemencements et déterminer le nombre de germes mésophiles aérobies totaux par ml de lotion C. 2. Recherche du pouvoir inhibiteur intrinsèque (PII) vis à vis de la souche-test de Staphylococcus aureus ATCC 9144 Interpréter les résultats obtenus et conclure quant à la présence d un pouvoir inhibiteur intrinsèque. 3. Contrôle de l identité et de la pureté de la souche-test Staphylococcus aureus ATCC Analyser les résultats et conclure.

10 Troisième partie Exploitation pédagogique de travaux pratiques de biochimie Durée de l exposé: 1 h Temps de préparation: 1 h ( Documents personnels non autorisés ) L application pédagogique sera présentée au cours d un exposé d une durée de 20 minutes suivi d un entretien avec le jury d une durée de 40 minutes. SUJET - Préparer un exposé préliminaire en vue de travaux pratiques à destination d élèves de terminale STL biochimie-génie biologique et portant sur les méthodes de dosage des glucides. - Préciser comment cet enseignement sera abordé et utilisé dans la progression de l année. Troisième partie Exploitation pédagogique de travaux pratiques de microbiologie Durée de l exposé : 1h Temps de préparation : 1h Documents personnels non autorisés L application pédagogique sera présentée au cours d un exposé d une durée de 20 minutes suivi d un entretien avec le jury d une durée de 40 minutes. SUJET - Préparer un exposé préparatoire en vue de travaux pratiques à destination d élèves de Première STL biochimie-génie biologique et portant sur la systématique bactérienne. - Préciser comment cet enseignement sera abordé et utilisé au cours de la progression de l année.