Université Joseph Fourier Département Licence Sciences & Technologie RAPPORT DE STAGE EFFETS COMBINES D UNE COMPLEMENTATION EN CITRULLINE ET D UN ENTRAÎNEMENT EN ENDURANCE SUR LE METABOLISME MUSCULAIRE ET LE CONTRÔLE DE LA MASSE MUSCULAIRE McCLUSKEY Maximilian Laboratoire d accueil : LBFA - INSERM U1055 Directeur du laboratoire : SCHLATTNER Uwe Responsable du stage : DUBOUCHAUD Hervé Licence Biologie 2 ème année Chimie Biologie Année universitaire : 2013 2014 1
Sommaire : I. Remerciements 3 II. Généralités sur le LBFA 3 III. Présentation du sujet 4 IV. Protocole expérimental 4 1. Mise en place 4 2. Isolement des mitochondries de cerveau 5 3. Dosage des protéines 6 4. Mesure de potentiel de membrane (Courbe de Nicholls) 8 5. Mesure des ROS Muscle/Cerveau (30 C) Amplex Red 9 V. Résultats 11 VI. Points positifs et négatifs du stage 12 Conclusion 14 Annexe : Substrats, inhibiteurs et découplants 15 2
I. Remerciements J aimerais remercier en premier lieu Uwe SCHLATTNER et l équipe du LBFA pour m avoir donné la chance d effectuer mon stage dans ce laboratoire. Je remercie également mes encadrants, Arthur GORON, Cécile BATANDIER, et Christophe MOINARD, leur investissement et explications m ont permis d avoir tous les éléments pour faire un travail de qualité. Je tiens aussi à remercier Hervé DUBOUCHAUD pour m avoir offert ce stage, ainsi que Frédéric LAMARCHE et Karine COUTURIER. II. Généralités sur le LBFA «Le Laboratoire de Bioénergétique Fondamentale et Appliquée (LBFA) est un laboratoire reconnu à la fois par le Ministère de l'education Nationale, de l'enseignement Supérieur et de la Recherche (MENESR) et l'institut National pour la Santé et la Recherche Médicale (INSERM). Il est dirigé par Uwe Schlattner. Il a été créé en 1994 et a évolué au cours des années pour aboutir à sa structuration actuelle. Les activités de recherche menées sont centrées autour de la bioénergétique ou l'étude des mécanismes de production, de distribution et d'utilisation d'énergie, de leurs régulations, que ce soit au plan fondamental ou appliqué. Les travaux s'intéressent aux interrelations entre métabolisme énergétique et grandes fonctions cellulaires. Depuis quelques années, l'évolution des connaissances modifie les notions classiques de la régulation du métabolisme énergétique, ouvrant des perspectives nouvelles dans les domaines de la régulation de l'homéostasie cellulaire et des transferts d'énergie dans la cellule. Il ressort, entre autres, que la mitochondrie a un rôle central dans la vie des cellules qui va bien au-delà de la seule synthèse d'atp. En effet, elle aurait aussi un rôle dans la régulation des grandes fonctions cellulaires via des modifications de rendement de son fonctionnement. Le projet actuel de l'unité est organisé autour de 6 thèmes complémentaires (plus d'infos...) centrés sur ces aspects. Le LBFA a la particularité de regrouper des personnels de 4 UFR de l'université Joseph Fourier (Activités Physiques et Sportives, Biologie, Médecine et Pharmacie), de l'inserm, du CNRS, de l'inra et du CHU de Grenoble auxquels s'ajoutent de nombreux collaborateurs français et étrangers. Les travaux menés font appel à des techniques de biochimie, de biologie 3
cellulaire et moléculaire, de modélisation et d'imagerie appliquées à différents modèles physiologiques d'intérêt. Ces techniques reposent également sur certains équipements milourds qui sont mutualisés avec d'autres laboratoires du campus.» (Issu de http://www.expernova.com/directory/labs/laboratoire-de- Bio%C3%A9nerg%C3%A9tique-Fondamentale-et-Appliqu%C3%A9e-LBFA-en- 148f53f726adf07d.html). III. Présentation du sujet Intitulé : Effets combinés d une complémentation en citrulline et d un entrainement en endurance sur le métabolisme musculaire et le contrôle de la masse musculaire. Il est reconnu que la conservation et le développement de la masse musculaire est essentiel pour préserver une santé et une vie de qualité. Ainsi l exercice et la nutrition sont reconnus pour être de bons moyens d améliorer la fonction et le métabolisme musculaire. Ainsi les acides aminés, utilisés pour la synthèse protéique, ont également des fonctions régulatrices très importantes pour la performance et la récupération musculaire. Parmi ceux-ci existe la citrulline (CIT), un acide aminé non protéinogène issu de la pastèque. Ainsi depuis quelques années, il a été montré que CIT a un rôle de régulation de l homéostasie azotée et pour l augmentation de la synthèse protéique dans le muscle. De plus, quelques études sugèrent que la CIT pourrait avoir un rôle sur le métabolisme énergétique. Toutes ces données nous font penser que la CIT et l exercice pourraient avoir des effets synergiques pour améliorer la performance et le fonctionnement musculaire chez le sujet sain. Dans cette étude, nous nous sommes focalisé sur l effet d une complémentation en CIT associée à un entrainement en endurance sur le métabolisme énergétique au niveau musculaire et cérébrale. IV. Protocole expérimental 1) Mise en place L étude est faite sur le rat Wistar mâle. Ils sont répartis en quatre groupes : 4
Rats contrôles Rats supplémentés en citrulline Rats contrôles entrainés Rats supplémentés en citrulline entrainés La dose en citrulline donnée aux rats est de 1 g/kg/jour. Les rats sont entrainés sur tapis roulant avec une inclinaison de 10%, ceci tous les jours pendant une heure environ pour 8 semaines. 2) Isolement des mitochondries de cerveau Afin de ne pas affecter le fonctionnement des mitochondries, les rats sont sacrifiés par décapitation sans anesthésie. Ensuite sont récupérés les deux muscles gastrocnémiens et le cerveau ainsi que le sang. Matériel : - Ciseaux pour découper la peau de crâne + muscles - Ciseaux (gros) pour couper la boîte crânienne - Ciseaux (fins) pour émincer le cerveau - 2 pinces bouts pointus - Spatule fine et spatule courbe - Cupule en porcelaine - Petit bécher - Potter de 30 ml (verre/verre) - Tubes de centrifugation à fond rond (30 ml) - Centrifugeuse réfrigérée Réactifs : - Tampon MSHE (Mannitol 225 mm, Sucrose 75 mm, Hépes 10 mm, EGTA 1 mm ph 7,4/KOH) à 4 C env. 125 ml - Tampon MSHE-BSA ; ajouter extemporanement BSA : 1mg/ml qsp 100 ml - Digitonine 10% dans le DMSO (100 mg/ml) Attention : toute la préparation doit se dérouler à 4 C 5
1) Guillotiner le rat rapidement puis recueillir le sang 2) Cisailler la boite crânienne à partir de tronc cérébral ouverture médiane et latérales ôter l os pour dégager le cerveau avec la spatule courbe 3) Prélever le cerveau en coupant le nerf optique, le poser sur de papier aluminium froid et éliminer le cervelet avec la spatule fine 4) Placer rapidement le cerveau antérieur dans le Tp MSHE glacé (cupule en porcelaine) 5) Eliminer les méninges et vaisseaux sanguins avec les pinces 6) Placer le cerveau dans 15-20 ml de Tp MSHE-BSA, cisailler en très petits morceaux (bécher) 7) Homogénéiser dans le potter jusqu à disparition des fragments en évitant tout échauffement (effectuer cette opération dans la chambre froide). Placer l homogénat dans le tube en complétant à 30 ml avec du Tp MSHE-BSA 8) Centrifuger l homogénat à 500g pendant 5 min à 4 C «centrifugation lente» : les mitochondries se trouvent dans le surnageant, les débris cellulaires et les noyaux dans le culot 9) Récupérer le surnageant (attention : le culot se décolle facilement) 10) Centrifuger les surnageants à 12000g à 4 C pendant 10 min. «centrifugation rapide» : les mitochondries se retrouvent dans le culot 11) Suspendre le culot dans 10 ml de Tp MSHE-BSA + 30 μl de digitonine 10% ; incubation 4 min. à 4 C 12) Ajouter 20 ml de Tp MSHE-BSA 13) Centrifuger le surnageant à 12000g pendant 10 min. à 4 C 14) Reprendre le culot dans env. 10-20 ml de Tp MSHE-BSA 15) Centrifuger à 12000g pendant 10 min. à 4 C 16) Suspendre doucement le culot dans 500 μl de Tp MSHE-BSA Le dosage des protéines de la suspension mitochondriale (dilution au 1/50 ième ) et du Tp MSHE-BSA (pur) s effectue par le kit «Pierce» bicinchoninique, selon le protocole recommandé. Il faut ensuite soustraire la valeur obtenue pour le tampon afin de connaître la concentration en protéine mitochondriales de la suspension. 3) Dosage des protéines 6
Pour avoir une idée de la concentration en mitochondrie, nous devons faire un dosage protéique. Ceci est réalisé grâce à une gamme étalon. A partir de la valeur obtenue on en déduira la quantité de mitochondrie à rajouter au volume réactionnel lors de la mesure du potentiel de membrane et des ROS. Matériel et consommables : - 6 tubes eppendorf de 1,5 ml - 1 tube falcon 15 ml - 1 microplaque 96 puits - BSA 2 mg/ml - Kit Pierce (salle d opération) - Etuve 37 C - Lecteur de plaque et PC avec logiciel KC Junior Mode opératoire : 1. Réactif de Pierce Préparer le réactif dans un tube falcon de 15 ml et vortexer. 7 ml de réactif permettent de faire le dosage en triple. Ainsi dans 7 ml de réactif A on ajoute 140 µl de réactif B. 2. Gamme étalon Concentration Volume BSA (2 (en mg/ml) mg/ml) Volume H2O 0 0 μl 120 μl 0,25 15 μl 105 μl 0,5 30 μl 90 μl 0,75 45 μl 75 μl 1 60 μl 60 μl Préparer la gamme étalon dans les tubes eppendorf à partir de la BSA 2 mg/ml. 3. Echantillons Diluer l échantillon des mitochondries : 7
- Au 1/100 pour les mito de foie, 5 μl de mito + 495 μl d H20 - Au 1/50 pour les mito de cerveau et de muscle, 5 μl de mito + 245 μl d H2O Le tampon MSHE-BSA (Tp) est dosé en l état (pas de dilution) 4. Disposition des échantillons Dans chaque puits de la microplaque, déposer 25 μl d échantillon dilué (bien vortexé) puis 200 μl de réactif avec la pipette répétitive, selon le schéma suivant : Blanc Blanc Blanc G0 G0 G0 G0,25 G0,25 G0,25 G0,5 G0,5 G0,5 G0,75 G0,75 G0,75 G1 G1 G1 Tp Tp Tp E 1/50 E 1/50 E 1/50 Replacer le couvercle sur la microplaque et incuber 30 à 37 C. 5. Lecture de la plaque La lecture est faite avec le logiciel KC Junior en utilisant le protocole «CERVIRMIT». 4) Mesure de potentiel de membrane (Courbe de Nicholls) Des mesures de potentiel de membrane et d oxygraphie sont faites en suivant ce protocole puis rassemblées pour obtenir la courbe de Nicholls, un tracée de la respiration en fonction du potentiel. Or on sait que ces deux paramètres sont liés : si le potentiel diminue, la respiration diminue aussi. C est pourquoi on ajoute progressivement du Malonate, inhibiteur du complexe 2 de la chaine respiratoire mitochondriale, pour faire varier le potentiel et analyser la conséquence au niveau de la respiration. Avant de lancer le run, le volume réactionnel est composé de : 8
- 20 μl de Pi (cf = 10 mm) - 20 μl de Succinate à 0,5 M (cf = 5 mm) - 3 μl Roténone (cf = 3 μm) - 2 μl d oligomycine à 2 mg/ml (cf = 2 μg/ml) - Mitochondries (0,2 mg/ml) - Tampon de respiration (KET) qsp 2 ml - 20 μl BSA 15% - 1 μl nigéricine 10 μm - (+ 1 μl de rhodamine (Fluo)) Le run est lancé et on ajoute successivement du malonate à 0,1 M : - 10 μl = cf malonate 5 mm - 10 μl = cf malonate 10 mm - 20 μl = cf malonate 20 mm - 40 μl = cf malonate 40 mm - 40 μl = cf malonate 60 mm - 40 μl = cf malonate 80 mm - 40 μl = cf malonate 100 mm - 40 μl = cf malonate 120 mm - 3 μl DNP 50 mm (pour cerveau, 10 mm pour muscle) 5) Mesure des ROS Muscle/Cerveau (30 C) Amplex Red La méthode de mesure de la production de H2O2 sur mitochondries isolées est adaptée de celle de Barja G. Kinetic measurement of mitochondrial oxygen radical production. Methods in Aging Research, Edited by Byung Pal Yu, 1999, CRC Press-p533-548 La méthode initiale utilisait l'acide homovanillique (acide 4-hydroxy-3- méthoxyphenylacétique, HVA) qui réagit avec H2O2 en présence de peroxydase du raifort (HRP) pour former un dimère hautement fluorescent (λ excitation: 312 nm, λ émission: 420 Les mesures sont effectuées dans les mêmes conditions que celles 9
utilisées en oxygraphie (30 C), agitation constante et même tampon de respiration (125mM KCl, 20mM Tris, 1mM EGTA). Pour une cuve de spectrophotomètre de 1 ml, on met 0,95 ml de tampon de respiration supplémenté en BSA (300μl de BSA à 15% pour un volume de 30 ml de tampon) et du spectre inorganique (150 μl de 1M Pi pour un volume de 30 de tampon) auquel on ajoute les mitochondries (0,2 mg protéines /ml). On ajoute l Amplex Red (1 μl d une solution à 1mM = 1 μm concentration finale) et la peroxydase du raifort (HRP 1,35 μl d une solution à 4400U/ml soit une concentration finale de 6 U/ml). On enregistre la fluorescence en absence de substrats (autoxydation de la sonde) puis on ajoute les substrats comme pour la respiration. La mesure s effectue à 30 C sur le spectrofluoromètre «Hitachi» Paramètres de mesure : exc. 560 nm em. 584 nm Temps de mesure total initial : 900 sec. ATTENTION : il faut utiliser des cuves «4 faces» de 2ml (ou de 4 ml mais il conviendra alors de doubler les volumes indiqués) - Dans 1 ml de tampon de respiration «KET» - ph 7,2 - En présence de 10 μl de BSA à 10% (0,1% finale) - D Amplex Red 1 μm (1 μl de solution 1 mm) - Et de HRP 1 μl (soit environ 5 U/ml) - Mitochondries avec BSA 10% v/v La mesure commence et après 2 min. de stabilisation le substrat est ajouté. Chaque situation doit être mesurée pendant 2 min. 1) Mesure de la production d H2O2 en présence de Succinate : Mitochondrie : 0,25 mg/ml - 5 mm de Succinate (5 μl de solution 1 M) - 1 μm de Roténone (2 μl de solution 0,5 mm) - 0,5 μm d Antimycine A (1 μl de solution 0,5 mm) 10
2) Mesure de la production d H2O2 en présence de G/M Mitochondrie : 0,25 mg/ml - 5/2,5 mm de G/M (5 μl de solution 1/0,5 M) - 1 μm de Roténone (2 μl de solution 0,5 mm) - 0,5 μm d Antimycine A (1 μl de solution 0,5 mm) V. Résultats 12 10 Courbe de Nicholls cerveau 8 6 4 2 Ctrl CIT 0 0 50 100 150 200 70 60 50 40 30 20 10 0 Respiration complexe 2 cerveau GM ADP Oligo Ctrl n=7 CIT n=7 Ctrl CIT 11
Production (pmol/min/mg) 5 RCR cerveau complexe 2 4 3 2 Ctrl CIT 1 0 RCR ROS complexe 2 cerveau Ctrl n=7 CIT n=8 500 400 300 200 100 0 Ctrl CIT succ succ + rot succ + rot + AA VI. Points positifs et négatifs du stage Le stage d excellence est un dispositif que je pense mérite d être conservé. Il permet aux étudiants de licence de découvrir la vie du laboratoire et ainsi d avoir une meilleure idée de ce domaine qui peut parfois paraître flou. Le fait de découvrir ceci très tôt dans le cursus permet aussi d éviter des erreurs d orientation. De plus, il m a été très utile vis-à-vis des stages futurs que j aurai à faire. Bien qu il ne soit pas aussi long, il m a tout de même permis de voir le déroulement de la démarche expérimentale. 12
Concernant les points négatifs, il n y a qu un seul reproche que je peux faire à propos de ce stage. Il me semble qu on nous montre qu une partie de la vie d un chercheur, en effet on ne découvre que le côté pratique et non pas le côté théorique, c est-à-dire la mise en place d idées de projet par exemple. Je pense qu il est donc important de trouver un stage qui implique ces deux aspects mais je conçois que ceci peut être difficile, la durée du stage étant limitée à un ou deux mois. 13
Conclusion Les courbes de Nicholls montrent une différence de respiration mitochondrial entre les rats complémentés en citrulline et ceux non complémentés. Par contre on ne voit pas de différence significative au niveau des mesures de potentiel de membrane ni sur les mesures de ROS pour les rats avec et sans citrulline. A priori, la citrulline pourrait avoir un effet sur le complexe 2. Le manque de différences significatives sur certaines courbes est peut-être dû à des concentrations différentes en mitochondrie car le dosage que l'on fait est un dosage protéique et non mitochondrial donc ça nous donne une idée du nombre de mitochondrie mais ce n est pas une mesure précise. C'est pourquoi il faudra mesurer l'activité citrate synthèse qui est le reflet de la densité mitochondriale. Avec ça on pourra ainsi normaliser tous nos résultats pour avoir une idée plus exacte. 14
Annexe : Substrats, inhibiteurs et découplants Malonate : Inhibiteur du complexe 2 de la chaine respiratoire mitochondriale Antimycine : Inhibiteur du complexe 3 de la chaine respiratoire mitochondriale CCCP : Découplant de la phosphorylation oxydative DNP : Découplant de la phosphorylation oxydative Oligomycine : Inhibiteur de l ATP synthase Succinate : Substrat du complexe 2 de la chaine respiratoire mitochondriale Roténone : Inhibiteur du complexe 1 de la chaine respiratoire mitochondriale Rodamine : Fluorochrome 15