Web 5 Fiche 5.1 MUTANTS DES GÈNES DE DIVISION : LEUR UTILISATION DANS LA CONSTRUCTION DU SEPTOSOME L. Paolozzi Les premiers mutants de division ont été isolés chez E. coli dans différents laboratoires dans les années 1964 à 1973. Il s agissait de mutants conditionnels de type thermosensible, c est-à-dire poussant à la température permissive de 30 C et létaux à 40-42 C. Ces mutants (encore précieux) ont été au centre des premières dissections du processus de division. En effet, l observation au microscope de ces bactéries mutantes exposées à la température non permissive a fourni les toutes premières indications sur l identification et le rôle des gènes de division : gènes à activité précoce (intervenant dans la formation du septum), gènes impliqués dans la croissance de cette structure ; et gènes «tardifs». D autres mutants ont permis d identifier les gènes contrôlant la localisation et la chronologie de la formation du septum, d autres encore ceux responsables de la ségrégation des nucléoïdes, et encore d'autres activités liées à la division. Beaucoup de ces mutants sont caractérisés par la formation de longs filaments à température non permissive, d où le nom de fts donné aux gènes correspondant (fig. F5.1-1). Avec le développement des technologies du génie génétique, il est devenu possible d effectuer des constructions génétiques qui permettent de bloquer transitoirement dans une cellule l activité d un gène donné. De telles constructions ont été réalisées aussi pour les gènes de division chez E. coli et quelques autres Bactéries modèles. Le principe de ces constructions est le suivant. Le gène étudié, ici un gène essentiel puisqu intervenant dans la division, est mutagénisé (sous forme de mutants thermosensibles, ts, ou de mutants insertionnels, avec un transposon). La fonction du gène muté est suppléée dans la cellule grâce à un allèle sauvage du gène positionné sous le contrôle d un promoteur (plac ou para) inductible par ajout, 1
respectivement, de lactose ou d arabinose. Cette bactérie croît normalement, par complémentation, tant que le gène sauvage est induit, mais cesse de croître et meurt en absence d induction. Ce genre de constructions permet d'étudier l effet d'un blocage transitoire de l expression d un gène donné. Formellement, des observations analogues peuvent être faites avec des mutants thermosensibles au cours des transitions thermiques 30 C 42 C 30 C. L avantage des systèmes agissant sur l expression d un gène par rapport à ceux basés sur l inactivation par dénaturation protéique, est d effectuer des transitions plus rapides et plus nettes entre les deux états (expression vers non-expression d un gène, et éventuellement retour à la condition normale par ré-induction du gène). De telles souches mutantes, associées à l utilisation du marquage de protéines avec un fluorochrome, en général la GFP (Web 5 Fiche 5.2), ont permis d aborder la question complexe de la chronologie des événements associés à la formation du septum. Ainsi, il a été possible d'analyser, par mutation de la douzaine de gènes essentiels impliqués dans la formation du septum, la séquence temporelle de migration au site de division de chacune des protéines Fts. Figure F5.1-1 - Phénotype d un mutant thermosensible du gène ftsi d E. coli à températures permissive (30 C) et non permissive (42 C). Différentes études réalisées avec des mutants du gène ftsz ont conduit à la conclusion que le produit de ce gène est le premier à agir dans la formation du septum. En effet, en son absence aucune autre protéine de division ne se localise au site de division. Il y a donc dépendance de la localisation de toute autre protéine vis-à-vis de la localisation de FtsZ. À partir de cette base, la question de la séquence temporelle de localisation des autres protéines, après celle de FtsZ, a pu être abordée. La méthodologie consiste à observer, chez une série de souches isogéniques, c està-dire ayant toutes le même génotype sauf pour le marqueur étudié, les effets du blocage de 2
l expression de ce marqueur sur la localisation des autres protéines de division : par exemple, le blocage de l expression du gène ftsa sur la localisation des protéines FtsK, FtsI, FtsN, etc., visualisées par leur marquage fluorescent. Puis le même protocole est appliqué à une autre série de souches bloquées pour l expression d un autre gène de division. Ces expériences sont à la base de nos connaissances sur la temporalité de la localisation des protéines de division décrite dans le Chapitre 5. 3
Web 5 Fiche 5.2 MÉTHODES D ÉTUDE POUR LA LOCALISATION DES PROTÉINES DE DIVISION L. Paolozzi La détection et la localisation des protéines sont de grande importance pour comprendre leur rôle et leur mode de fonctionnement, particulièrement quand elles agissent au sein de complexes multiprotéiques. Deux techniques précieuses, développées dans ce but pour l étude des cellules eucaryotes et appliquées ensuite aux procaryotes, sont l immuno-microscopie électronique et l examen en microscopie à fluorescence de protéines marquées avec un fluorochrome. Chez les procaryotes, ces technologies trouvent de nombreux domaines d'emplois, depuis la détection et le dénombrement de cellules dans l environnement (aliments compris) jusqu à l étude des fonctions des protéines, pour laquelle elles permettent d analyser et de disséquer des processus complexes tels que la réplication, la division, la différenciation. L'immuno-microscopie électronique a été appliquée pour la première fois chez E. coli pour étudier la localisation de la protéine FtsZ (Chap. 5). La technique consistait en un immunomarquage utilisant des billes d or couplées à des anticorps. Il fut ainsi possible d observer la formation de la structure annulaire de l anneau Z dans la région centrale de la cellule. Quelques années plus tard (1996), X. Ma et W. Margolin mirent au point chez E. coli une technique permettant de détecter la localisation de protéines de division en microscopie à fluorescence. Cette technique consistait à faire exprimer aux cellules des protéines recombinantes dont l extrémité C-terminale était fusionnée à un fluorochrome (par exemple la protéine GFP, Encart F5.2-1). Les résultats observés avec cette technique ont confirmé ceux obtenus par immuno-microscopie électronique quant à la localisation de FtsZ, ouvrant le chemin à l étude de la localisation des autres protéines de division, ceci sans recourir à la production d anticorps spécifiques. Par exemple la localisation de la protéine de division FtsN, sous forme de fusion FtsN-GFP, a été suivie chez E. coli (fig. F5.2-1). 4
Figure F5.2-1. Localisation de la protéine FtsN au site de division chez E. coli. Visualisation en microscopie à fluorescence par fusion à GFP (Grenga et al., 2013). Encart F5.2-1 - La microscopie à fluorescence et les sondes fluorescentes La microscopie à fluorescence permet d observer un échantillon marqué de façon spécifique avec une sonde fluorescente, ou fluorochrome. Cette technique utilise une source de lumière plus puissante que celle du microscope optique, et des filtres qui permettent de choisir une gamme de longueur d onde permettant d'exciter spécifiquement le fluorochrome. La lumière alors émise par l échantillon excité est filtrée à la longueur d onde d émission du fluorochrome. Le signal détecté renseigne donc de façon spécifique sur la molécule ou le complexe fluorescent, et permet d en observer la localisation dans la cellule. Les fluorochromes, ou fluorophores, sont des substances composées de plusieurs noyaux aromatiques conjugués ou de molécules planes et cycliques. Ces substances ont la propriété d émettre de la lumière à une longueur d onde définie lorsqu'elles sont excitées à leur longueur d'onde d'absorption (lumière d excitation). Puis elles retournent à leur état fondamental très rapidement en émettant de la lumière à une longueur d onde supérieure à celle d excitation (lumière d émission). Parmi les fluorochromes les plus utilisés dans les études de biologie cellulaire, citons la protéine fluorescente «verte» GFP (Green Fluorescent Protein) extraite de la méduse Aequorea victoria (le mot «verte» désigne la lumière verte intense émise). Il existe un certain nombre de mutants du gène exprimant la GFP, conduisant à la synthèse de fluorochromes ayant de nouvelles caractéristiques d absorption et d émission de lumière. Ce sont YFP (Yellow Fluorecent Protein) qui émet une lumière jaune, CFP (Cyan Fluorescent Protein), qui émet dans le bleu-gris, et BFP (Blue Fluorescent Protein), qui émet dans le bleu. De nombreux mutants ont aussi été produits pour modifier la sensibilité au ph de ces protéines et l intensité d émission de la lumière. 5
L utilisation des fluorochromes en biologie moléculaire a en partie remplacé les techniques basées sur l utilisation d'isotopes radioactifs. Leurs avantages sont la facilité de manipulation par rapport aux éléments radioactifs, et la plus grande rapidité d'obtention des résultats ; cependant un inconvénient est que l intensité de la fluorescence diminue rapidement avec le temps, jusqu'à devenir indétectable. Bibliographie Grenga L., Rizzo A., Paolozzi L., Ghelardini P. (2013). Essential and Non-Essential Interactions in Interactome Networks: the Escherichia coli Division Proteins FtsQ-FtsN Interaction. Environ. Microbiol. 15(12): 3210-7 Ma X., Ehrhardt D.W., Margolin W. (1996). Colocalization of Cell Division Proteins FtsZ and FtsA to Cytoskeletal Structures in Living Escherichia coli Cells by using Green Fluorescent Protein. Proc Natl. Acad. Sci. USA. 93(23): 12998-3003 6
Web 5 Fiche 5.3 SYNTHÈSE DU SEPTUM : RÔLE DE LA PROTÉINE MREB L. Paolozzi La croissance et la division d'une cellule doivent être minutieusement coordonnées dans le temps et dans l espace. Malgré les nombreuses études réalisées pour découvrir le mécanisme de cette coordination, seulement quelques éléments explicatifs commencent à émerger. Chez E. coli, deux protéines sont au centre de ce processus : MreB est impliquée dans la croissance longitudinale de la paroi cellulaire, et FtsZ est à la base de la formation du septum de division (Chap. 5). LES MULTIPLES RÔLES DE LA PROTÉINE MREB MreB a été découverte en 1987 par M. Wachi et collaborateurs, comme le produit d un gène requis dans la morphogenèse d E. coli. Les mutants de ce gène conduisaient à la perte de la forme cylindrique de la cellule. Cette observation fut la première preuve de l existence d une fonction impliquée dans le déterminisme de la morphologie chez un procaryote. Peu d années après furent identifiées d autres protéines de morphogenèse chez E. coli, la protéine membranaire bitopique MreC, la protéine membranaire intégrale MreD, PBP2 (Penicillin Binding Protein 2), et la protéine membranaire intégrale RodA. L absence de l un ou de l autre de ces constituants conduit à la formation de cellules sphériques, qui lysent souvent dans les conditions normalement utilisées pour cultiver la bactérie non mutée. Chez E. coli, Bacillus subtilis et Caulobacter crescentus, le gène codant pour MreB fait partie d'un opéron, mrebcd. Les trois protéines codées par cet opéron font partie d un réseau où chacune d elles interagit non seulement avec les autres protéines Mer mais aussi avec d autres composants. MreC interagit avec MreB et MreD ainsi qu'avec les protéines PBP, dont PBP2. MreD jouerait, chez E. coli au moins, le rôle d échafaudage permettant de recruter les synthétases impliquées dans la construction de la paroi. C'est principalement l'activité de MreB qui est connue. C'est une protéine très conservée chez toutes les espèces où elle a été étudiée. Chez E. coli, son poids moléculaire déduit de la 7
séquence nucléotidique est de 36 952 Da, confirmé par des données expérimentales. MreB interagit avec de nombreuses autres protéines, MreC et MreD, mais aussi celles impliquées dans la synthèse du peptidoglycane, RodA, MurG, MraY et plusieurs autres PBP. Il est généralement admis que MreB est l équivalent procaryote de l actine des eucaryotes. La molécule possède la même séquence signature des protéines de la famille de l actine ; la structure du monomère ressemble à celle de l actine ; elle forme des filaments du cytosquelette qui se localisent en structures hélicoïdales, inégales, sur le côté interne de la membrane cellulaire. MreB serait donc bien un élément du cytosquelette impliqué dans la morphologie des procaryotes. MREB ET LA DIVISION De nombreuses données convergent pour assigner à MreB, en plus de son rôle dans la croissance du peptidoglycane, celui de coordonner la synthèse du septum de division. Cette hypothèse dérive, parmi de nombreuses données, d observations qui montrent une interaction entre MreB et FtsZ. La preuve plus directe est l observation chez C. crescentus, par immunomicroscopie à fluorescence (IFM), de structures annulaires formées d assemblages de MreB localisées dans la région centrale de la cellule, c'est-à-dire au niveau de la région de l'anneau Z. Une localisation similaire, sous forme de bandes ou d anneaux souvent placés dans la région centrale de cellules d E. coli en pré-division, a aussi été rapportée, bien que cette observation exige une confirmation par d autres méthodes d investigation. D'après A.K. Fenton et K. Gerdes (2013), chez E. coli l interaction directe entre MreB et FtsZ serait nécessaire pour la contraction de l anneau Z. La perte de cette interaction par mutation de MreB bloque la division cellulaire tout en permettant l'élongation de la cellule. Chez ce mutant de MreB l inhibition de la division est corrélée à l absence de recrutement des protéines PBP 1B et 2 au niveau de l anneau Z. Une mutation compensatrice par remplacement d un seul amino-acide chez FtsZ, qui restaure l interaction, supprime l effet de la mutation de MreB. Selon les auteurs, l interaction entre FtsZ et MreB permettrait de transférer au niveau du septum en formation, les enzymes qui opèrent dans la synthèse longitudinale de la paroi, pour leur faire synthétiser la cloison de division. Ces données indiqueraient que le couplage entre division et élongation, chez E. coli, impliquerait une interaction directe entre FtsZ et MreB (fig. F5.3-1). MreB présente à l extrémité N-terminale une hélice bipolaire qui l ancre directement au feuillet interne de la membrane cytoplasmique. Le couplage division-élongation soulève une autre question : comment la protéine MreB peut-elle diriger la synthèse du peptidoglycane au niveau du périplasme? Une protéine récemment découverte, RodZ, pourrait être la réponse. RodZ est une protéine membranaire bitopique, conservée, qui intervient dans la morphogenèse. Son extrémité C-terminale est localisée dans le périplasme. Fait intéressant, RodZ se co-localise avec MreB, de façon indépendante des protéines MreC, MreD, PBP2 et RodA. Des données biochimiques sont en faveur d une interaction entre MreB et RodZ. 8
Figure F5.3-1. Modèle du réseau d'interactions entre les protéines de l'élongation et des facteurs de division cellulaire chez E. coli (d après A.K. Fenton et K. Gerdes, 2013). Des polymères de FtsZ s assemblent dans la région centrale de la cellule pour former l'anneau Z (1). L'interaction directe entre MreB et FtsZ (2) permet le transfert dans le divisome mature (flèche en pointillés) des protéines PBP1B et PBP2 (3). Toutes les enzymes nécessaires à la synthèse de PG septal seraient ainsi groupées. Bibliographie Doi M., Wachi M., Ishino F., Tomioka S., Ito M., Sakagami Y., Suzuki A., Matsuhashi M. 1988. Determination of the DNA Sequence of the MreB Gene and the Gene Products of the mre Region that functions in Formation of the Rod Shape of E. coli cells. J Bacteriol. 170(10):4619-24. Fenton A.K. & Gerdes K. 2013. Direct Interaction of FtsZ and MreB is required for Septum Synthesis and Cell Division in Escherichia coli. EMBO J. 32(13). 1953-65 Ozyamak E., Kollman J.M., Komeili A. 2013. Bacterial Actins and their Diversity. Biochemistry 52(40):6928-39 Szwedziak P. & Löwe J. 2013 Do the Divisome and Elongasome share a Common Evolutionary Past? Curr Opin Microbiol 16(6): 7451-5 Wachi M., Doi M., Tamaki S., Park W., Nakajima-Iijima S., Matsuhashi M. 1987. Mutant Isolation and Molecular Cloning of mre Genes, which determine Cell Shape, Sensitivity to Mecillinam, and Amount of Penicillin-binding Proteins in Escherichia coli. J. Bacteriol. 169 :4935-4940 9
Web 5 Fiche 5.4 CONTRÔLE DU CYCLE CELLULAIRE : LE MODÈLE D'HELMSTETTER ET COOPER L. Paolozzi Cherchant à comprendre les bases de la coordination entre réplication du chromosome et division cellulaire, C.E. Helmstetter et S. Cooper ont proposé (1968) un modèle formel définissant les fondements théoriques régissant ces processus (fig. F5.4-1). Ce modèle se base sur des données expérimentales (croissance d'e. coli dans des conditions définies : 37 C, en milieu soit synthétique soit complexe) qui définissent le temps nécessaire pour un cycle de réplication du chromosome (période C), le délai entre l'achèvement de la réplication et la division (période D), et le délai entre deux divisions (I). Les paramètres C et D, dans ces conditions, sont à peu près constants. Le modèle énonce aussi que dans une cellule un chromosome peut initier un nouveau cycle de réplication avant même que le cycle en cours ne soit terminé. Il est important de considérer qu à l époque de la formulation de ce modèle on était bien loin de connaître toute la complexité de la régulation de l initiation de la réplication du chromosome bactérien. Cependant, encore aujourd'hui ce modèle permet d avoir une représentation simple et didactique du processus. Dans le cas plus simple (I = C + D), les divisions se produisent avec un intervalle de temps T (ici 60 min) identique à la somme du temps nécessaire pour effectuer un cycle de réplication complet, depuis l initiation jusqu à la terminaison (ici 40 min) plus le temps nécessaire à la ségrégation des deux cellules filles (ici 20 min). Autrement dit I, la somme de C + D, est égal à T. Dans ces conditions, au terme de la division, chaque cellule reçoit à sa naissance une copie complète du chromosome, qui initie une nouvelle réplication (temps 0) et la termine après 40 min. Dans ce système, il y a donc un seul cycle de réplication par cycle de division. Les cellules n ont, au cours d'un cycle, que deux copies de la région origine (oric) et une seule copie du terminus (ter) du chromosome. Il s agit d un rythme de division qui ressemble à celui 10
des cellules eucaryotes, chez lesquelles il y a un délai entre la fin de la réplication de l ADN (période C) et la de la division cellulaire (période D). Figure F5.4-1. Modèle d Helmstetter et Cooper. Au cours d'une croissance très lente (I > C + D) (dans le cas de la figure T = 80 min), par exemple en présence d'un substrat énergétique difficilement utilisable par les cellules, la phase de réplication, C, et la phase post-réplicative nécessaire à la ségrégation, D, peuvent se dérouler durant le cycle de division, comme précédemment, et il reste un intervalle de temps entre la complétion de ces phases (C + D) et la division suivante. Cette période, nécessaire à la cellule pour équilibrer son métabolisme dans ces conditions de limitation en nutriments, est inerte quant au processus de division. Inversement, dans le cas de mise en présence d'un milieu enrichi (I < C + D), donc de croissance rapide (T inférieur à 40 min), la complétion d'un cycle de réplication, C, suivie de la période D, ne peut se faire entre deux divisions. L'apparition prématurée de deux nouvelles cellules filles nécessite que chaque chromosome ré-initie un nouveau cycle de réplication avant que le premier tour ne soit terminé. Dans le cas de figure représenté (T = 40 min), on peut observer qu au moment de sa naissance, chaque cellule reçoit de sa mère une copie de chromosome dans laquelle une nouvelle initiation a déjà eu lieu. La réplication de ce chromosome (déjà à mi-parcours) sera complétée 20 min plus tard. La réplication procède sur plusieurs fourches simultanément sur le même chromosome, ce qui permet d'assurer que l'équivalent d'un tour de réplication (dans le cas choisi de T = 40 min) est complété avant la cytokinèse suivante, afin que chaque cellule fille puisse hériter d'au moins un génome complet. 11
Dans ces conditions les cellules peuvent avoir quatre ou plus copies de la région proche d'oric mais une seule copie de la région ter. Il est important de signaler que ce système de coordination entre l initiation de la réplication et la division cellulaire, attesté chez E. coli et d autres bactéries, n est pas universel. Il ne s'applique que dans le cas de division végétative simple. D autres bactéries, telles Caulobacter (Chap. 15), présentent des cycles plus complexes, incluant des processus de différenciation, pour lesquels la définition, et/ou la coordination, des paramètres C et D, ne peut s'appliquer. Bibliographie Helmstetter C.E. & Cooper S. 1968. Chromosome Replication and the Division Cycle of Escherichia coli B/r. J. Mol. Biol. 31(3):519-40 Wang J.D. &t Levin P.A. 2009. Metabolism, Cell Growth and the Bacterial Cell Cycle. Nat. Rev. Microbiol. 7(11) : 822-7 12