Plateforme d Analyse et de Caractérisation P.A.C. Balard

Plateforme d Analyse et de Caractérisation P.A.C. Balard Fédération de Recherche Chimie Balard - FR3105 http://www.fed-chimiebalard.cnrs.fr Dr. Jean-Claude JUMAS jean-claude.jumas@univ-montp2.fr Tél. : 04 67 14 33 09 CONTACT Pr. Christine ENJALBAL enjalbal@univ-montp2.fr Tél. : 04 67 14 38 19

Plateforme d Analyse et de Caractérisation P.A.C. Balard Ouverture aux secteurs publics et privés Mutualisation des équipements mi-lourds Organisation par nacelles technologiques autour d un centre de compétences sous la responsabilité de scientifiques spécialistes du domaine et d une assistance par personnel technique dédié Instrumentation performante pour une recherche de qualité Prestations de service haut de gamme

Plateforme d Analyse et de Caractérisation P.A.C. Balard Fédération de Recherche Chimie Balard - FR3105 http://www.fed-chimiebalard.cnrs.fr Plateau Technique ICGM-IEM Service Commun UM2 RXγ P.A.C. Balard Laboratoire de Mesures Physiques (LMP) Service Commun UM2 Plateau Technique IBMM Christine Enjalbal Université Montpellier 2, Institut des Biomolécules Max Mousseron (UMR 5247) CC 1703, Place Eugène Bataillon, 34095 Montpellier Cedex 5 enjalbal@univ-montp2.fr

2 3 4 5 6 1 12 12 nacelles à votre service 12 11 7 10 8 9 1- Diffraction X/Diffusion X/Fluo. X 2- IR/Raman 3- RMN 4- Mössbauer 5- XPS 6- Magnétisme/RPE 7- MEB/AFM 8- Analyses texturales 9- Analyses thermiques 10- PAC Analyses BALARD - DLV élémentaires/mesures 19-01-2011 chiroptiques 4 11- Spectrométrie de masse 12- Nanoséparation et analyses

Plateforme d Analyse et de Caractérisation P.A.C. Balard Les Rencontres 2012 "A quoi sert la spectrométrie de masse" Un des services de la Plateforme d Analyse et Caractérisation: Nacelles 11 et 12 Laboratoire de Mesures Physiques / Institut des Biomolécules Max Mousseron Localisation: Université Montpellier 2, Bâtiment 17, Rez-de-chaussée http://www.univ-montp2.fr www.ibmm.univ-montp1.fr

Nacelle 11 Spectrométrie de masse Appareillages ESI-QToF Maldi-Tof-Tof ESI-QqQ EI/CI-Q Mode d ionisation : Maldi, ESI, APCI, CI, EI(+/-) Analyse MS/MS Analyse Haute résolution gilles.valette@univ-montp2.fr Guillaume.cazals@univ-montp2.fr

Nacelle 12 Séparation et analyses Chromatographie gazeuse Appareillage : GC / MS Chromatographie liquide Appareillages : HPLC UPLC Double détection UV/MS Couplage HPLC-QToF Couplage UPLC-QqQ gilles.valette@univ-montp2.fr Guillaume.cazals@univ-montp2.fr

Plateforme d Analyse et de Caractérisation P.A.C. Balard Conditions d accès au service de SPECTROMETRIE DE MASSE - Accès aux prestations du service sur simple rendez-vous enjalbal@univ-montp2.fr 0467143819 Gilles.valette@univ-montp2.fr 0467143836 Guillaume.cazals@univ-montp2.fr 0467143804 - Tarifs des prestations HT selon techniques analytiques requises Tarification Académique (UM2/Pôle Chimie Balard/autres) Tarification Industrielle - Contrats de prestations: Service Recherche Devis selon le type d étude et le nombre d échantillons

A quoi sert la spectrométrie de masse? Technologies disponibles Gilles Valette Gilles.valette@univ-montp2.fr Tél: 04-67-14-38-36

Définition: spectrométrie de masse C est une balance moléculaire: elle mesure des rapports masse-sur charges (m/z) de molécules ionisées à l état gazeux et de leurs produits de fragmentations.

Historique rapide 1912: Premiers spectres de masses de gaz (N 2, O 2, CO, ) par THOMPSON. 1918: construction par DEMPSTER du 1er SM à secteur magnétique (commercialisé qu en 1942). 1922: Première source à Impact électronique par DEMPSTER 1948: Analyseur par mesure du temps de vol (tof) 1953: Analyseur quadripolaire 1957: Couplage de la SM avec la GC 1967: Ionisation chimique 1981: Source à bombardement d atomes rapides (FAB) 1984: Commercialisation de l analyseur trappe ionique 1985: Source désorption laser assistée par matrice (MALDI) 1988: Source electrospray (ESI) 2001: Imagerie par SM

Quelles informations peut on tirer d un spectromètre de masse? 1) La masse moléculaire grâce à la valeur du rapport m/z du pic moléculaire. 2) Informations sur la structure grâce aux pics de fragmentation. 3) Information sur la composition élémentaire grâce à la précision de mesure Nombre d ions m/z

La présence d isotopes A cause de l existence d isotopes, on observe, non pas un pic moléculaire, mais un groupe de pics moléculaires Massif isotopique du Cl Massif isotopique du C Massif isotopique de C 100

Quelle masse mesure-t-on? Masse monoisotopique: C est la masse du pic du profil isotopique qui ne prend en compte que les masses des isotopes les plus stables Pic monoisotopique ( 12 C, 1 H, 16 O, 32 S, 14 N, 35 Cl, ). P+1 P+2 P+3 Pic P P+4 P+5 m/z

Quelle masse mesure-t-on? Masse chimique ou moyenne: C est le barycentre (centroïde) des masses des pics constituant le profil isotopique, c est-à-dire la masse qui prend en compte la masse des éléments donnée par le tableau (C=12,011). périodique Masse moyenne

L unité de mesure La masse M s exprime en Dalton (Da) ou l unité de masse atomique unifiée (u). Ces 2 unités sont parfaitement identiques. Da = 1/12 de la masse d un atome de 12 C soit 1,66.10-27 kg.

Schéma général d un MS Source Analyseur Détecteur Enregistreur Création des ions Tri des ions en phase gaz: détermination du rapport m/z Comptage des ions Traitement informatique - Visualisation du spectre Les performances d un spectromètre de masse dépendent du mode d ionisation, de la nature de l analyseur, et du détecteur.

Schéma général d un MS Source Analyseur Détecteur Enregistreur Création des ions Tri des ions en phase gaz: détermination du rapport m/z Comptage des ions Traitement informatique - Visualisation du spectre Les performances d un spectromètre de masse dépendent du mode d ionisation, de la nature de l analyseur, et du détecteur.

A quoi sert la spectrométrie de masse? Les sources d ionisation

Rôle de la source Volatiliser : la source doit permettre le passage de l état de matière condensée à un état gazeux. Ioniser : Transformer les molécules en ions, produire des espèces chargées car un spectromètre de masse (analyseur) fonctionne grâce à des champs électriques.

Exemples de sources d ionisation les plus courantes La source à Impact Electronique (EI) La source par Ionisation Chimique (CI) L ionisation par thermospray (TSP) L ionisation par bombardement d ions ou atomes rapides (LSIMS, FAB) La désorption par plasma (PD) La désorption par laser (LD) L ionisation chimique à pression atmosphérique (API ou APCI) L ionisation laser assistée par matrice (MALDI) Electronébulisation (electrospray: ES ou ESI)

L impact électronique (EI) Faisceau d électron à 70eV Echantillon Enceinte sous vide Principe général: e - (70eV) + M 2e - + M + M + est un ion: radical-cation M + B + + R Perte d un radical D + + N Perte d une molécule neutre et réarrangement B + C + + N D + E + +R F + + N

L ionisation en EI est une ionisation forte mettant en jeu beaucoup d énergie et entraînant de nombreuses fragmentations. La grande reproductibilité de la fragmentation a permis la construction de nombreuses bibliothèques spectrales (librairie NIST). Source particulièrement adaptée à l analyse de composés apolaires de faible poids moléculaire (<1000 Da). L introduction de l échantillon sous vide permet un couplage facile avec la chromatographie en phase gazeuse (GC/MS) Il est souvent difficile de détecter l ion moléculaire.

Spectre de masse EI du 2-pentatone m/z = 86 m/z = 71 m/z = 58 m/z = 43

L ionisation chimique (CI) Technique basée sur l IE, mais avec une étape intermédiaire. Faisceau d électron à 70eV Echantillon Enceinte remplie de gaz réactant* (CH 4 ) (=10-3 mbar) * : Gaz réactants possibles: H 2, CH 4, C 2 H 4, NH 3, Principe général: CH 4 + e - CH 4+ + 2e - Impact électronique CH + 4 + CH 4 CH 5+ + CH 3 Auto-protonation CH 5+ + M CH 4 + MH + Ion moléculaire à M+1

On observe l ion pseudo-moléculaire: M+1 Il n y a quasiment pas de fragmentation Possibilité de faire du mode négatif (M-H -, M+X - ) Source particulièrement adaptée à l analyse de composés apolaires de faible poids moléculaire (<1000 Da). L introduction de l échantillon sous vide permet un couplage facile avec la chromatographie en phase gazeuse (GC/MS). EI et IC sont des techniques d ionisation complémentaires: EI donne des informations structurales, et l IC confirme la masse moléculaire d un composé. Il n existe pas de bibliothèque de spectre.

M + H + Spectre de masse de la benzophénone obtenu par ionisation chimique. m/z 105 Ion acylium C 13 H 10 CO M = 182,2 g/mol

L Ionisation ElectroSpray (ESI) Pression atmosphérique Vide poussé

- Techniques d ionisation à pression atmosphérique. -Introduction de l échantillon en phase liquide permet un couplage facile avec la chromatographie liquide (LC/MS). -Méthodes d ionisation douces : Peu de fragmentation. L ionisation par electrospray conduit ainsi à un spectre assez simple, avec la présence d ion moléculaire : [M+H] + ou [M-H] -. -Elle est utilisée pour l étude de biomoléculescomme des peptides, proteines, sucres, carbohydrates, -Accès à l analyse de macromolécules par la formation d ions multichargées [M+xH] x+ même si l analyseur est limitéen masse. -Les solvants protiques utilisés doivent être volatils(meoh, ACN, H 2 O). -A proscrire: DMSO, DMF,...

Exemple d un spectre obtenu en ESI d une petite molécule. 100 284 2.55e3 Molécule organique % MW = 283 g/mol [M+H] + observé = 284 Da 285 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z

Exemple de spectre obtenu en ESI d ions multichargés [M+2H] 2+ Peptide MW = 1667,8 g/mol Masses Observées : 1667,8 Da = [M+H] + 834,9 Da = [M+2H] 2+ 556,9 Da = [M+3H] 3+ M = (1667,8 + 1) / 1= 1668,8 Da M = (1667,8 + 2) / 2 = 834,9 Da M = (1667,8 + 3) / 3 = 556,9 Da [M+3H] 3+ [M+H] +

Exemple de spectre obtenu en ESI de molécule de masse élevée. 100 1925 9.27 Comment déterminer la masse molaire de cette macromolécule? % 1137 1931 1934 2247 1112 1137 1364 1330 1143 1434 1663 1684 1692 1939 1975 2217 0 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 2256 2263 2282 m/z

Exemple de spectre obtenu en ESI de molécule de masse élévée. 100 Etat de charge: x+1 1925 Masse de la molécule à déterminer: M 9.27 Méthode de déconvolution 2247 = (M-xH) / x 1925 = (M-(x+1)H) / (x+1) % 1137 1931 1934 2247 Etat de charge: x 1112 1137 1364 1330 1143 1434 1663 1684 1692 1939 1975 2217 0 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 2256 2263 2282 m/z

Exemple de spectre obtenu en ESI de molécule de masse élévée. 100 Etat de charge: x+1 1925 9.27 Méthode de déconvolution 2247 = (M-xH) / x 1925 = (M-(x+1)H) / (x+1) % X = 6 M = 13482 Da 1137 1931 1934 2247 Etat de charge: x 1112 1137 1364 1330 1143 1434 1663 1684 1692 1939 1975 2217 0 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 2256 2263 2282 m/z

L ionisation MALDI Mélange matrice-échantillon Source laser + + Plaque MALDI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Ions moléculaire Vers l analyseur Désorption Ionisation E

Paramètres influençant l ionisation: Les spectres MALDI sont très dépendants de la matrice utilisée. Un composé pourra très bien être détecté avec une matrice donnée, et pas avec une autre. Le type de dépôt sur la plaque: goutte séchée, couche mince, sandwich. Le choix des solvants utilisés pour préparer le dépôt (compatibilité du solvant de la matrice avec celui du produit à étudier). La présence de sel. Il faut utiliser de l eau désionisée, ou alors ajouter un agent de cationisation comme Na +, K +, Ag +,

Le choix de la matrice Petit composé organique, photosensible (cycle aromatique). Compatible avec le solvant utilisé pour solubiliser le composé à étudier. Bonne absorbance à la longueur d onde du laser. Capable de transférer une ou plusieurs charges à l analyte. Cristalisation aisée. Faible volatilité (10-7 mbar).

Exemple de matrices OH O OH HO CN α-cyano-4-hydroxycinnamic Acid (HCCA) H 3 CO OH O O HO OH 2,5-DiHydroBenzoic acid (DHB) HO OCH 3 Sinapinic Acid (SA) 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-one (Dithranol) HCCA SA DHB Ditranol peptides, petites protéines, glycoprotéines protéines, glycoprotéines, polymères polaires peptides, peptides glycosylés, polymères polaires, glycanes polymères.

L ionisation MALDI génère des ions monochargés [M+H] +, [M-H] - L ionisation est douce. Il n y a pas de fragmentation. Le dépôt étant solide, l ionisation MALDI n est pas compatible avec le couplage LC/MS. C est une technique qui est souvent couplée avec un détecteur à temps de vol. C est une technique très utilisée pour l analyse protéomique.

A quoi sert la spectrométrie de masse? Les analyseurs

Caractéristiques d un analyseur: La résolution R. La gamme m/z qu il peut étudier. La rapidité de balayage en m/z. En général, chaque type d analyseur à ses points forts et ses faiblesses.. Plusieurs configurations possibles Analyseur simple (Q, Tof ) En tandem (Triple Quad, Q-Tof )

La résolution (R) Intensité relative H l H/2 H/2 R = m l h/2 m m/z Attention: Ne pas confondre résolution et exactitude de la mesure. R = 2000 R = 5000 R = 20000

L analyseur quadripolaire (Q) Le quadripôle est constitué de quatre électrodes métalliques parallèles raccordées électriquement deux à deux, de section idéalement hyperbolique La stabilité des ions dans le quadripôle dépend des paramètres U et V Un balayage des tensions (U et V) permet l'observation successive de tous les ions

Caractéristiques d un Q Résolution: faible (1000 max) Gamme m/z: limité (0-4000) Vitesse de balayage: 5000 Da/s max Deux modes de détection: fullscan : Balayage d une gamme de masse (par exemple de 50 à 500 Da). On observe la totalité des ions formés dans cette gamme. SIM ou SIR (Single Ion Monitoring ou Recording) : Le quadripôle fonctionne en filtre de masse réglé pour ne laisser passer que les ions d un rapport m/z donné. Méthode plus sélective et plus sensible que le fullscan. C est le mode utilisé pour la quantification.

Avantages: Analyseur simple, peu couteux Peu encombrant Analyse ciblée (SIM / SIR) Inconvénients: Faible résolution Limité en gamme de masse

Analyseur à temps de vol (TOF) L'analyseur à temps de vol consiste à mesurer le temps que met un ion, accéléré préalablement par une tension, à parcourir une distance donnée. Le rapport masse sur charge est directement mesurable à partir du temps de vol (t). m = t 2 x C te z Les ions de masses différentes se déplacent à des vitesses différentes. Il existe deux modes d utilisation de ces analyseurs: le mode linéaire le mode réflectron

Analyseur linéaire Les masses les plus faibles, parcourent le trajet le plus rapidement. Pas de limite de masse Couplage avec le MALDI Grande sensibilité. Résolution moyenne (5000).

Analyseur avec réflectron Ions identiques avec des vitesses initiales égales, mais initialement à deux endroits différents. Ou ions identiques mais avec vitesses et donc des énergies différentes. Phénomène de focalisation. Les ions de même masse arriveront sur le détecteur en même temps Meilleure résolution qu en mode linéaire

Résolution: linéaire 5000, Réflectron 20000. Au-delà de 10 000 Da, linéaire seulement. Gamme de masse illimitée (en théorie). Grande sensibilité, mais moins bonne en mode réflectron.

Spectrométrie de masse en tandem - MSMS Premier analyseur Cellule de collision Second analyseur Sélectionne l ion «parent / précurseur» Fragmentation induite par collision Analyses les ions «fils / fragments» Les différentes configurations disponibles dans la nacelle : Triple Quad (QqQ) Q-Tof Tof-Tof

Triple Quad Cellule de collision Q1 fonctionne comme un filtre et permet de sélectionner l ion parent. Q2 sert de cellule de collision pour fragmenter l ion parent (présence de gaz inerte). Q3 sert d analyseur des ions fils.

Mode MRM (Multiple Reaction Monitoring) Q1 et Q3 fonctionnent comme des filtres: Q1sélection de l ion parent. Q3 sélection de l ion fils. Suivie de transition de manière très spécifique Technique très sensible utilisée pour la quantification.

Q-Tof Quadripôle Cellule de collision Sélection de l ion parent par le quadripôle. Analyse des ions fils dans le temps de vol Très bonne résolution sur la mesure des ions fils grâce au réflectron. Technique dédiée à la stucturale.

Tof-Tof Ions métastables: ions formés dans la source qui ont suffisamment d énergie pour se décomposer, mais des durées de vie suffisamment grandes pour qu ils rentrent dans l analyseur avant de se décomposer. Reflectron: focalise dans le temps et l espace des ions qui ont des énergies relativement proches.

Tof-Tof PCIS: Sélection de l ion parent et des ses ions fils Cellule LIFT: Redonne de l énergie au ions de manière à ce qu ils se séparent en fonction du rapport m/z dans le reste du détecteur. PLMS: supprime l ion parent par déflection Technique utilisée en structurale.

Couplages disponibles Technique séparative GC LC Source CI EI ESI MALDI Analyseur Q QqQ TOF Q-TOF TOF-TOF

Q-Tof TSQ Quantum DSQ II Ultraflex III Source d ionisation ESI APCI ESI EI CI (Méthane) MALDI Analyseur Temps de vol (TOF) (QqTof) Triple Quadripôle (QqQ) Quadripôle (Q) Temps de vol (TOF) (TOF/TOF) Mode d analyse +/- MS-MS Haute résolution +/- MS-MS SRM/MRM EI : + CI : +/- +/- MS-MS Haute résolution Couplage HPLC UPLC GC Applications Solvants compatibles Molécules organiques polaires (ou peu polaires) 50 3000 g/mol Etudes structurales Molécules organiques polaires 50 1000 g/mol Quantification H 2 O, Acétonitrile, MeOH A éviter : DMSO, DMF, solution tampon Petites molécules apolaires, volatiles 30 1000 g/mol Recherche en bibliothèque (NIST) CHCl 3, CH 2 Cl 2, MeOH, Hexane A éviter : DMSO, DMF, H 2 O, AcOEt Molécules de haute masse (peptides, protéines, ADN, polymères.) 500 100 000 g/mol Macromolécules Sequençage peptidique Solvant à éviter : DMSO, DMF, solution tampon

Prix des prestations EI/CI ESI-QqQ ESI-Q-Tof Maldi- Tof/Tof Prestations académiques 4 spectre (Basse Résolution) 4 spectre (Basse Résolution) 4 spectre (Basse Résolution) 12 le spectre MSMS 16 le spectre Haute Résolution (HR-MS) 8 le spectre (Basse Résolution) 12 le spectre MS/MS Prestations industrielles (analyses ponctuelles) 30 le spectre 30 le spectre BR 100 le spectre MS/MS 100 le spectre HR 30 le spectre BR 100 le spetre MS/MS LC/MS 8 l analyse 100 l analyse LC/MS/MS 16 l analyse 150 l analyse GC/MS 8 l analyse 50 l analyse

A quoi sert la spectrométrie de masse? Exemples d application Guillaume Cazals Guillaume.cazals@univ-montp2.fr Tél: 04-67-14-38-04

- Analyse par Q-Tof ESI Temps de vol (TOF) (QqTof) +/- MS-MS Haute résolution HPLC Appareil offrant de multiples possibilités : - Mesure de masse exacte (HRMS) - Fragmentation (MSMS) - Couplage chromatographique (LCMS) Molécules organiques polaires (ou peu polaires) 50 3000 g/mol Etudes structurales Solvant compatible : CHCl 3, CH 2 Cl 2, MeOH, Hexane A éviter : DMSO, DMF, H 2 O, AcOEt

Avantage de la résolution Résolution du Tof = 5000 Information sur le massif isotopique Précision de la mesure de masse Quelques exemples : X-MI12022202 25 (0.474) Sm (Mn, 10x1.00); Cm (24:30) 100 724.02 723.68 TOF MS ES+ 384 y-jv12020701 14 (0.264) Cm (13:15) 100 313.1 56 Fe TOF MS ES+ 1.28e3 0,33 724.36 0,33 % % 724.69 54 Fe 314.1 725.03 725.35 311.1 315.1 0 723 724 725 726 m/z 0 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320 321 322 m/z Ecart entre P et P+1 = 0.33 donc z = 3 Signature isotopique de certains éléments

x-av11121303 18 (0.369) Sm (Mn, 10x1.00); Cm (17:19) 519.1 100 1: TOF MS ES+ 454 % 519.6 520.1 520.6 521.1 Massif isotopique d un composé dichargé contenant du Zinc Isotope du Zinc : 64 Zn, 66 Zn, 67 Zn, 68 Zn, 70 Zn 521.6 522.1 0 522.6 517 518 519 520 521 522 523 524 525 m/z

Mesure de masse exacte Ajout d un standard interne qui va servir à calibrer le temps de vol y-mt05071028 36 (0.384) Cn (Cen,4, 80.00, Ar); Sm (SG, 10x1.00); Cm (35:42) 100 O 228.1016 [M+H] + TOF MS ES+ 495 NH O CH 3 % 196.9616 229.1000 216.0802 197.0454 230.1021 187.0585 196.1430 227.1024 237.9766 200.0714 203.8533 214.1047 217.0784 0 m/z 190 195 200 205 210 215 220 225 230 235 Calcul des formules brutes compatibles avec la masse mesurée : Single Mass Analysis Tolerance = 3.0 mda / DBE: min = -5.0, max = 100.0 Monoisotopic Mass, Even Electron Ions 207 formula(e) evaluated with 2 results within limits (all results (up to 1000) for each mass) Minimum: -5.0 Maximum: 3.0 100.0 Mass Calc. Mass mda PPM DBE Score Formula 228.1016 228.1025-0.9-3.7 8.5 1 C14 H14 N O2 228.1043-2.7-11.9-4.5 2 C2 H18 N3 O9

Fragmentation (MSMS) - Exemple avec la fragmentation de peptides Nomenclature des ions fragments de peptides, schéma général : Ions b - CO Ions a b 4 a 4 H 2 N 1 2 3 4 5 H 2 N R 5 O N H R 4 O H N R 3 O N H R 2 O H N R 1 O OH 2 séries d ions Ions b : partie N-terminale Ions y : partie C-terminale 5 4 3 2 1 OH Ions y y 1 Roepstorff P., Fohlman J. Biomed. Mass Spectrom. 1984; 11: 601 Proteomics, peptide sequencing and the fragmentation mechanisms of small organic ions Journal of mass spectrometry (2000), 35

Fragmentation d un heptapeptide MW = 962,3 g/mol X-GC12022203 11 (0.218) Sm (Mn, 10x1.00); Cm (8:30) 173.1 100 a 2 b 2 b 3 S I I N F E K y 6 y 5 y 4 y 3 y 2 y 1 [M+2H] 2+ = 482.2 Da TOF MSMS 482.00ES+ 1.18e4 b 2 201.1 y 6 763.3 % y 5 650.3 i lysine 129.1 y 1 y 2 260.2 IN 228.1 262.1 b 3 314.2 a 4 -H 2 O 382.2 375.1 y 3 389.2 y 4 [M+2H] 2+ 482.2 536.2 INFE y 5 -H 2 O 504.2 632.3 651.3 764.3 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z

- Fragmentation de petites molécules organiques [M+H] + 332.3 Etude d une benzylamine C 23 H 41 N M monoisotopique = 331,3 g/mol CH 3 N CH 3 240.3 91.1 58.1 CH 2 + + Molecular Formula = C 7 H 7 Monoisotopic Mass = 91.054227 Da H 7 C 3 N + C 13 H 27 H Molecular Formula = C 23 H 42 N Monoisotopic Mass = 332.331177 Da N + C 13 H 27 H 3 C N + H H 3 C H H Molecular Formula = C 16 H 34 N Monoisotopic Mass = 240.268576 Da Molecular Formula = C 3 H 8 N Monoisotopic Mass = 58.065126 Da

Couplage chromatographique (LCMS et LCMSMS) - Possibilité de couplage du Q-Tof à une chaîne HPLC - Etude de milieu complexe : Séparation chromatographique des différents composés d un mélange Spectre de masse de chaque pic chromatographique Fragmentation MSMS des ions observés -Applications : Suivi de synthèse Analyse extrait naturel Analyse milieu biologique - Exemple : analyse d un extrait naturel de jujube

- Objectif : appréhender les différences entre les différents stades de maturation Chromatogramme UV obtenu par LC/MS Q - T O F P 5. 1 F 2 1 5 - D E C - 2 0 1 1 Z - S Z 1 1 1 2 1 5 0 1 2 : D i o d e A r r a y 4. 2 5 1 0 0 T I C 1. 2 3 e 8 6. 8 5 1 0. 3 8 4 3. 4 3 % 4 3. 9 3 5. 5 7 9. 6 7 2 0. 7 8 4 1. 9 5 1 6. 1 0 1 9. 4 7 3 6. 8 7 4 5. 6 2 2 1. 7 2 6. 3 0 2 5. 7 2 3 2. 4 7 3 2. 9 2 3 4. 6 5 3 9. 8 0 2 4. 5 7 2 6. 5 2 2 8. 1 3 2 9. 7 8 3 1. 5 7 4 5. 2 5 4 8. 6 5 1 3. 1 7 0 T i m e 2. 0 0 4. 0 0 6. 0 0 8. 0 0 1 0. 0 0 1 2. 0 0 1 4. 0 0 1 6. 0 0 1 8. 0 0 2 0. 0 0 2 2. 0 0 2 4. 0 0 2 6. 0 0 2 8. 0 0 3 0. 0 0 3 2. 0 0 3 4. 0 0 3 6. 0 0 3 8. 0 0 4 0. 0 0 4 2. 0 0 4 4. 0 0 4 6. 0 0 4 8. 0 0 5 0. 0 0 Spectre de masse du composé à 20,8 min : Molécules attendues de la famille des flavonoïdes. La masse mesurée peut correspondre à la gallocatéchine Q-TOF P5.1 F2 Z-SZ11121501 1064 (20.796) Sm (Mn, 10x1.00); Cm (1049:1069-(842:903+1224:1303)) 307.1 100 % 307.1 [M+H] + 15-DEC-2011 1: TOF MS ES+ 689 Etude par LC/MS/MS 308.1 355.1 406.1 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 m/z

Spectre MS/MS de l ion détecté à 307 Da Q-TOF P5.1 Z-SZ12010307 164 (21.336) Sm (Mn, 10x1.00); Sm (Mn, 10x1.00); Sm (Mn, 10x1.00); Cm (161:165) 100 139.1 5-JAN-2012 3: TOF MSMS 307.00ES+ x24 382 139 OH OH HO A O B C OH % OH OH 181 223 0 151.1 163.1 - H 2 O 181.1 195.1 307.1 223.1 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 - CO [M+H] + m/z

-Identification de la gallocatéchine grâce à son spectre de fragmentation - D autres composés sont identifiés de la même façon : Composés [M+H] + m/z obtenus en MS/MS Gallocatéchine 307 Catéchine 291 Quercétine 303 139, 151, 163, 181, 223, 195 123,139, 147, 165, 179, 207, 273 137, 153, 165, 229, 257, 274, 285 Quercétine hexoside 611 303

- Analyse par GC/MS EI CI (Méthane) DSQ II Quadripôle (Q) EI : + CI : +/- GC Exemples d analyse : - Qualitative : Dérivé de kérosène, extrait de Thym, extrait de jujube : complémentarité avec la LC/MS - Quantitative : dosage de composés allergènes Petites molécules apolaires, volatiles MW : 30 1000 g/mol Recherche en bibliothèque (NIST) Solvant compatible : CHCl 3, CH 2 Cl 2, MeOH, Hexane A éviter : DMSO, DMF, H 2 O, AcOEt

Analyse Qualitative (GCMS) Chromatogramme obtenu lors de l analyse d un dérivé de Kérosène RT: 0.00-36.84 100 95 90 85 4.20 7.65 NL: 1.04E9 TIC MS Z- DJ1105180 3 80 75 70 65 Relative Abundance 60 55 50 45 40 35 2.61 5.09 6.11 30 25 8.85 20 15 14.15 10 5 0 9.38 10.65 12.94 21.40 14.35 18.10 28.40 31.50 19.25 22.40 23.81 26.54 32.33 35.95 0 5 10 15 20 25 30 35 Time (min) Echantillon complexes : centaines de composés Quelles informations en tirer?

Exemple d identification à l aide de la bibliothèque spectrale NIST Temps de rétention 4,2 min 7,65 min Z-DJ11051803 #741 RT: 4.19 AV: 1 SB: 116 3.71-3.87, 4.60-4.78 NL: 2.24E8 T: + c Full ms [30.00-500.00] 57.1 100 95 Z-DJ11051803 #1906 RT: 7.65 AV: 1 SB: 116 3.71-3.87, 4.60-4.78 NL: 2.26E8 T: + c Full ms [30.00-500.00] 57.1 100 95 90 43.1 90 85 85 80 80 Spectre de masse Relative Abundance 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 41.1 71.2 85.2 Relative Abundance 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 43.1 71.1 41.1 85.2 25 20 15 10 5 0 56.1 70.1 84.2 55.1 99.2 39.1 98.2 128.2 69.1 44.1 86.2 65.1 72.2 100.2 129.3 38.1 91.1 113.3 141.3 149.1 168.3 178.3 117.9 191.0 156.3 196.2 40 60 80 100 120 140 160 180 m/z 25 20 15 10 5 0 56.1 70.2 55.1 84.2 99.2 39.0 69.1 113.2 142.3 72.2 44.1 86.2 114.3 32.0 140.2 68.1 100.2 143.3 125.2 154.2 179.4 167.3 195.0 40 60 80 100 120 140 160 180 m/z Identification Nonane - Score : 935/1000 Décane - Score : 930/1000

Démarche appliquée à l ensemble du chromatogramme RT: 1.32-15.60 100 95 90 85 4.20 7.65 NL: 1.04E9 TIC MS Z- DJ1105180 3 80 Relative Abundance 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 C8 2.61 C9 C10 C11 2.29 5.09 6.11 Dérivés d alcanes en 3.65 6.01 7.36 3.50 5.79 8.85 6.36 4.79 3.09 5.14 6.77 14.15 2.05 8.20 9.38 9.63 10.65 11.14 12.05 12.94 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Time (min) 13.26 14.35

RT: 0.00-49.87 100 95 90 85 Chromatogramme de masse 21.23 NL: 2.93E9 TIC MS Z- JM1110040 2 Relative Abundance 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 7.62 8.96 Même stratégie utilisée pour l analyse d une huile essentielle extraite du thym 15 10 5 0 2.61 3.59 6.45 7.35 10.71 21.68 28.36 13.91 18.28 24.72 31.96 33.92 37.65 40.97 43.26 47.04 49.83 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Time (min) Z-JM11100402 #3378 RT: 21.10 AV: 1 SB: 929 19.10-20.73, 22.21-25.68 NL: 6.29E7 T: + c Full ms [30.00-650.00] 135.0 100 Relative Abundance 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 91.0 115.0 107.0 150.1 136.1 117.1 77.0 105.0 39.0 51.0 65.0 92.1 121.1 151.1 89.0 137.1 152.2 167.1 193.3 209.9 224.9 239.4 255.1 267.2 284.6 298.9 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 m/z Spectre de masse du composé majoritaire Recherche dans la base de donnée et proposition de structure

Analyse d un extrait de Jujube : Fraction organique apolaire issue du même fruit que pour l analyse LC/MS RT: 0.00-57.01 100 95 90 85 80 75 70 65 48.31 48.55 NL: 1.41E9 TIC F: + c Full ms [50.00-650.00] MS Z- SZ11061403 Relative Abundance 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 27.75 4.90 52.68 28.36 40.21 47.08 53.21 23.66 56.88 45.69 9.41 44.41 25.91 13.45 18.09 34.79 41.11 3.53 5.31 15.33 19.21 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Time (min) 31.03 31.54 37.13 39.86 47.50 Echantillon très complexe L identification pic par pic à l aide de la bibliothèque ne suffit pas toujours

Exemple : spectre de masse du composé à 48,3 min Z-SZ11061403 #11828 RT: 48.30 AV: 1 SB: 145 51.08-52.13 NL: 3.96E7 T: + c Full ms [50.00-650.00] 81.1 100 107.1 95.1 95 Relative Abundance 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 55.0 57.1 119.1 145.1 159.1 161.2 163.2 173.2 178.2 213.2 255.2 329.4 303.4 273.3 414.5 381.4 396.5 302.3 330.4 415.4 354.5 416.4 455.3 491.2 535.1 577.2 603.4 641.0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 m/z Identification partielle du composé Identification par familles de composés : triglycérides, stérols végétaux, acides gras saturés et insaturés GC/MS utilisée en complément de l analyse LC/MS permet de mieux appréhender l échantillon dans son ensemble

Analyse Quantitative (GC/MS) Dosage de composés allergènes Méthode utilisé : étalonnage interne -Principe : Le dosage par étalonnage interne repose sur l ajout en quantité parfaitement connue, dans toutes les solutions standards et tous les échantillons, d une molécule qui sert de référence durant les phases de l analyse. Le dosage, se fait de façon relative par rapport à cette molécule de référence, appelée étalon interne. -But : s affranchir de la variation expérimentale (erreur de prises d échantillon, volume d injections, reproductibilité de la réponse en masse, ) : Injection 1 : Vinj = 10µl I A = 50 et I EID = 10 rapport = 5 Injection 2 : Vinj = 9µl I A = 45 et I EID = 9 rapport = 5

Dosage de cinq allergènes dans un extrait de coriandre : limonène, linalol, citronellol, géraniol, eugénol. Gamme étalon des cinq composés + Etalon interne : Dibromobenzène RT: 0.00-18.02 100 95 90 85 5.80 9.14 NL: 1.25E8 TIC MS 100ppm_1 101111252 45 80 75 70 65 6.84 10.63 RelativeAbundance 60 55 50 45 40 8.31 35 30 25 20 15 10 5 5.17 2.67 4.27 4.39 6.05 7.36 9.40 11.58 12.64 14.36 15.34 15.79 17.70 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Time (min) Analyse en mode SIM pour une meilleure sélectivité : exemple sur le pic du linalol à 5ppm RT: 6.63-7.03 Relative Abundance 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 6.64 6.69 6.71 6.74 6.75 6.77 6.79 RT: 6.85 MA: 496527095 SN: 170RMS 6.92 6.98 7.00 7.01 6.65 6.70 6.75 6.80 6.85 6.90 6.95 7.00 Time (min) NL: 3.72E8 TIC MS S1 Full scan Aire : 496e6 S/N : 170 RT: 6.63-7.03 Relative Abundance 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 6.67 6.74 6.79 RT: 6.85 MA: 65849672 SN: 2070 6.65 6.70 6.75 6.80 6.85 6.90 6.95 7.00 Time (min) NL: 4.90E7 TIC MS 5ppm SIM Aire : 65e6 S/N : 2070

Exemple de résultat obtenu :

Quantification par LC/MS triple quad ESI Triple Quadripôle (QqQ) +/- MS-MS SRM/MRM UPLC - Dosage d'acrylamide à l'état de traces dans les aliments frits Molécules organiques polaires MW : 50 1000 g/mol Quantification Solvant compatible : H 2 O, Acétonitrile, MeOH A éviter : DMSO, DMF, solution tampon

- En 2002, découverte d acrylamide, dans différents aliments cuits à haute température (pomme de terre, café, céréales ) - Cette petite molécule polaire est connue pour ses propriétés neurotoxiques et une activité carcinogène potentielle chez l Homme - Projet : - Développement d une méthode de dosage de l acrylamide dans les produits frits à base de banane plantain - Etude réalisée par étalonnage interne - Mode SRM pour augmenter la sélectivité et obtenir ainsi la meilleure sensibilité Composé Structure ion parent (m/z) ion fils (m/z) E collision (V) Tr (Min) H O NH Acrylamide 2 72 55 11 11.9 H H Acrylamide deutéré D D O D NH 2 75 58 11 11.8

- L acrylamide étant fortement polaire, elle n est pas retenue avec des phases stationnaires apolaires classiques et son analyse est difficile. -La séparation s effectue en utilisant une colonne ATLANTIS dc18 qui a la capacité de retenir les petites molécules très polaires lors d une élution en mode isocratique avec 100% d eau. Acrylamide Y = 0.891391*X R^2 = 0.9990 W: Equal 4.5 4.0 3.5 Area Ratio 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 1 2 3 4 5 ppm Etude de la formation de l acrylamide dans un système modèle (asparagine+glucose) en fonction de la température. - Limite de quantification obtenue avec cette méthode : 50 ppb - Cette méthode de dosage (hors validation) est venue supporter une étude visant à explorer de nouveaux procédés afin de réduire la formation d acrylamide

Analyse MALDI-TOF/TOF MALDI Temps de vol (TOF) (TOF/TOF) +/- MS-MS Haute résolution - Analyse d un mélange de peptide - Analyse MS/MS d un peptide - Analyse d une protéine (BSA) - Analyse d une digestat (protéolyse enzymatique) - Analyse de polymère Molécules de haute masse (peptides, protéines, ADN, polymères.) 500 100 000 g/mol Macromolécules Sequençage peptidique Solvant à éviter : DMSO, DMF, solution tampon

Analyse d un mélange de 9 peptides Intens. [a.u.] 2000 2093.1 2465.2 1619.8 1500 1000 1347.7 500 1046.5 1758.9 1296.7 3147.5 757.4 0 1000 1500 2000 2500 3000 3500 [M+H] + : Ions monochargés dépouillement simple m/z Spectre obtenu en mode positif, avec réflectron

Intens. [a.u.] 300 250 [M+H] + 200 3147.5 150 100 50 0 3147 3148 3149 3150 3151 3152 3153 3154 m/z Résolution pour le pic à 3147 R = 19 700

Analyse MSMS d un peptide Intens. [a.u.] 5000 892.632 Fragmentation 0:G3 LIFT 2120.0000, Smoothed, BaselineSubtracted 4000 853.596 1204.808 1388.946 1422.876 1633.185 Analyse MS/MS peptide 2119,1 g/mol 496.486 312.578 3000 740.513 1552.034 2120.006 1876.481 2075.503 567.533 2000 1020.743 1000 428.475 821.571 244.626 128.773 368.494 696.520 612.477 961.688 69.807 1107.715 1145.753 1291.825 1746.397 1991.728 0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 m/z

Utilisation de BioTools On arrive à remonter à la séquence (partielle ou totale) du peptide

Analyse d une protéine Intens. [a.u.] 600 [M+2H] 2+ 66435.9 [M+H] + 500 33221.8 Albumine de sérum bovin (BSA) Masse moléculaire 66 430 Da 400 300 200 22135.3 100 16612.0 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 m/z

Analyse d une digestion trypsique Protéine connue de masse: 30 290 g/mol 269 acides aminés Digestion trypsique: Peptides R/K-Cter Intens. [a.u.] x10 4 2026.0 1.5 2193.0 2598.6 1.0 1212.6 2273.2 1758.8 1800.8 2145.0 0.5 2080.1 0.0 2323.1 2550.5 1952.0 1316.7 2642.6 1438.8 1836.9 1590.8 2119.1 1477.7 884.6 1272.5 1630.7 1532.7 1900.9 650.3 1020.5 3211.5 3300.8 500 1000 1500 2000 2500 3000 m/z

- Reconnaissance de 8 fragments par Biotools - Possibilité de faire de la MS/MS sur les signaux non attibués

Analyse d un polymère PEG 3400 Intens. [a.u.] 2500 2000 3519.0 3446.9 3386.9 3474.9 3623.0 3342.9 3563.0 3298.8 3651.0 Matrice: Dithranol 3210.8 3695.1 1500 3078.7 3122.7 3166.8 3739.1 3783.1 3827.2 1000 2990.6 3034.7 3871.2 3915.2 3959.2 500 2858.6 2902.6 2946.6 4003.3 4047.3 4091.3 2770.5 2682.5 4223.4 4135.3 0 2600 2800 3000 3200 3400 3600 3800 4000 4200 4400 On observe deux distributions. m/z

Avec agent de cationisation Intens. [a.u.] 3298.8 3342.9 3430.9 5000 4000 3122.7 3166.8 3254.8 3474.9 3519.0 3563.0 3607.0 Matrice: dithranol Agent de cationisation: NaI 3078.7 3651.0 3034.7 3695.1 3000 2990.7 3739.1 2946.6 3783.1 2000 2902.6 3827.1 2858.6 3871.2 2814.6 3915.2 1000 2770.5 3959.2 2594.4 2726.5 2682.5 4003.2 4047.3 4091.3 4179.3 0 2600 2800 3000 3200 3400 3600 3800 4000 4200 4400 m/z Plus qu une seule distribution.

Intens. [a.u.] 5000 [M+Na] + 3342.9 3386.9 3430.9 PEG 2 0:F4 MS Raw 4000 3000 44 Da 2000 1000 Intens. [a.u.] 0 2500 3342.9 3386.9 3430.9 PEG 0:F2 MS Raw 2000 1500 [M+Na] + 44 Da 1000 500 16 Da 3358.8 [M+K] + 3402.9 3446.9 0 3340 3360 3380 3400 3420 3440 m/z - Sans agent de cationisation: Adduit avec les ions Na + et K + Perte de sensibilité car une même molécule se trouve sous deux formes/complexité d interprétation. - Avec agent de cationisation: Adduit Na+ seulement Spectre plus clair

A quoi sert la spectrométrie de masse? Témoignage d un partenaire industriel Medesis Pharma Laure Dougui