QUE PEUVENT APPORTER LES TECHNIQUES DE BIACORE DANS LA COMPREHENSION DES INTERACTIONS ENTRE PROTEINES/PEPTIDES MEMBRANAIRES? ou Comment en finir avec l idée que les techniques BiaCore peuvent aborder les interactions intramembranaires!
Principe Surface (sensorchip) ligand analyte Un des partenaires de la liaison (le ligand) est fixé sur une surface (sensorchip) L autre, (l analyte), circulant, se lie à la surface
Principe de la technologie BIAcore 1 Sensor chip prisme verre or Intensité flux 2 1 2 Angle Sensor chip prisme verre or flux ligand analyte
En conditions cinétiques R k a. C. R R = max x (1 - e - (k a. C + k d ). t ) k a. C + k d t
Response(RU) Sensorgram 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 Time (seconds) k a (M -1 s -1 ) k d (s -1 ) K A (M -1 ) 10 5 10 3 10 8 5x10 5 5x10-3 10 8 10 6 10-2 10 8
Sensorgramme 1000 RU 1 ng Surface sensorchip 1mm_
Importance du canal de référence(fc1) RU 70 50 FC2 (ligand) 30 Response 10-10 FC1 (reference) -30 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Time s 80 RU 70 60 50 40 Response 30 20 10 0-10 -20-100 0 100 200 300 400 500 Time s
Conditions expérimentales [densité de ligand (B), concentration de l analyte (A), température, flux ] Conditions cinétiques A bulk (C) = A surf Conditions de transport de masse A bulk (C) A surf Paramètres de l interaction Quantification de l analyte k m k a A bulk A surf + B AB k m k d k m k a A bulk A surf + B AB k m k d
La surface (sensorchip) Ligand Chaînes de dextran carboxylées non réticulées Linker Or Verre
L immobilisation Ligand immobilisé de manière covalente - couplage amine - couplage thiol - aldéhyde * Ligand capturé - streptavidine/biotin - NTA/His-tag - surface hydrophobe/lipides - anti-anticorps/anticorps - anti-gst/gst(protéine de fusion) - anti-peptide/peptide (protéine de fusion) Analyte Ligand Analyte Ligand Capture
Fixation de ligands par liaisons chimiques
Réponse RU 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0-5000 0 Ligne de base Immobilisation du ligand 6 4 5 2 7 1 3 500 1000 1500 2000 2500 Temps Activation des groupements carboxyles du dextran Retour à la ligne de base Injection du ligand La plupart des protéines fixées par des liaisons électrostatiques est éluée Désactivation et lavage par l éthanolamine Ligands fixés disponibles pour les interactions avec l analyte s
QUELLES SURFACES "MEMBRANAIRES" UTILISER? Sensor chip HPA Sensor chip CM5 Sensor chip L1
A DEFAUT DE MEMBRANES, TRAVAILLER EN DETERGENTS 1- Cas des récepteurs à tyrosine kinase 2- cas de peptides, membranaires ou non
Etude de l état de phosphorylation du récepteur de l Insuline RU 1-Étalonnage 300 250 200 2.10-3 mg/ml 1.10-3 mg/ml Réponse 150 100 50 0 5.10-4 mg/ml 2.10-4 mg/ml 1.10-4 mg/ml 2.10-5 mg/ml -50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 S 2 COURBE D'ETALONNAGE Pente 1,5 1 0,5 y = 1758,2x 0 0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 Concentration (mg/ml)
2- Activation des récepteurs de l insuline 50 R?ponse (RU) 40 30 20 10 Ins + TX Ins + AP Sans ins + AP Sans ins + TX 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450-10 Temps (s) Pente [pir] (ng/ml) Activation Ss ins+ap 0,0285 16,2 Ss ins+tx 0,0278 15,8 ins+ap 0,0963 54,8 2,4 ins+tx 0,1550 88,2 4,6
PHOSPHORYLATION SUR TYROSINE DES PROTEINES CELLULAIRES INDUITES PAR L EGF RU 40 Réponse 30 20 10 EGF + Genistein Sans EGF + Genistein 0-10 -20 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Temps s
ANALYSE DES INTERACTIONS PEPTIDES/PEPTIDES 2- pour un système hydrophobe TM TM intein TM intein TM SDS, 100 C intein TM Une Une protéine protéine de de fusion fusion composée composée d un d un peptide peptide transmembranaire transmembranaire et et d intein d intein est est synthétisée synthétisée dans dans des des bactéries bactéries et et purifiée purifiée par par une une colonne colonne d affinité d affinité de de chitin, chitin, puis puis détache détache par par un un traitement traitement SDS. SDS. La La proteine proteine Intein-TM Intein-TM est est alors alors fixée fixée sur sur la la surfece surfece CM5 CM5 du du Biacore. Biacore.
RU 1200 Intein-TM (TX100) SDS intein 1000 800 intein TM TM Response 600 400 200 0 0 500 1000 1500 2000 2500 Time s Lors Lors de de l addition de de l intein-tm, il il y a possibilité de de formation de de diméres via via les les peptides transmembranaires. L addition de de SDS SDS a tendance a déstabiliser ces ces dimères
Flow-Mediated On-Surface Reconstitution of G-Protein Coupled Receptors for Applications in Surface Plasmon Resonance Biosensors (2002) Olof P. Karlsson and Stefan Löfås, Anal Biochem 300, 132 138
Flow-Mediated On- Surface Reconstitution of G- Protein Coupled Receptors for Applications in Surface Plasmon Resonance Biosensors (2002) Olof P. Karlsson and Stefan Löfås, Anal Biochem 300, 132 138
Flow-Mediated On- Surface Reconstitution of G-Protein Coupled Receptors for Applications in Surface Plasmon Resonance Biosensors (2002) Olof P. Karlsson and Stefan Löfås, Anal Biochem 300, 132 138
Flow-Mediated On-Surface Reconstitution of G- Protein Coupled Receptors for Applications in Surface Plasmon Resonance Biosensors (2002) Olof P. Karlsson and Stefan Löfås, Anal Biochem 300, 132 138
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Exploring Peptide Membrane Interaction Using Surface Plasmon Resonance: Differentiation between Pore Formation versus Membrane Disruption by Lytic Peptides Niv Papo and Yechiel Shai Biochemistry 2003, 42, 458-466
Exploring Peptide Membrane Interaction Using Surface Plasmon Resonance: Differentiation between Pore Formation versus Membrane Disruption by Lytic Peptides Niv Papo and Yechiel Shai Biochemistry 2003, 42, 458-466 Magainin, lyse sans formation de pores Mellitin, lyse avec formation de pores
Exploring Peptide Membrane Interaction Using Surface Plasmon Resonance: Differentiation between Pore Formation versus Membrane Disruption by Lytic Peptides Niv Papo and Yechiel Shai Biochemistry 2003, 42, 458-466
Exploring Peptide Membrane Interaction Using Surface Plasmon Resonance: Differentiation between Pore Formation versus Membrane Disruption by Lytic Peptides Niv Papo and Yechiel Shai Biochemistry 2003, 42, 458-466
Exploring Peptide Membrane Interaction Using Surface Plasmon Resonance: Differentiation between Pore Formation versus Membrane Disruption by Lytic Peptides Niv Papo and Yechiel Shai Biochemistry 2003, 42, 458-466 Table 2: Equilibrium Affinity Constants of the Peptides with PC/Cholesterol and PE/PG Monolayers (HPA Chip) and Bilayers (L1 Chip) Derived According to a Steady-State Affinity Model magainin melittin PC/Cholesterol (10:1 w/w) PE/PG (7:3 w/w) K A (? 10 4 M -1 ) K A (? 10 4 M -1 ) monolayer bilayer K A bil/ K A monol monolayer bilayer K A bil / K A monol 0.11 (±0.01) 1.88 (±0.09) 0.09 (±0.01) 0.80 3.23 (±0.12) 47 (±3) 25 1.89 (±0.02) 10.9 (±0.8) 15.9 (±0.9) 3.4 8.4
QUE PEUVENT APPORTER LES TECHNIQUES DE BIACORE DANS LA COMPREHENSION DES INTERACTIONS ENTRE PROTEINES/PEPTIDES MEMBRANAIRES? Beaucoup, sans doute au niveau des interactions protéines non membranaires/membranaires, dans un contexte membranaire Peu pour les interactions intramembranaires, sauf à utiliser des détergents