Spectrométrie de masse

Qui etaient les lauréats du prix Nobel de 2002 en chimie? Importance de la spectrométrie de masse dans l analyse de biomolécules "for the development of methods for identification and structure analyses of biological macromolecules John B. Fenn 1/4 of the prize USA "for their development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric analyses of biological macromolecules Koichi Tanaka 1/4 of the prize Japan "for his development of nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the three-dimensional structure of biological macromolecules in solution Kurt Wüthrich 1/2 of the prize Switzerland 1

A quoi sert la spectrométrie de masse dans la vie de tous les jours? Détection et identification de stéroides anabolisants chez les athlètes Haleine des patients anesthésies lors de chirurgie Composition d espèces moléculaires dans l espace Miel dénaturé avec du sirop de maïs Localisation d huile à partir de précurseurs présents dans les roches Procédés de fermentation dans l industrie biotechnologique Dioxines dans les poissons contaminés Modification génétique dû à un stress environnemental Composition élémentaire de matériaux semi-conducteurs Explosifs dans les aéroports Études pharmacocinétiques sur les nouveaux composés pharmaceutiques 2

Composantes d un spectromètre de masse e- Introduction de l échantillon Ionisation Analyseur Détection Chromato. (GC, HPLC) Injection directe Electrophorèse capillaire Neb. Electro. (ESI) Des. Laser (MALDI) Bomb. Atomes rap. Ion. Chim. Impact elect. Quadrupole Trappe ion. Temps d envol Res. Ion. Cyclo. Secteurs (B, E) Mult. Electron Dynode de conv. Réseau mult. elect. (MCP) Sous vide 3

Technologie du vide Gamme de pression (Pa) Gamme de pression (mbar) Gamme de pression (mtorr) Vide Débit de gaz 10 5-10 2 1 bar - 1 mbarr 750 torr - 750 mtorr Vide primaire Débit visqueux 10 2-10 -1 10 0-10 -3 750-0.75 Vide intermédiaire Débit de Knudsen 10-1 -10-5 10-3 -10-7 0.75 7.5. 10-5 Vide élevé Débit moléculaire < 10-5 < 10-7 < 7.5. 10-5 Ultravide Débit moléculaire Vide en deux étapes: Pompes rotatives: 4-16 m 3 /h, assure le vide primaire nécessaire à l opération de pompes moléculaires (backing pumps). Ultravide obtenue à partir de pompes turbomoléculaires (200-500 L/s), pompes à diffusion (600-2000L/s), pompes cryogéniques. 4

Notions de base mesure de masse Spectre de masse nebulisation electrostatique en mode + et d un pesticide 220.06 222.06 218.04 L espece ionisée correspond à la molécule avec un proton supplémentaire ou un proton en moins. Dans la littérature, la masse moléculaire peut être exprimée de différente façon: Masse moyenne: 219.67 Masse nominale: 219 Masse précise: 219.0563 220.05 Formule empirique: C 11 H 10 N 3 Cl 1 Pourquoi on observe plus d une espèce ionique (ie m/z 221.06 et 222.06)? 5

Notions de base mesure de masse Une molécule est representée par sa distribution atomique (formule empirique). Chaque atome a une distribution d isotope naturel. Par exemple le carbone et le chlore: 12 6 35 17 C :12.0000u, Cl :34.9689u, 12 6 C :100 %, 13 6 13 6 37 17 C :13.0034u Cl :36.9659u Chaque isotope a une abondance naturelle qui lui est propre. Par exemple le carbone C :1.08 % Les atomes monoisotopiques tels ceux du fluor ou du 19 23 sodium 9F :18.9984u, 11Na : 22.9984u sont identifiés comme A et les atomes multi-isotopiques (carbone, chlore, hydrogène, etc ) A+1, A+2, etc 6

Notions de base mesure de masse Par définition l atome A du carbone a une masse de 12.00000u L unité de masse u, est définit comme étant 1/12 de la masse du nuclide 12 C et correspond à: 1u: 1.66055 x 10-27 kg Certains atomes ont une masse légèrement supérieure (excédent) à la masse nominale alors que d autres sont légèrement inférieures (déficit). Par exemple: 1 1 H :1.0078u, 16 8 O :15.9949u Comment se traduit cette subtilité pour les masses moléculaires élevées? 7

Notions de base mesure de masse Excedent (Da) 2.5 2 1.5 1 0.5 0 Poly-Asp y = 0.0002x + 7E-15 Poly-Leu y = 0.0007x + 2E-14 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Masse (Da) Gamme de masse excedentaire pour peptides Poly-aspatate et poly-leucine représentent les polypeptides ayant respectivement le contenu de proton le plus faible et le plus elevé parmi les acides aminés. La poly-cystéine (plus faible contenue de proton/masse) n a pas été considerée car le frequence de l acide aminé Cys par protéine n est pas elevée. 8

Notions de base abondance Chaque isotope naturel a une abondance relative caractéristique. Quel serait la variation du rapport isotopique avec l augmentation du nombre d atome de carbone? 12 C monoisotopique 12 C monoisotopique 12 C monoisotopique C 60 C 90 C 120 Comment varie la progression du rapport isotopique avec la masse moléculaire? 9

Notions de base abondance Si un élément A possède deux isotopes naturels dont l un (A ) est plus abondant que l autre (A ). Le rapport de leur abondance est donné par: A' ' /(100 - A'') où: A est l abondance naturelle (%) du constituant mineur Par exemple si on a un total de 1000 molécules de CH 4, il y aura 11 molécules contenant 13 C plutôt que 12 C; alors que le reste (989) aura la composition 12 CH 4. Leur rapport relatif d intensité sera 989/11. De façon plus générale, la probabilité de n avoir que des isotopes 12 C pour une molécule possédant Z atomes de carbones est: P = 100 - A'' 100 Z 10

Notions de base abondance De la même façon, pour les éléments C H N O S, la probabilité P M que tous les atomes ne contiennent aucun isotope lourd est donné par: P M a 2 100- H 100 13 100- C = 100 b 17 100- O- 100 15 100- N 100 18 c O d 33 100- S- 100 34 e S où: 13 C, 2 H, 17 O, 18 O, 15 N, 33 S et 34 S sont les abondances relatives des différents isotopes lourds des éléments considerés. a, b, c, d, e représentent le nombre d atome pour le carbone, l hydrogène, l oxygène, l azote et le soufre 11

Notions de base abondance De la même façon, la probabilité d avoir un atome 13 C pour une molécule contenant Z atomes est donné par: P M + 1 = z 100-100 13 C 100-13 C 13 C Z Donc le rapport d intensité M+1/M correspondant uniquement à une molécule ne contenant que des atomes de carbone est: P P M+ 1 M = z 13 C 100-13 C 12

Notions de base abondance En tenant compte de chacunes des combinaisons d isotopes M+1 de chacune des atomes C, H, N, O et S, on obtient le rapport d intensité relative suivant: M + 1 M = 100 ( a A + b B + c C + d D + e E) où: a: # atome de carbone A: 13 C/(100-13 C): 0.011 b: # atome d hydrogène B: 2 H/(100-2 H): 1.15 x 10-4 d: # atome d azote D: 15 N/(100-15 N): 3.70 x 10-3 e: # atome de soufre E: 33 S/(100-33 S): 7.89 x 10-3 c: # atome d oxygène C: 17 O/(100-17 O): 3.80 x 10-4 13

Notions de base abondance Aussi la probabilité d avoir exactement A atomes 13 C (P M+A ) sur un total de z atomes est décrit par la relation: P = Z A! A Z 13 C 100 C 100 M+ A 13!( )! 100 Z 13 C A-Z = A! A!( A 13 C Z)! 100-13 C Z 13 100 C 100 A P P 100 13 M + A A! 100 C M = A!( A Z)! A 14

Notions de base abondance Symbole #atomique Masse nom. Comp. isoto. Masse isoto. Mass moy. H 1 1 2 100 0.0115 1.007825 2.014101 1.00795 Na 11 23 100 22.989769 22.989769 P 15 31 100 30.973762 30.973762 C 6 12 13 N 7 14 15 O 8 16 17 18 S 16 32 33 34 36 Cl 17 35 37 Br 35 79 81 100 1.08 100 0.369 100 0.038 0.205 100 0.8 4.52 0.02 100 31.96 100 97.28 12.000000 13.003355 14.003070 15.000109 15.994915 16.999132 17.999116 31.972071 32.971459 33.967867 35.967081 34.968853 36.965903 78.918338 80.916291 12.0108 14.00675 15.9994 32.067 35.4528 79.904 15

Notions de base abondance Quelle variation de rapport isotopique peux t on prévoir pour un peptide moyen? Formule empirique pour l acide aminé averagine : (C 4.95 H 7.8 N 1.47 O 1.35 S 0.039 ) % of monoisotopic 12C 140 120 100 80 60 40 20 0 M+1/M M+2/M M+3/M y = 0.0556x - 9E-14 y = 0.0002x 1.6907 y = 2E-07x 2.451 0 500 1000 1500 2000 2500 M a ss (D a ) 16

Notions de base abondance Des-Arg Bradykinine Renin substrate 904.46 1758.93 Angiotensine I 1296.69 ACTH clip (18-39) 2465.20 Variation du rapport isotopique avec la masse Variation de l excédent de masse moyen de 0.0005Da/Da 17

Notions de base résolution M R = M M 50 % 5 % 10 % R: 500 1u 1u 1u 50 51 500 501 1000 1001 m/z 18

Notions de base résolution Comment la distribution isotopique varie avec la résolution du spectromètre de masse? 19

Notions de base résolution Résolution et son impact sur l identification d espèce ionique C 20 H 9 + C 19 H 7 N + C 19 H 7 N+ C 20 H 9 + C 13 H 19 N 3 O 2 + C 13 H 19 N 3 O 2 + Instrument de faible résolution R: 1000 Instrument de grande résolution R> 10,000 249 249.0580 249.0700 249.1479 Analyseurs de masse de plus grande résolution (> 10,000) sont les appareils à secteurs, temps d envol, résonance cyclotronique ionique 20

Techniques d ionisation - Désorption laser avec matrice Impulsion laser de 4 ns (λ337 nm, N 2 ) To MS [M+H] + ± 30 kv Échantillon + matrice 10000 m/z 15000 Caractéristiques: Analytes: Biomolecules jusqu à - 500 kda Sensibilité: 10-100 pg (-10-100 fmoles) Précision: Avec TOF ± 0.02% (ext.), ± 0.005% (int.) Résolution: Avec TOF 15,000 (<10kDa), <1000 @ >20 kda Purete de l ech.: Moindre susceptibilité à la présence de sels (mm) Matrice: Absorbe en UV, dépend de l analyte, peut causer un bruit de fond < 800 Da 21

Techniques d ionisation - Désorption laser avec matrice Laser UV/visible regions λ Excimer gaz rares: ArF 193 nm KrF 248 nm XeCl 307 nm XeF 351 nm Azote 337 nm Infrarouge Er:YAG fondamentale 2.94 µm CO 2 9.6 nm, 10.6 µm Plus communs Laser Science Inc. VSL-337ND nitrogen laser. Specifications : 250µJ/impulsion, 3 ns temps d impulsion. Duree de vie ~ 2-4 ans. 22

Techniques d ionisation - Désorption laser avec matrice Matrices pour laser à l azote OH COOH OH 2,5-dihydroxy benzoic acid (DHB) 1, 2, 3, 4, 5 CN CH=C COOH α-cyano-4-hydroxycinnaminic acid (CHCA) HO 1, 2 3-hydroxypiconilic acid (HPA) N OH COOH 4 COOH HABA N=N OH 2 H CH 3 N 6-aza-2-thiothymine (non acide) S N N H 1, 4 O OH OH Dithranol (non acide) 5 CH=CH COOH Trans-indoleacrylic acid 5 N H H CH 3 O CH=C Sinnapinic acid COOH 2 HO 2,4,6 -trihydroxyacetophenone O CH 3 2, 3 OH O (non acide) HO C CH 3 HO (1: peptides, 2: protéines, 3: oligosaccharides, 4: acides nucléiques, 5: polymères) 23

Techniques d ionisation - Désorption laser avec matrice A. Evaporation Désaler l échantillon (Zip tip). Utiliser au besoin des billes échangeuse d ions pour réduire la formation d adduits alcalins. Préparer solution ~ 10 µm de l échantillon dans une solution aqueuse d acétonitrile. Préparer une solution de 0.1 M solution de matrice (DHB ou CHCA) in 1:1 Acétonitrile:eau. Mélanger la solution de matrice et l echantillon 1:1 (v:v). Appliquer 0.5 µl de l echantillon/matrice sur la plaque et sécher. S.L. Cohen, B.T. Chait, Anal. Chem. 68, 31-37 (1996) B. Couche mince Dissoudre la matrice dans l acétone avec 1-2% eau et appliquer sur la plaque. Rinser la plaque légerement avec l eau pour enlever les sels. Appliquer l échantillon. O. Volm, P. Roepstorff, M. Mann, Anal. Chem. 66, 3281-3287 (1994) C. Sandwich Préparation de l échantillon Préparer une couche mince comme decrit en B. Appliquer analyte/matrice sur la couche mince celle-ci formant de cristaux de germination. F. Xiang, R.C. Beavis, Rapid Commun. Mass Spectrom. 8, 199-204 (1994) 24

Techniques d ionisation - Désorption laser avec matrice Impulsion laser Un faisceau moléculaire supersonique occasionne la sublimation de l analyte/matrice Analyte + matrice ± 30 kv Modèle de desorption avec matrice La matrice absorbe la radiation dans la gamme d émission du laser. L énergie absorbée occasionne la dissociation de la matrice. La zone irradiée s etend sur une zone de 300 µm x 600 µm, 25 Å profondeur, et déplète environ 4.5 x 10-10 cm 3 de solide. La dissociation rapide de la matrice libère des molécules neutres et des analytes en phase gazeuse et produit une région de plus haute pression dans le voisinage de la surface irradiée. Cette haute pression se traduit par une expansion supersonique amenant avec elle les analytes desorbés. 25

Techniques d ionisation - Désorption laser avec matrice Modèle d ionisation avec matrice La matrice joue un rôle important dans l ionisation en plus du processus de désorption. La photoionisation de la matrice est suivie par une multitude de réactions impliquant à la fois des transferts radicalaires et de protons. Les molécules de matrice ne doivent pas former de radicaux ou espèces protonées stables afin de favoriser l ionisation de l analyte. H. Ehring, M. Karas, F. Hillenkamp, Org. Mass Spectrom., 27, 472-480 (1992). Plus acide lors de l excitation CH 3 O HO CH=C H COOH Réaction photochimique: H-DHB* + P (H+P) + + DHB O CH 3 Moins acide lors de l excitation H-DHB* H + + DHB - P + H + (P-H) + 26

Techniques d ionisation - Désorption laser avec matrice Distribution de velocité de l acide sinnapinique Distribution de velocité de l acide sinnapinique calculée selon le déplacement du temps d envol Distribution d intensité de l acide sinnapinique selon le délai après l impulsion laser Intensite (unite arb.) Intensite (unite arb.) 800 600 400 200 Velocite (m/sec) 10 20 Delai (µsec) L impulsion laser occasionne une large distribution d énergie cinétique des analytes Cette distribution est plus étroite suite a un délai après l impulsion bien que l intensité diminue. 27

Techniques d ionisation - Désorption laser avec matrice Influence du délai sur la résolution Pulsing scheme PerSeptive U e Source plate Extraction region U a Intermediate grid Acceleration region d a d 0 U f Final grid U e U a U f 20 kv, pulse 16 kv 0 18 kv, constant 0 ground, constant Delay Time Adapte de R. Cotter, Anal. Chem. 445A, 1999 28

Techniques d ionisation Nébulisation électrostatique (ESI) Air ESI voltage (5 kv) Evaporation du solvant Champ électrique Echantillon/ phase mobile Nébulisation des gouttelettes Ejection des ions Caractéristiques: Analytes: Sensibilité: Précision: Résolution: Hybride: Biomolécules jusqu à - 500 kda 1-10 pg (-1-10 fmoles pour 1000 Da) ± 0.02% (ext.), ± 0.005% (int.) Avec TOF 15,000, >100,000 avec FTMS Couplage en ligne avec EC, CLHP, infusion 29

Techniques d ionisation Nébulisation électrostatique (ESI) Caractéristiques du spectre de masse ESI 9+ 8+ 1251.0 7+ 1112.1 + H 10+ 1429.6 1001.0 Protéine de 10,000 Da 6+ 1667.7 1000 1500 m/z Apparition d ions multiplement chargés ie [M-nH] n- ou [M+nH] n+ Espacement entre deux série d ion multiplement chargés correspond a l ajout ou l abstraction d un proton de la molécule. Comment peux t on determiner la masse moléculaire? [ M + nh] [ M + nh + 1] m < z z + 1 / z1 = et m / z2 = et m / z2 m / z1 30

Techniques d ionisation Nébulisation électrostatique (ESI) Ions multiplement chargés et charge 1001.5 1 m/z M: 1000.5 Da Simplement chargé 501.3 0.5 m/z Doublement chargé 334.5 0.33 m/z Triplement chargé m/z 31

Techniques d ionisation Nébulisation électrostatique (ESI) Aspect mécanistique Production de gouttelettes chargées à partir de l analyte dissout en solution Evaporation du solvant, diminution de la taille des gouttelettes, desintégration de celles-ci donnant lieu à des micro-gouttelettes plus chargées. Production d ions en phase gazeuse. Phénomènes secondaires tels oxidation de l analyte. 32

Techniques d ionisation Nébulisation électrostatique (ESI) Gouttelettes chargées. La solution à l extrémité du nébuliseur électrostatique est soumis à une tension électrique elevée. Lorsque le capillaire de diametre r c est situé à une distance d de la contre-électrode (MS), le champ électrique est donné par: Ec = 2 V c /r c ln(4d/r c ) Reduction e- Oxydation - + - + + + + + + + ++ Taylor cone + + + + + + ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + High-voltage power supply e- Anal. Chem. 65, 972A (1993) 33

Techniques d ionisation Nébulisation électrostatique (ESI) L évaporation du solvant et la collision avec les molécules environnantes a pression atmospherique occasionne une réduction de la taille des gouttelettes. Une explosion Coulombique (fission) survient lorsque la micro-gouttelette atteint la limite de Rayleigh ou l ampleur du champ électrostatique est plus grand que la tension de surface maintenant l integrité de la gouttelette. Q 2 = 64 π 2 ε 0 γ R 3 ou Q correspond a la charge, ε 0 la constante de permittivité, γ la tension de surface, R le rayon de la gouttelette. Pour une solution aqueuse ou R=1.5 µm nous obtiendrons une charge Q de 10-14 C (ou 50,000 ions simplement chargés). 34

Techniques d ionisation Nébulisation électrostatique (ESI) Ionisation de l analyte. La diminution de la gouttelette suite aux fissions successives peut donner lieu a un résidu ionique désolvaté de ~ 1nm (single ion in droplet theory, SIDT, proposé par Dole et al., J. Phys. Chem.49, 2240 (1968)). Un autre mécanisme assume une évaporation ionique successive (émission) a partir de micro-gouttelettes de plus en plus chargées (Iribarne and Thomson, J. Phys. Chem., 64, 2287 (1976)). Ces gouttelettes compétitionnent avec les phénomènes de fission lorsque celles-ci atteignent un diametre de 8 nm comprenant ~ N=70 charges élsmentaires. Dans ces conditions, les micro-gouttelettes ne donnent pas lieu à une fission mais émettent des ions directement. Lorsque N décroit, l émission peut être maintenue suite à la diminution du diamètre de la gouttelette. Ce modèle peut survenir même en présence d analytes formant des paires d ions. 35

Techniques d ionisation Nébulisation électrostatique (ESI) Taille de l émetteur, débit et efficacité d émission. Les progrès récents dans la fabrication d émetteurs de petits diamètres et la disponibilité de pompes CLHP à faible débit ont permis d obtenir des gains importants de sensibilité (Dale, D.C., Smith, R.D., Rapid Commun. Mass Spectrom., 7, 1017, (1993), Emmett, M.R., Caprioli, R.M., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 5, 605, (1994), Andren, P.E., Emmett, M.R., Caprioli, R.M., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 5, 867, (1994) and Wilm, M.S., Mann, M., Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc., 136, 167, (1994)]. Dans ces conditions un cône de Taylor est obtenu pour des debits de 25-100 nl/min avec une émetteur de <10 µm. Le rayon d émission est definit par: 36

Techniques d ionisation Nébulisation électrostatique (ESI) r e = ρ 4π 2 γ tan π 2 α 2 U a U t 1 1/3 x dv dt 2/3 où γ est la tension de surface du liquide, α l angle de cone liquide, ρ sa densité, U t et U a le seuil du voltage d émission et le voltage appliqué, et dv/dt le débit. Pour un capillaire de dimension donné, le diamètre est proportionnel au débit (DV/dt) 2/3. Pour une solution aqueuse dont le débit est de 25 nl/min, r e est 88 nm. L efficacité d ionisation/ transmission à ce débit est d environ 8 x 10-4. Cette réduction de la taille de l émitteur permet des gains significatifs de sensibilité et ce pour des diamètre de < 5 µm et des gouttelettes de < 200 nm, ce qui permet également la réduction du voltage appliqué. 37

Techniques d ionisation Nébulisation électrostatique (ESI) Comparaison de la sensibilité et du débit en LC-MS Diamètre (mm) Débit (µl/min) Qté inj. (pmol) Facteur de conc. Rel. 4.6 500-1000 10 2-10 5 1 2.1 100-400 50-10 4 5 1.0 40-100 5-10 3 20 0.32 1-10 0.5-500 200 0.075 0.05-0.5 0.001-1 3700 38

Techniques d ionisation Nébulisation électrostatique (ESI) Comparaison de la sensibilité et du débit en LC-MS 39

Techniques d ionisation Nébulisation électrostatique (ESI) 40

Techniques d ionisation Nébulisation électrostatique (ESI) 41

Techniques d ionisation Nébulisation électrostatique (ESI) Résolution accrue pour l analyse de protéines en mode ESI. MALDI permet par contre une mesure de masse avec une plus grande sensibilité pour l analyse de glycoprotéines, ce qui n est pas possible avec ESI car la protonation de l analyte ne permet pas d obtenirdes m/zdansla gamme accessible du MS. 42

Techniques d ionisation Nébulisation électrostatique (ESI) Analyse de peptides et protéines par ESI Smith et al. Anal. Chem., 62, 882 (1990) 43

Techniques d ionisation Nébulisation électrostatique (ESI) Analyse LC-MS de digestat trypsique de lectin (PNA) 44

Techniques d ionisation Nébulisation électrostatique (ESI) Spectre de masse d oligonucléotide dt 10 en présence d imidazole et piperidine (échange H/Na) GreigM., Griffey. R.H., Rapid Commun. Mass Spectrom., 9, 97 (1995) 45