La purification des protéines La purification d une protéine consiste en sa séparation des autres constituants de la cellule protéine assez enrichie pour que tout contaminant puisse y être tenu comme valeur négligeable : «raisonnablement pure» plusieurs étapes : chaque étape visant à éliminer telle ou telle classe de contaminant. À chacune de ces étapes, la protéine sera enrichie par rapport aux autres substances ( la quantité totale de la protéine à purifier va probablement baisser à chaque étape). Pour être d une quelconque utilité, la protéine purifiée devra avoir conservé une certaine intégrité; Pour une activité enzymatique : préserver la fonction de la protéine, même si sa structure a un peu pâti; à l inverse, pour des études structurelles, nous voulons une structure intacte même si l activité n y est plus.
Source de matériel une protéine dans son contexte naturel ne représente qu'une fraction infime du pourcentage de la masse totale des protéines. Tissu pas facile. Le tissu devra souvent être brisé au mixer et/ou traité à la collagénase pour en briser les fibres insolubles et très solides. Un avantage est que la protéine vient de son milieu naturel Cellules en culture Probablement la source la plus courante de protéines non-exprimées dans un système recombinant procaryote. Les cellules en culture sont très proches physiologiquement de ce qui se passe dans un être vivant. Elles sont aussi généralement très faciles à traiter pour faire un extrait cellulaire. Malheureusement, la plupart demandent des conditions de culture exigeant l'utilisation de réactifs et de nutriments très onéreux; en outre, plusieurs types de cellules poussent lentement et ne donnent pas beaucoup de matériel.
une protéine surexprimée peut en représenter une fraction impressionnante : source alternative (moins onéreuse ou plus commode à utiliser) Les bactéries, Les cellules de mammifères, Les levures, Les champignons, Les plantes transgéniques, Les animaux transgéniques
Les bactéries du type colibacille (Escherichia coli) permettent de produire des protéines à faible coût. Cependant, leur utilisation a été longtemps limitée à la production de protéines simples, qui ne requièrent pas de modification post-traductionnelle et de repliement élaboré dans l'espace. C'est en train de changer grâce à l'ingénierie des protéines.
Les cellules de mammifères représentent le système standard de production de protéines recombinantes complexes (anticorps par exemple). Cependant leur faible rendement et un coût de production très élevé limitent leur usage industriel.
Les levures (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris) ont les mêmes avantages que les bactéries mais produisent des protéines immunogènes pour l'homme en raison de modifications post-traductionnelles.
Les champignons permettent de produire certaines protéines sécrétées. Cependant, ils apportent des modifications posttraductionnelles qui affectent fortement les propriétés pharmacocinétiques des protéines produites..
. Les plantes transgéniques peuvent fabriquer des protéines recombinantes en quantités très importantes. Néanmoins, elles créent des modifications post-traductionnelles spécifiques des plantes et fortement immunogènes pour l'homme. Leur exploitation exigerait «d'humaniser» les protéines ainsi produites..
Les animaux transgéniques représentent une solution alternative pour produire en grande quantité (dans le lait par exemple) des protéines thérapeutiques complexes, correctement glycosylées et repliées. Leurs coûts sont plus faibles que ceux des systèmes cellulaires. En revanche, ils posent des problèmes de sécurité liés aux éventuelles contaminations virales.
Les virus Une approche intéressante pour la production de protéines par des cellules eucaryotes est d'en introduire la séquence codante dans le génome d'un virus, puis d'utiliser celui-ci pour infecter des cellules. On utilise beaucoup le baculovirus pour infecter des cellules d'insectes. Ce système est très efficace. On doit cependant se souvenir de ce que la glycosylation protéique chez les insectes n'est pas exactement la même que chez les mammifères. Le virus de la vaccine offre un autre système d'expression. Il peut fonctionner dans des cellules humaines. En plus, l'infection par la vaccine cause l'arrêt de la transcription et de la traduction des protéines de l'hôte (seules les protéines venant du virus sont exprimées), ce qui enrichit la protéine recombinante par rapport au bruit de fond. Le problème ici est que la vaccine est un virus vivant qui peut se transmettre à l'utilisateur.
caractéristiques de différentes sources de protéines exprimées à partir d'un vecteur d'expression. Bactérie Levure Insecte Mammifère in vitro Facilité du procédé +/- complexe, lent +/- complexe, lent complexe, lent complexe, lent simple, rapide Expression rapide rapide assez lente assez lente très rapide Production élevée élevée moyenne moyenne faible milieu pas cher pas cher coûteux couteux couteux protéine sécrétée? souvent, avec aussi corps d'inclusion souvent parfois rarement ne s'applique pas purification simple simple assez simple assez simple simple co-expression difficile difficile assez facile difficile facile Interférence avec l'hôte rarement rarement rarement rarement non Repliement correct pas toujours pas toujours oui oui pas toujours N-glycosylation non oui, riche en mannose simple, pas d'acide sialique complexe non O-glycosylation non oui oui oui non phosphorylation sur Tyr; très rare sur Ser et Thr oui oui oui non acétylation non oui oui oui non acylation du N- terminus non oui oui oui non gammacarboxylation non non non oui non
Extraction
Extraction Plusieurs choix fonction du type de cellule utilisé, des conditions de purification de la protéine, de l équipement disponible, et des compétences Un choc osmotique : la membrane cellulaire de cellules fragiles, avec ou sans détergent (ce qui permet aussi d aider à maintenir les protéines en solution). et/ou action mécanique : un homogénéisateur à piston permet de briser la plupart des cellules de mammifères. Pour les cellules de plantes, de levures ou les bactéries :présence d une paroi cellulaire très résistante (les protoplastes de telles cellules seront préparés en traitant ces dernières avec des enzymes (telle la lyticase) qui détruiront la paroi sans briser la membrane plasmique.) Dans tous les cas, une méthode brutale peut aussi être utilisée. Le traitement aux ultrasons, une lyse mécanique utilisant des billes de verre ou une presse Aminco- French, comme les cycles de congélation/décongélation, sont tous des moyens envisageables.
Tampon L extraction s effectuera dans une solution tampon, dans laquelle les cellules seront resuspendues après une centrifugation visant à les concentrer. Le tampon de lyse : avoir un fort pouvoir tampon. Bis-TRIS PIPES MOPS TES HEPES Tris Glycine 6,46 6,76 7,20 7,40 7,48 8,06 9,78 Alors que l intérieur des cellules est un environnement réducteur (glutathione), l atmosphère dans laquelle nous vivons est au contraire oxydante (elle est riche en oxygène) :protéger d une oxydation excessive parun agent réducteur comme la glutathione, l acide ascorbique, le beta-mercaptoethanol ou le dithiothreitol (DTT) ajouté au tampon.. Le glycérol stabilise les interactions protéine-protéine. Des inhibiteurs de protéases (à ph élevé -7 à 8- et 4 C )
Techniques d extraction tissu entier : libérer un maximum de cellules ( mixer). On utilisera aussi une enzyme comme la collagénase pour briser les fibres de collagène Techniques mécaniques et/ou physiques : le broyage par forces de frottements : mortier/pilon, potter, presse de french, sonication ( attention à l échauffement) choc thermique choc osmotique méthodes chimiques méthodes enzymatiques
Homogénéisateur de type Dounce et Homogénéisateur de type Potter-Elvehjem Le "potter" ressemble à un Dounce motorisé; son piston a souvent une tête de teflon et tourne dans le cylindre contenant les cellules resuspendues.
La presse de French La suspension de cellules est versée dans le cylindre. Le piston est installé, obstruant le trou, et une puissante vis sans fin commence à l enfoncer dans le cylindre. Comme il n y a que peu d air dans le cylindre et qu un liquide est à toute fin pratique incompressible, l enfoncement du piston fait très rapidement grimper la pression sur les parois du cylindre. Quand on ouvre légèrement la valve, la suspension de cellules est éjectée. Plus la pression est haute dans le cylindre, plus totale est la lyse.
Les billes de verre
La sonication une tige de métal (le "sonicateur") à l extrémité très fine est introduite dans la suspension de cellules et induite à vibrer violemment. Les vibrations sont des ondes de pression ultrasoniques qui causent la croissance de bulles par un phénomène appelé "cavitation". Ces bulles sont soumises à un grand stress par les ondes ultrasoniques et peuvent subitement grandir, se contracter ou même imploser. Une telle implosion est accompagnée d'une très haute augmentation locale de la pression et de la température. (une microbulle qui implose ainsi peut voir sa température grimper à 5000 C et sa pression atteindre plusieurs centaines d'atmosphère). Les vibrations ultrasoniques réussissent à briser les ponts hydrogènes qui assurent l'état liquide de l'eau, ce qui les convertit en gaz. A froid, le gaz qui se condense perd du volume et laisse derrière lui un espace vide (une cavité, d'où le nom de "cavitation"). L'eau liquide se précipite dans l'espace vide pour le remplir, et les molécules d'eau liquides entrent en collision au coeur de la cavité. L'onde de choc de cette collision s'étend alors dans le voisinage comme les cercles concentriques générés par un caillou lancé dans une mare. Et l'addition de toutes ces ondes de choc peut pulvériser les cellules Attention à la chaleur dans le matériel biologique ( sonication dans un bac à glace)
La bombe à disruption Elle consiste en une chambre pressurisée dans laquelle les cellules sont traitées avec de l'azote à haute pression. La pression force l'azote à se solubiliser dans les liquides. On libère alors la pression tout d'un coup; l'azote en solution reprend son état gazeux, forme des bulles à l'intérieur des cellules et les fait éclater.
Choc thermique Cycles de congélation/décongélation (exemple des protéines résistantes en température comme la polymérase de thermophilus aquafilus) Choc osmotique Brise les cellules fragiles avec un minimum de dommages. Les cellules sont incubées dans une solution hypo-osmotique. Cherchant à rétablir l équilibre osmotique, l eau pénètre dans la cellule et finit par causer une rupture de la membrane plasmique. On peut donner un coup de pouce à la technique avec un peu de détergent (NP-40, LDAO, triton X-100) et avec un soutien mécanique (quelques coups de piston dans un homogénéisateur de type Dounce). Une telle approche permet de récupérer des noyaux presque intacts une fois séparés des débris de la membrane plasmique. Il est possible de lyser les membranes plasmiques sans briser les noyaux.
Enzymes lytiques Pour les levures, les plantes, les bactéries : paroi cellulaire qui protège la membrane plasmique. Si on n opte pas pour une méthode mécanique et violente d extraction, il faudra d abord détruire cette paroi avant de s en prendre au reste de la cellule. le lysozyme (du blanc d'oeuf de poule, par exemple) pour les bactéries la lyticase de S.aureus Cellulases et pectinases pour les cellules végétales Méthodes chimiques Dégradation à l acide hypochlorique, utilisations d antibiotiques, variation de ph, détergents * Certains solvants sont utilisés pour solubiliser les lipides (délipidation) : hexane, chloroforme/méthanol, puis décantation. * Protéines membranaires :assez insolubles : utilisation de détergents (SDS, )
La chromatine Selon la technique utilisée : l extrait protéique brut contient de l ADN plus ou moins intact et associé à un grand nombre d histones. Plus cette chromatine est intacte, et plus le milieu est visqueux. Une extraction à la presse Aminco-French ou au sonicateur va pulvériser la chromatine et n'en laisser que des débris. On peut séparer la plupart des protéines de la chromatine : en changeant la force ionique de la solution. on peut utiliser une simple ultracentrifugation après la lyse nucléaire pour se débarrasser de la chromatine (la chromatine intacte est un énorme réseau très visqueux : dans le culot, alors que la plus grande partie des protéines solubles :dans le surnageant). Mieux vaut se débarrasser de l ADN dès que possible. on peut opter pour un traitement aux nucléases (si on ne craint pas de traîner des nucléases derrière nous) ou encore choisir comme première étape de purification chromatographique un passage sur une résine de DEAE, chargée positivement, qui retiendra fortement l ADN chargé négativement.
Élimination précoce de ce qui n'est pas utile exemple de séparation des composantes cellulaires par centrifugation différentielle. Certaines organelles de la cellule sont plus denses que d'autres et plus à même de sédimenter à basse vitesse de centrifugation.
Séparation et enrichissement
Précipitation différentielle au sulfate d'ammonium Séparation fonction de la solubilité différentielle des protéines avec la force ionique de la solution qui les contient. Log S/S0 Zone d effet dissolvant «salting in» Zone de relargage «salting out» par neutralisation des charges ioniques de La suface de la protéine, compétition avec l eau. µ = ½ (Σ c z 2 )
La série de Hofmeister ci-dessous décrit les effets relatifs de différents ions sur la précipitation des protéines ou la promotion de leurs interactions hydrophobiques. (L'anion phosphate et le cation ammonium sont est les plus efficaces pour précipiter les protéines; l'anion chlorate et le cation Ca2+ sont au contraire les plus efficaces pour les remettre en solution. Notez que ce ne sont pas toutes les combinaisons de ces ions qui donnent un sel soluble). précipitation (salting out) PO 4 3- > SO 4 2- > COO - > Cl - > Br - > NO 3- > ClO 4 - chaotropique (salting in) NH 4+ > Rb + > K + > Na + > Cs + > Li + > Mg 2+ > Ca 2+
Le sel le plus utilisé en laboratoire pour précipiter les protéines est le sulfate d'ammonium (NH 4 ) 2 SO 4. Sa solubilisation n'affecte pas la température de la solution (au contraire du NaCl, dont la solubilisation exothermique aide à faire fondre la glace dans les rues l'hiver), il ne dénature pas les protéines et ne coûte pas cher. Le tableau ci-dessous donne les quantités de (NH 4 ) 2 SO 4 requises pour atteindre le niveau de saturation à 0 C. (Le tableau indique auss i combien de sel ajouter à une solution qui en contient déjà).
Précipitation différentielle par variation du ph Log S µ = 0,01 µ = 0,001 phi ph
Dialyse But : changer la concentration en sels d'une solution protéique Dans une dialyse, les protéines dans une concentration de sels donnée sont séparées d'une solution à la concentration en sels différente par une membrane poreuse. Les pores de cette membrane peuvent avoir différentes tailles; certaines membranes ne laisseront passer que des ions alors que d'autres laisseront même passer de petites protéines (jusqu'à des poids moléculaires de 50 000 Da). la concentration en sels va s équilibrer de part et d'autre de la membrane. En utilisant un volume de tampon de dialyse beaucoup plus grand que celui de la solution protéique, on changera rapidement la teneur en sels de celle-ci en la même que celle du tampon de dialyse..
Filtration sur membrane changer la salinité d'une solution de protéines On y utilise des membranes avec une porosité permettant à certaines substances de passer (sels, petites molécules, petites protéines). Les protéines sont déposées dans la partie supérieure du tube, et reposent sur la membrane; le tube est alors centrifugé à basse vitesse pour forcer le liquide et les petites molécules à traverser cette dernière sous le coup de la gravité. Les protéines, trop grosses, ne peuvent pas passer et restent dans la partie supérieure; on peut ensuite soit les diluer avec un nouveau tampon et recentrifuger (c'est une bonne technique de lavage) ou récupérer les protéines concentrées.
Filtration Techniques Ø des pores (nm) Pression (bars) Dimension des particules (nm) Masse Molaire (da) microfiltration 80 1 000 0,3-3 50 1 M Bactéries, virus ultrafiltration 1-100 1-10 2-50 10 000 protéines Hyperfiltration 0,2-1 10-100 0,2-1 < 200 (osmose inverse) sels
Sédimentation Les protéines ont un coefficient de sédimentation défini par leur taille, leur forme et leur densité. On peut donc les séparer par ultracentrifugation en gradients de saccharose ou d'autres substances (CsCl).
Dans une centrifugation zonale, l'échantillon est déposé dans un tampon présentant un gradient de densité. Les protéines s'enfonceront et se sépareront dans le gradient en fonction de leur coefficient de sédimentation. Ce genre de séparation est particulièrement approprié pour la préparation de gros complexes protéiques qui sédimenteront beaucoup plus vite que leurs composantes individuelles. C'est une des excellentes façons d'exploiter la taille de tels complexes sans nécessairement avoir recours à une technique de filtration.
Dans une centrifugation isopycnique, le gradient de densité couvre un spectre qui inclue la densité de toutes les particules à séparer. Le matériel "flottera" alors dans le gradient à un niveau où sa densité est égale à celle du milieu ambiant. L'ADN a longtemps été préparé sur des gradients isopycniques de chlorure de césium. On peut aussi séparer les protéines sur CsCl. (Le CsCl forme spontanément un gradient dans un tube quand il est centrifugé à haute vitesse pendant 24-48hrs parce que les atomes lourds Cs+ ont tendance à decendre au fond). Comme ce gradient se forme spontanément, les particules à séparer peuvent être mélangées directment au CsCl avant la mise en tube: l'établissement du gradient de CsCl et la séparation isopycnique des particules se feront en même temps pendant la centrifugation.
On a souvent recours à un type de gradient isopycnique utilisant un gradient discontinu de saccharose: un coussin à haute teneur en saccharose (env. 80%) se trouvera dans le fond du tube, avec un coussin de 50% par dessus, puis un coussin de 25%, puis un coussin de 10%. Les particules qui traversent un coussin pourraient être arrêtées à la surface du suivant 10% 25% 50% 80%
Méthodes chromatographiques Analytique ou préparative Différentes classification: selon la nature des phases (liquide/solide ; gaz/solide..) selon la nature des intéractions Phase mobile Dépôt de l échantillon à séparer Phase stationnaire Eluat collecté
Filtration sur gel séparation des protéines selon leur taille utilisant un tamis moléculaire..
Application : estimer la masse molaire d un molécule. Soit une colonne avec un volume total V T constitué du : volume de solvant extérieur V M, appelé volume mort de la colonne volume de solide des particules V S volume interne de solvant dans les pores du gel V I, avec V T = V M + V S + V I Le soluté sort de la colonne avec un volume de rétention (vol. d élution), Ve, tel que : Ve = V M + Va avec Va volume interne accessible au soluté, Va est donc plus petit que V I ou encore Va = K V I, avec K compris entre 0 et 1.
Si K = 0 : le soluté ne pénètre pas du tout à l intérieur des pores parce qu il est trop gros (Ve = V M ) Si K = 1 : le soluté pénètre complètement dans le volume interne (Va = V I et Ve = V M + V I ) Si K est compris entre 0 et 1, le soluté pénètre partiellement, ce qui signifie que les pores n étant pas de taille rigoureusement constante, seule une partie du volume interne est réellement accessible. Afin de déterminer la Masse Molaire d un composé inconnu, ou plus précisément, le rayon de Stockes de la protéine hydratée volume hydrodynamique- on effectue une gamme d étalonnage à partir de protéines de masse molaire connues. Le volume mort de la colonne est déterminé en utilisant un composé de très grande masse molaire, par exemple le bleu dextran, qui sera totalement exclu de la colonne. Le volume total est déterminé par le volume de rétention de la plus petite molécule que peut exclure le gel. On trace ensuite un graphe K av = f(log MM) en fonction de la MM des étalons. K av = (V e V M ) / (V T V M )
Concentration Ve1 (Vo ) Vi1 volume Dépôt de l échantillon Pic d une molécule exclue du gel Pic d une molécule retardée par le gel Sephade x G25 G50 G75 G100 G150 G200 Domaine de fractionnement (kda) 1-5 1,5-3 3-80 4-100 5-150 5-600 peptides 100 à 10 000 Da ADN 10 000 à 150 000 Da petites protéines 10 00 à 100 000 Da protéines 1 à 1000 kda complexes multiprotéiques 10 à 100 000 kda
RQ : on parle plutôt d estimation de la MM que de détermination précise, car l hypothèse de base est que la protéine étudiée est globulaire. Si ce n est pas le cas, on peut contourner le problème en dénaturant la protéine (urée, cholure de guadinium) ce qui permet d obtenir un pelote statistique.
Échange d'ions Elution : variation de ph (gradient) ; variation de la concentration en sel (gradient de sel)
Interactions hydrophobes Rétention des protéines à caractère hydrophobe sur des résines portant des groupements hydrophobes (cycliques ou aliphatiques: ex octyl ou phényl sépharose). Dans des conditions de force ionique élevé, les intéractions hydrophobes sont favorisées (peut donc être utilisée directement après une échangeuse d ions) Hydroxyapatite L'hydroxyapatite est du phosphate de calcium cristallisé comme nos dents en contiennent. Cette substance retient les protéines de deux façons: son calcium interagit avec les groupements acides des protéines alors que son phosphate interagit avec leurs groupements aminés. L'élution n'est pas ici faite avec un gradient de sel mais plutôt avec un gradient de phosphate ou de potassium pour entrer en compétition avec ces interactions.
affinité Reconnaissance moléculaire spécifique : enzyme / substrat ; coenzymes ; inhibiteur antigènes / anticorps recepteur / hormone ; toxine glycoprotéines / lectines métaloprotéines/ métal
Immobilisation du ligand sur la phase stationnaire Support + agent de couplage bras espaceur * Support activé ligan d Ligand immobilisé Adsorption spécifique lavag e Elution Ligand immobilisé + mélange à séparer Molécule retenue par affinité Par un ligand de plus forte affinité, ou en plus grande concentration ou par dénaturation
DOSAGES ET SUIVI DE PURIFICATION
savoir à chaque étape où est la protéine : vérifier la présence aussi bien que l'activité d'une protéine, Les premières étapes se contentent généralement de vérifier la présence de protéines (n'importe lesquelles) par spectroscopie par exemple; Ensuite, vérifier la présence d'une protéine particulière ou de son activité. Quoiqu'il en soit, il est impératif de toujours, toujours garder des aliquots de matériel à chaque étape! De cette manière, on peut retracer après coup le déroulement de la purification, comprendre quelles en sont les étapes les plus utiles ou les plus dommageables, et améliorer notre protocole pour l'avenir.
Présence de protéines (en général) (A) Par mesure de l'absorption aux UV à 280 nm. Souvent utilisé après une série de colonnes de chromatographie. Tous les systèmes de chromatographie sont équipés d'une cellule spectrophotométrique pour mesurer l'absorption des rayons UV par le matériel qui sort des colonnes. méthode simple : de type réponse "oui, ou "non, Tous les peptides pourraient absorber l'uv aux environs de 190-200nm, mais la plupart des tampons absorbent aussi massivement dans cette région qui n'est donc pas très commode pour nous. Notez que le coefficient d'extinction de chaque protéine variera selon sa richesse en W et Y. Une protéine dépourvue de ces acides aminés passerait devant la cellule optique comme un fantôme. On peut utiliser le spectro pour détecter la présence de protéines via l absorption du tryptophane (Trp, W), de la tyrosine (Tyr, Y) et à un degré moindre, la phénylalanine. attention : l'adn et l'arn absorbent vers 250-260nm,
B) Par Méthodes colorimétriques. traitement de l'échantillon par une substance chimique qui, au contact des protéines, produira un changement de couleur quantifiable par spectrophotométrie via la loi de Beer-Lambert une courbe standard faite avec des quantités connues de BSA convient tout à fait, mais pour des protéines plus pures il vaut mieux s'assurer de disposer d'une courbe standard dont le comportement représente bien celui de notre protéine. Exemple de courbe standard: la mesure de la densité optique (DO) de plusieurs échantillons avec une concentration croissante en protéines
Méthode du Biuret Basée sur la réduction du cuivre Cu2+ en Cu+. Cu+ réagit avec le tryptophane (Trp, W), la tyrosine (Tyr, Y) et la cystéine (Cys, C). Il leur donne une couleur bleue. Le pic d'absorption pour un test du biuret est à 550nm. Ce test est peu sensible. Il résiste assez bien aux différents composés présents dans les tampons mais est sensible aux sels d'ammonium, ce qui en fait un mauvais choix pour doser les protéines venant d'être précipitées par ce sel.
Méthode de Folin Lowry Basée sur la réaction du biuret, elle utilise aussi la réduction du Cu2+ en Cu+. Dans la méthode de lowry, le Cu+ est utilisé pour réduire le réactif de Folin (une solution phénolique contenant des composés de tungstène et de molybdène) qui change sa couleur du jaune au bleu. On lit la réaction à 750 nm. Plus sensible que la réaction du biuret, la méthode de Lowry est utilisée pour des quantités de 2 100 ug. Elle est sensible à plusieurs agents, dont l'edta, le DTT, le β-mercapto, l'hepes, le Tris, le triton X-100, le NP-40, etc.
Méthode de Bradford Le bleu de Coomassie se lie à l'arginine (Arg, R), la tyrosine (Tyr, Y), le tryptophane (Trp, W), l'histidine (His, H) et la phénylalanine (Phe, F) ( à R; huit fois plus qu'aux autres). Il est assez insensible aux agents des tampons, mais est sensible aux détergents. En solution, il a une forme cationique rouge qui absorbe à 470nm. Lié aux protéines, il a une forme anionique bleue qui absorbe à 595nm. Parce que les deux spectres d'absorption se chevauchent un peu, une courbe standard de Bradford n'est pas parfaitement linéaire. La méthode de Bradford est encore plus sensible que celle de Lowry (0,2 20 ug de protéines).
Dosage par la méthode du BCA The BCA Protein Assay is a detergent-compatible formulation based on bicinchoninic acid (BCA) for the colorimetric detection and quantitation of total protein. This method combines the wellknown reduction of Cu+2 to Cu+1 by protein in an alkaline medium (the biuret reaction) with the highly sensitive and selective colorimetric detection of the cuprous cation (Cu+1) using a unique reagent containing bicinchoninic acid.1 The purple-colored reaction product of this assay is formed by the chelation of two molecules of BCA with one cuprous ion. This water-soluble complex exhibits a strong absorbance at 562 nm that is nearly linear with increasing protein concentrations over a broad working range (20-2,000 µg/ml). The BCA method is not a true end-point method; that is, the final color continues to develop. However, following incubation, the rate of continued color development is sufficiently slow to allow large numbers of samples to be assayed together. The macromolecular structure of protein, the number of peptide bonds and the presence of four particular amino acids (cysteine, cystine, tryptophan and tyrosine) are reported to be responsible for color formation with BCA.2 protein concentrations generally are determined and reported with reference to standards of a common protein such as bovine serum albumin (BSA). A series of dilutions of known concentration are prepared from the protein and assayed alongside the unknown(s) before the concentration of each unknown is determined based on the standard curve. If precise quantitation of an unknown protein is required, it is advisable to select a protein standard that is similar in quality to the unknown; for example, a bovine gamma globulin (BGG) standard may be used when assaying immunoglobulin samples.
Présence de protéines particulières Caractérisé la présence de la protéine recherchée : critères : 1) sa taille 2) sa charge. 3) son activité Méthode analytique : électrophorèse
Électrophorèse sur gel de polyacrylamide en condition dénaturante (SDS, β- mercaptoethanol, urée ) PAGE-SDS analyse de la taille des protéines électrophorèse : déplacements de particules chargées sur ou dans une matrice soumise à un courant électrique continu. Séparation selon la charge!. Il serait avantageux, comme ce l'est pour l'adn, de pouvoir séparer les protéines les unes des autres par une simple séparation électrophorétique ne dépendant que de la taille des molécules. Mais alors que l'adn est uniformément chargé et que sa structure est essentiellement la même quand il est sous forme linéaire, les protéines, elles, varient énormément non seulement en poids mais aussi en charge et en forme. Pour les séparer selon leur masse uniquement, il faut contrecarrer l'effet de leur charge et de leur forme.
sodium dodecyle sulfate, SDS (or SLS): CH 3 -(CH2) 11 - SO 4 - CH 3 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -SO 4 - SDS (1%) A chaud Tous les polypeptides sont dénaturés Tous les polypeptides ont la même charge (par unité de longueur) Tous les polypeptides sont soumis à la même force électromotrice dans le champ électrique (migration vers l anode) Separation basée sur l effet de tamis moléculaire du gel de polyacrylamide gel : separation selon la taille (MM!)
Reduction des ponts disulfures S-S (β-mercaptoethanol) 2 HO-CH 2 -CH 2 -SH (action réversible) HO-CH 2 -CH 2 -S-S-CH 2 -CH 2 -OH + -SH HS- Ex : ribonucléase Plus de β-mercaptoethanol
Gel discontinu Pores plus petits Gel : polyacrylamide, (agarose : ADN)
La taille des pores dans un gel de polyacrylamide est fonction du degré de pontage entre les chaînes d'acrylamide, pontage qui est proportionnel à la quantité de N,N,N',N,-méthylène bisacrylamide dans le gel; plus il y en a, plus les chaînes sont pontées et plus petits sont les pores.
Lors du dépôt du mélange de protéines Dans le gel : des ions chlorure Dans le tampon : des ions glycine. Les ions glycine à ph 6,8 (gel de concentration) : très faible mobilité (cf phi) Les ions chlorure : une grande mobilité Les protéines chargées par le SDS sont plus lentes que le chlorure mais plus rapides que la glycine.
Lors de l application du courant 1) Dans le gel de concentration (stacking gel)
2) Dans le gel de séparation (running gel) Plus une molécule est massive ou volumineuses, plus elle se déplacera lentement; plus elle sera petite, plus elle ira vite
la révélation par coloration spécifique des protéines par un anticorps spécifique (une réaction chimique quelconque donnant un résultat visible) pour une protéine particulière 1) Directement sur le gel (le plus fréquent) bleu de Coomassie (toutes protéines) au nitrate d'argent (réduction de sels d Ag, beaucoup plus sensible, pas toutes les protéines et interférences) 2) Après transfert sur un support solide : le blotting Supports : papier nitrocellulose Mode de transfert : électrotransfert (electroblotting) sous pression (buvardage) Révélation : anticorps monoclonal puis un deuxième conjugué = Western-Blot (Northern-blot / ARN ; Southern-blot / ADN)
«marqueurs moléculaires» ie : protéines étalons de masse molaires connues
Identification de masse molaire Conditions dénaturantes à différents niveaux de structure Comparaison à la MM en condition non dénaturante Interprétations structurale
Remarques sur la dénaturation des protéines globulaires Actions réversibles Agents dénaturants : acides ; bases ; urée ; chlorure de guanidine Actions irréversibles La chaleur ; les agents dénaturants dans des conditions drastiques
Isoélectrofocalisation IFE (Iso Focussing Electrophoresis) Sur colonne, sur plaque Séparation analytique selon le phi ph basique - - - cathode ph acide + + + anode Un gradient stable de ph (solution d ampholites) dans le gel Ajout de la solution protéique à séparer et (ré- )application de E Mise en évidence après coloration de la distribution des protéines dans la zone de ph correspondant à leur phi
Electrophorèse bi-dimensionelle Séparation analytique selon 2 critères indépendants Exemple : Isofocalisation Première dimension Deuxième dimension PAGE-SDS
Définition des activités : U ou UI : unité (international!) enzymatique : Quantité d enzyme qui transforme 1µmol de substrat par minute à 25 C. Activité : activité relative à la quantité totale de protéines dans le milieu Activité spécifique : activité ramenée à 1mg de protéines (U/mg = µmol de substrat transformé par min par mg de protéine) Unité internationale : mol.s -1.mg -1 (mol.s-1 = le katal)
Expression du suivi de la purification Procédé Volume (ml) Protéine (mg) Activité (U ou UI) Activité Spécifique (U/mg ou UI/mg) Extrait cellulaire brut 1 400 10 000 100 000 10 Précipitation au (NH 4+ ) 2 SO 4 2+ 280 3 000 96 000 32 Chromatographie échangeuse d ions 90 400 80 000 200 Tamisage moléculaire (gel filtration) 80 100 60 000 600 Chromatographie d affinité 6 3 45 000 15 000
Le rendement = Activité au stade i Activité au stade initial (ou précédent) X 100 Facteur de purification (enrichissement) = AS au stade i AS au stade initial (ou précédent)
Tableau de purification Procédé Volume (ml) Protéin e (mg) Activité (U) A S (U/mg) R (%) F Extrait cellulaire brut 1 400 10 000 100 000 10 Précipitation au (NH 4+ ) 2 SO 4 2+ 280 3 000 96 000 32 96 3,2 Chromatographie échangeuse d ions 90 400 80 000 200 80 20 Tamisage moléculaire (gel filtration) 80 100 60 000 600 60 60 Chromatographie d affinité 6 3 45 000 15 000 45 1500
STRATEGIE : A adapter selon le degré de pureté requis Selon le domaine d application Coût de purification Agro-alimentaire ~ 95% Pharmaceutique-médical Diagnostic 99 à 99,5 % Thérapeutique > 99,9%
Exemples
Purification standard de l acétylcholinestérase Etape Activité spécifique (µmol.min -1 mg -1 ) Rendement (%) Homogénat de tissu frais Extraction et précipitation par le sulfate d ammonium DEAE-cellulose Concentration et dialyse Séphadex G-200 Echangeuse de Cations DEAE-cellulose 16,7 520 2 330 2 420 4 170 6 830 7 910 100 52 50 43 25 16 Mesure de l activité : acétylcholine + H20 acide acétique + choline
Purification de l acétylcholinestérase par chromatographie d affinité Etape Activité spécifique (µmol.min -1 mg -1 ) Rendement (%) précipitation par le sulfate d ammonium Chromatographie d affinité 470 9 750 (100) 70 Particule d agarose (CH 2 ) 5 O C-NH- -N + -(CH 3 ) 3 Inhibiteur comptétif
Protéines recombinantes (interféron) Extraction d E. coli par broyage mécanique Précipitation par polyéthylènimine surnageant Précipitation au sulfate d ammonium Dialyse Chromatographie par immunoadsorption (anticorps monoclonaux) Chromatographie par échange de cations
Hormones de croissance Extraction d E. coli par broyage mécanique Précipitation par polyéthylènimine surnageant Précipitation au sulfate d ammonium dissolution Chromatographie sur cellulose échangeuse d anions Chromatographie sur cellulose échangeuse d anions Précipitation au sulfate d ammonium Filtration sur gel Séphacryl S-200
Un polysaccharide d intérêt industriel : le Xanthane (10 000 T/an) Bouillon de culture (Xanthomonas sp.) PS extracellulaire Traitement à la chaleur (100 C) distillation Gomme de xanthane Précipitation (sels) ou concentration (solvants) et lavage Pressage ou centrifugation, séchage Xanthane en poudre
Une enzyme purifiée : pour quoi faire? Un cristal? Analyse par diffraction des RX! Elucidation de la structure 3D Etude de son mécanisme (vérification des hypothèses obtenues par les études cinétiques)
Exemple de la chymotrypsine Synthétisée dans le pancréas sous forme d un précurseur inactif (chymotrypsinogène) et activée dans l intestin grêle sous l action de protéases Activité : hydrolyse les liaisons peptidiques côté NH (côté C-ter ; «après») les acides aminés aromatiques (phe, tyr, trp) principalement et dans une moindre mesure après d autres AA très hydrophobes (met, leu) ; peut également agir sur des esters carboxyliques. MM ~ 25 kda ; 3 chaînes polypeptidiques liées par des ponts disulfure ; grand nombre de feuillet β anti-parallèle ; site actif dans une dépression («trou») : ser 195 his 57 asp 102. Ce site actif est commun à d autres enzymes : protéases à serine (asp ou glu)
Diffraction des RX : pourquoi la chaîne latérale de la ser 195 (site actif) est-elle aussi réactive? Comment le substrat se fixe sur l enzyme? Pourquoi la chymotrypsine présente une spécificité différente des autres protéases à sérine? Comment est activé le chymotrypsinogène?
Comment le substrat se fixe sur l enzyme? Co-cristallisation de l enzyme en présence d un substrat avec faible affinité ou d un analogue de substrat inhibiteur comme le N-formyl tryptophane H CHO N CH - C CH 2 O O H (NH X)
Site de fixation du substrat Ser 214 Gly 193 Ser 195 Gly 216 H CHO N CH - C CH 2 O O H (NH X) Gly 226 Ser 189 1) Poche avec des chaînes latérales Non polaires 2) Stabilisation du NH peptidoïque par LH avec une ser (214) et du CO soit par une gly (193) ou NH de la sérine catalytique (ser 195)
Pourquoi la chymotrypsine présente une spécificité différente des autres protéases à sérine? Trypsine (coupure de liaison peptidique après les AA basiques) Elastase (coupure après les chaînes hydrophobes courtes) Gly 216 Gly 226 Gly 216 Gly 226 Val 216 Thr 226 Ser 189 Asp 189 Ser 189 chymotrypsine trypsine Elastase
Comment est activé le chymotrypsinogène? Le chymotrypsinogène est le précurseur inactif de la chymotrypsine le site actif y est déjà présent les 3 chaînes polypeptidiques occupent quasiment les mêmes positions Le site de liaison n est pas encore formé, le substrat ne peut donc être positionné correctement et bénéficier de l activation de la sérine 195
Action de la Trypsine (après arg 15) : π chymotrypsine Autodigestion après leu 13, tyr 146, asn 148.
pourquoi la chaîne latérale de la ser 195 (site actif) est-elle aussi réactive?
principe Chaque atome peut induire la diffraction de rayons X incidents. Les rayons déviés se répartissent dans l'espace. Les rayons déviés les différents atomes font de l'interférence; La succession d'interférence constructrices et destructrices donne le graphique du milieu; vue en 2D elle donne la figure du bas, ci-contre. En combinant le profil de diffraction d'un cristal obtenu à partir de différents angles, on obtient assez d'information pour nous aider à déterminer l'agencement des atomes de la protéine dans l'espace.
Les bases requises pour la diffraction des R-X des protéines (cristallographie) Les bases Cristaux d enzyme Dérivation isomorphe par un atome lourd Ordinateur puissant Structure Primaire commentaires Taille env. 0.5 mm et plus. Obtention par des changements progressifs de force ionique ou de polarité de la solution enzymatique. Doit être stable dans le faisceau X pendant le temps de l expérience. Parfois impossible d obtenir un cristal. Cristallisation par screening à haut debit Nécessaire pour obtenir les infos sur la phase.(+ d électrons : + de diffraction) Modification chimique SANS DISTORSION DE LA STRUCTURE : altération des intensités pas des positions de diffractions. Calcul de la carte de densité électronique d après les informations sur l intensité, la position et les phases des rayons X diffractés. La séquence en AA est nécessaire pour interpréter la carte de densité électronique en terme d arrangements des atomes (cf structure covalente)
La spectrométrie de masse Détermination précise de la masse... Pour une protéine de 40 000 Da, le spectromètre de masse peut indiquer une masse qui n'aura une marge d'erreur que de 4 Da!!! (détecter le changement d'un acide aminé en un autre, ou encore la présence d'un groupement hydroxyl supplémentaire). Après digestion enzymatique d une protéine et séparation sur gel-sds, les fragments peuvent être analysées en SM. Les masses résultantes sont comparées avec la masse de toutes les séquences polypeptidiques codées par les cadres de lecture du génome qui nous intéresse, et identifier celles qui coïncident.
source E ; B. On distingue plusieurs systèmes de spectrométrie de masse selon la technique d'ionisation et la technique de détection
Le dichroïsme circulaire La spectroscopie par dichroïsme circulaire permet d'étudier la structure secondaire (hélices, feuillets, etc.) de polypeptides et de protéines en solution. Cette technique utilise peu de matériel et ne le détruit pas. Les changements dus aux conditions ambiantes de ph, d'agents dénaturants et de température peuvent être détectés. La technique repose sur la capacité des structures optiquement actives d'absorber de façon inégale la lumière polarisée circulairement à droite de la lumière polarisée circulairement à gauche.
La forme du spectre obtenu pour une protéine peut être décomposée en ses trois composantes: (a) hélicale, (b) en feuillet, (c) aléatoire. Chaque composante donne une courbe spectrale caractéristique.
Spectroscopie par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) On utilise la RMN pour étudier la structure de petites protéines (jusqu'à 30 KDa environ) en solution sans avoir besoin à les cristalliser.. Résonance : «retour»(transition) des noyaux (spin non nul) d'un niveau d'énergie plus élevé (après absorption de l énergie d un champ de radiofréquence) à son niveau d'énergie antérieur. L'environnement des noyaux influencera la façon dont ils se comportent quand on les irradie à la longueur d'onde appropriée; la RMN permet donc de déterminer la nature des liens entourant un atome. RMN des solides pour les protéines membranaires
Prédiction des structures : approche bioinformatique Prédiction de la structure 2D à partir de la structure 1D méthodes statistiques (à partir de structure 3D connues, tables d occurrences / proportions de chacun des 20 AA dans un état structural donné) relation entre propriétés physico-chimiques des AA méthode des plus proches voisins (similarité entre sous-séquences) L influence de la structure 3D sur la structure 2D n est pas prise en compte
Prédiction de la structure 3D à partir de la structure 1D Comparaison de la séquence avec des banques de données (homologie ; motifs ; domaines) Si la protéine étudiée partage plus de 30% d AA avec une protéine répertoriée (alignement des séquences) : structures 3D proches Modèle structurale à partir de la protéine connue (modélisation moléculaire)
Prédiction de la structure 3D à partir de la relation structure-fonction basée sur des données biologiques expérimentales et analogie de fonction (activités enzymatiques, interactions moléculaires, )
Microscopie de force atomique (AFM) technique non-destructrice permettant de relever des détails topographiques à très petite échelle (formes des molécules) le déplacement d une sonde sur la surface de l échantillon est suivie par la déviation du tracé d'un rayon laser qui rebondit en permanence sur sa surface réfléchissante et se rend jusqu'à un photodétecteur. La microscopie de force atomique a permis de visualiser la structure de la chromatine, la position de polymérases sur l'adn,
On distingue trois types d'afm, dépendant du mouvement de la sonde : En mode Contact ou répulsif, la sonde est en contact avec l'échantillon. La force appliquée sur le levier est fonction de la forme de l'échantillon. En mode Sans Contact, la sonde ne touche pas l'échantillon mais est maintenue au-dessus de celui-ci, à 50-150 Angstroms. Les forces de Van der Waals entre la sonde et l'échantillon créent une tension entre les deux, et la mesure de cette tension permet d'établir la forme de l'échantillon. Le mode sans contact est utile pour les échantillons fragiles que la sonde pourrait endommager en les touchant. En tapping mode la sonde monte et descend très rapidement (50 000-500 000 Hz). Quand la sonde est au dessus d'une bosse, elle a moins d'espace pour osciller; quand elle est au dessus d'un creux, elle en a davantage. Ces variations permettent d'établir le profil de l'échantillon. Ce mode a l'avantage de ne pas "traîner" le long de l'échantillon, ce qui évite les problèmes causés par les interactions électrostatiques, par l'adhésion, par la friction, et la plupart des problèmes rencontrés d'habitude par les deux autres modes.