Labogena Quelles améliorations apporter aux protocoles de congélation de semence? Elisabeth Blesbois, INRA, UMR-PRC
WP2.2 CRB-Anim : Développements biotechnologiques reproductifs Objectif : obtenir des cellules de reproduction cryoconservées qui permettent de conserver et de valoriser la diversité génétique Les cellules «cibles» : gamètes (spermatozoïdes, ovules), cellules germinales diploïdes, embryons et larves, cellules et tissus somatiques à reprogrammer en cellules germinales
Trois points critiques majeurs : 1) Le potentiel reproducteur des cellules cryoconservées (ex : pouvoir fécondant des spermatozoïdes) 2) La conformité génétique et phénotypique des descendants (inclut épigénome) 3) Les conditions de biosécurité de la conservation
Semence : verrous et livrables Verrous: 1) - adapter les méthodes de cryopréservation : a) aux races d intérêt qui sont faiblement fertiles, b) aux espèces «réfractaires» aux méthodes classique; 2) - améliorer et standardiser les méthodes de cryopréservation et les systèmes d évaluation de la qualité de la semence Livrables: - Un jeu de critères pertinents de prédiction de la fertilité post décongélation pour les oiseaux et les mammifères, - Une méthode de cryopréservation de la semence chez l âne, différentes espèces aviaires (dindon,..), le mollusque Pecten maximus. Attendu : minimum 40 % de fertilité avec sperme décongelé
Semence /Methodes Mise au point procédures de cryopréservation : (Espèces ou la procédure est encore inefficace) Focus Semence Ane Dindon, Pintade Canards de barbarie, de Pékin, Mollusques (pecten) - Pour toutes les especes : standardisation des méthodes; - Pour toutes les especes : s affranchir des produits animaux dans les milieux de conservation - Spécifique produits de la mer (coquille St Jacques, mollusques), stockage à des températures réfrigéréres Qualité des semences avant-après cryopreservation (évaluation du potentiel reproducteur + épigénétique) - Motilité (tous) - Intégrité membrane plasmique /acrosome si existe (tous) - Stress oxydant, Activité de kinase carrefour métabolique, proteome (oiseaux) - DNA/histone methylation (poissons, oiseaux, mammifères) - Taux de fécondation, de développement embryonnaire Méthodes de régénération - Taux de fécondation, de développement embryonnaire, voir suivis épigénétiques particuliers
Ex 1 : mise au point de la congélation dans une nouvelle espèce Méthodologie : Tests en conditions standardisées de différents cryoprotecteurs, milieux, vitesse congélation-décongélation, conditions zootechniques d insémination Sur cet exemple, la fertilité obtenue est la plus élevée avec la combinaison du milieu BHSV myo-inositol)/cpa DMF IA Traitement FEB-DMA Fert (%) N oeufs (F/I) FEB-DMF Fert (%) N oeufs (F/I) BHSV-DMA Fert (%) N eggs (F/I) BHSV-DMF Fert (%) N oeufs (F/I) Fertilité (%) N oeufs (F/I) 39.5 c 28/65 52.0 b 106/204 52.8 b 105/199 65.0 a 134/206
Suppression de produits animaux Ex 1. Chez les équidés, mettre au point des milieux de stockage, disponibles prêts à l emploi et de composition chimique la plus définie possible. Milieu INRA96 (affranchi du lait) INRA Freeze (congélation, affranchi du jaune d œuf entier) Objectif : s affranchir du plasma de jaune d oeuf Outil : liposomes Ex 2 : Milieu Stem Alpha (lapin, ruminants)
23,87% 21,54% Exemple 3 : Apport de la protéomique pour évaluer les effets de la cryopréservation, modèle Gallus gallus Profiling par Intact Cells MALDI-TOF MS Spermes cryopréservés -Les phénotypes sont mieux séparés après cryopréservation 31,52% - 54 m/z diffèrent pour tous les coqs entre spermes frais et congelés Spermes Frais 38,62%
Conclusion Labogena - La semence restera la première méthode de conservation des gamètes au moins chez les mammifères et les oiseaux. - Des améliorations continues sont à apporter aux méthodologies de conservation de la semence en levant des verrous successifs. - Plusieurs «challenges» importants sont communs à toutes les espèces de rente (biosécurité, méthodes d évaluation de qualité cellulaire, transfert génome et épigénome).