LA REVUE DES TECHNOLOGISTES MÉDICAUX DU QUÉBEC Numéro de convention de la Poste-publication 40012566 RÉSOLUTION DE PROBLÈMES AU LABORATOIRE D'ANATOMOPATHOLOGIE Photo : Martine Chalifoux, T.M., CSSS Richelieu-Yamaska 1 DÉCEMBRE 2013 LE LABEXPERT DÉCEMBRE 2013 VOL. 4 N O 4
Spécial détachable IN VIVO RÉSOLUTION DE PROBLÈMES AU LABORATOIRE D'ANATOMOPATHOLOGIE Cet outil propose des pistes de solutions aux problèmes les plus fréquemment rencontrés au laboratoire d anatomopathologie lors de la préparation et la coloration des lames de routine. Il ne remplace pas la consultation du manuel du fabricant ou l intervention de personnel spécialisé, comme le département de génie biomédical ou le support technique du fabricant. LE LABEXPERT DÉCEMBRE 2013 7
IN VIVO RÉSOLUTION DE PROBLÈMES AU LABORATOIRE D'ANATOMOPATHOLOGIE I I SECTION I : RÉSOLUTION DES PROBLÈMES RENCONTRÉS LORS DE LA COUPE AU MICROTOME Le tissu est généralement difficile à couper. Le tissu est dense ou dur (non calcifié). Le tissu contient des calcifications pouvant avoir une incidence sur le diagnostic. La décalcification est absente ou insuffisante. Le fragment de tissu est trop épais ou trop gros. Il y a trop de fragments dans la cassette. Les solutions du circulateur sont trop usées ou le volume dans les bains de réactifs est insuffisant. Le tissu peut être refroidi à nouveau et coupé sur une nouvelle section du rasoir. Pour les tissus très denses comme l utérus et les ongles, les traiter après le rabotage avec un émollient ou un dékératinisant. Revoir le protocole de circulation et réduire au besoin la température des solvants dans le circulateur. Revoir le protocole de circulation et réduire au besoin le temps d exposition dans la paraffine liquide ou dans les solvants. En fonction du diagnostic, consulter le pathologiste pour déterminer s il a lieu de décalcifier le tissu. Une décalcification sur le bloc de paraffine peut être réalisée après le rabotage en choisissant l agent décalcifiant en fonction du type de tissu. Placer le bloc dans un agent décalcifiant et vérifier la décalcification régulièrement. Bien rincer le bloc afin d éviter que le liquide décalcifiant n endommage le microtome. Si le tissu est trop calcifié, refaire la circulation à l inverse, décalcifier le tissu, circuler et inclure à nouveau. Après consultation avec la personne ayant fait la description macroscopique, couper les fragments qui sont trop épais ou trop gros. S assurer de soumettre les fragments à une épaisseur maximale de 3 à 5 mm. Faire fondre la paraffine et soumettre les fragments dans plusieurs cassettes. Effectuer le processus de circulation à l inverse et circuler à nouveau en s assurant de changer et de bien remplir les bains de réactifs dans le circulateur. Vérifier et corriger au besoin le protocole de circulation. La fixation est inadéquate. L orientation des fragments lors de l inclusion n est pas optimale. La fixation étant une étape irréversible, le problème ne peut être corrigé. Revoir et respecter les délais de fixation, le volume utilisé et l état du fixateur (usure, contamination, etc.) afin d éviter que la problématique ne se reproduise. Positionner les fragments afin de couper les structures les plus fermes en dernier comme, par exemple, la muqueuse de l intestin, l épiderme de la peau. Positionner les fragments pour couper en premier la partie plus épaisse des fragments irréguliers. Positionner les fragments pour former une pointe lorsque la forme le permet. Positionner les fragments afin qu ils ne se touchent pas entre eux et tous les positionner selon la même orientation. 8 DÉCEMBRE 2013 LE LABEXPERT
IN VIVO SECTION I : RÉSOLUTION DES PROBLÈMES RENCONTRÉS LORS DE LA COUPE AU MICROTOME (SUITE) Le ruban ne se forme pas. Le biseau du rasoir est émoussé. Déplacer le rasoir latéralement afin d utiliser les sections encore intactes ou changer de rasoir. Utilisation d un rasoir jetable neuf; recouvert d une fine couche de lubrifiant qui rend la formation d un ruban plus difficile en début de coupe. Glisser le biseau du rasoir sur un bloc de paraffine avant de le fixer au microtome afin d enlever le surplus de lubrifiant. Il y a un mouvement trop faible ou inexistant de retrait du porte-objet ou du porterasoir (selon les modèles). Procéder aux ajustements nécessaires selon les instructions du fabricant. est trop grand. Les coupes sont trop épaisses. Vérifier le réglage de l épaisseur des coupes. Il y a présence d électricité statique. La meilleure façon de prévenir les problèmes attribuables à l électricité statique est d avoir un taux d humidité et une température ambiante adéquate dans le laboratoire. Faire fonctionner un humidificateur près du poste de microtomie. La température ambiante ne devrait pas dépasser 22 C. Garder la zone du microtome propre. Vaporiser un produit antistatique en aérosol sur le bloc de paraffine et sur le rasoir. Éviter la statique sur les vêtements. Le ruban est incurvé. La paraffine est trop dure. Le bloc de paraffine est mal positionné dans le porte-objet. Revoir le type de paraffine utilisé. Replacer le bloc dans le porte-objet. Vérifier si un excédent de paraffine empêche le bon positionnement du bloc dans le porte-objet. Le porte-objet est mal ajusté. Réajuster le porte-objet. Le rasoir est mal positionné. Replacer le rasoir correctement. Le biseau du rasoir est irrégulier ou émoussé par endroits. Déplacer le rasoir latéralement afin d utiliser les sections encore intactes ou changer de rasoir. Des fragments de consistances différentes sont dans le même bloc. Inclure les fragments à nouveau dans des blocs de paraffine séparés. Les coupes sont d épaisseurs différentes. Le microtome «saute» des coupes (course à vide). L un des composants du microtome est instable. Le tissu est très dense (par exemple, utérus, os, ongles). est mal ajusté. Ajuster correctement tous les assemblages vissés et toutes les vis ou les leviers de serrage. Traiter le tissu après le rabotage avec un agent émollient, décalcifiant ou dékératinisant. Utiliser un rasoir plus rigide. Le bloc de paraffine est trop ou insuffisamment rempli; le bloc ne sera pas bien retenu dans le porte-objet. Enlever le surplus de paraffine ou faire fondre le bloc et enrober à nouveau en utilisant une quantité adéquate de paraffine. La vitesse de coupe est irrégulière. Maintenir une vitesse de coupe lente et régulière sans arrêt durant la coupe. Le bloc de paraffine est trop chaud. Refroidir le bloc de paraffine. LE LABEXPERT DÉCEMBRE 2013 9
SECTION I : RÉSOLUTION DES PROBLÈMES RENCONTRÉS LORS DE LA COUPE AU MICROTOME (SUITE) Une coupe présente des zones d épaisseurs variables (effet planche à laver). La coupe est trop épaisse. Les coupes sont fortement comprimées ou plissées. Le tissu est dense ou dur (non calcifié). Le tissu contient des calcifications pouvant avoir une incidence sur le diagnostic. Le rasoir ou le bloc de paraffine sont mal stabilisés. La décalcification est absente ou insuffisante. La vitesse de coupe est irrégulière. est trop grand. Le microtome est mal ajusté. La première coupe du ruban est utilisée. Le bloc de paraffine est trop chaud. La vitesse de coupe est trop rapide. Des résidus de paraffine adhèrent au biseau du rasoir. Le biseau du rasoir est émoussé. Le tissu n est pas étiré lors de la coupe. Le rabotage est trop épais. L imprégnation est incomplète ou le tissu est plus mou que la paraffine. Le bloc est trop chaud. La coupe est sélectionnée tout de suite après le rabotage. La température ambiante est trop élevée. La vitesse de coupe est trop rapide. est insuffisant. La paraffine est de mauvaise qualité. Le tissu peut être refroidi à nouveau et coupé sur une nouvelle section du rasoir. Pour les tissus très denses comme l utérus et les ongles, les traiter après le rabotage avec un émollient ou un dékératinisant. Revoir le protocole de circulation et réduire au besoin la température des solvants du circulateur. Revoir le protocole de circulation et réduire au besoin le temps d exposition dans la paraffine liquide ou dans les solvants. En fonction du diagnostic, consulter le pathologiste pour déterminer s il a lieu de décalcifier le tissu. Ajuster correctement tous les assemblages vissés et toutes les vis ou les leviers de serrage. Une décalcification sur le bloc peut être réalisée après le rabotage en choisissant l agent décalcifiant en fonction du type d échantillon. Placer le bloc de paraffine dans un agent décalcifiant et vérifier la décalcification régulièrement. Bien rincer le bloc afin d éviter que le liquide décalcifiant n endommage le microtome. Si le tissu est trop calcifié, refaire la circulation à l inverse, décalcifier le tissu, circuler et inclure à nouveau. Maintenir une vitesse de coupe lente et régulière sans arrêt durant la coupe. Ajuster correctement tous les assemblages vissés et toutes les vis ou les leviers de serrage. Effectuer quelques coupes (polissage du bloc) avant d effectuer la coupe définitive. Refroidir le bloc. Maintenir une vitesse de coupe lente et régulière sans arrêt durant la coupe. Nettoyer prudemment le biseau du rasoir. Déplacer le rasoir latéralement afin d utiliser les sections encore intactes ou changer de rasoir. Étirer le ruban au fur et à mesure qu il se forme. Souffler délicatement sur la coupe qui se forme peut faciliter l étirement du tissu. Diminuer l épaisseur et la vitesse de rabotage. Si le tissu est instable dans le bloc de paraffine, l inclure à nouveau. Faire fondre le bloc de paraffine et reprendre l imprégnation et l enrobage. Refroidir le bloc. Effectuer quelques coupes (polissage du bloc) avant d effectuer la coupe définitive. La température ambiante devrait se maintenir autour de 22 C. Maintenir une vitesse de coupe lente et régulière sans arrêt durant la coupe. Revoir le type de paraffine utilisée ou consulter le fournisseur de paraffine. 10 DÉCEMBRE 2013 LE LABEXPERT
IN VIVO SECTION I : RÉSOLUTION DES PROBLÈMES RENCONTRÉS LORS DE LA COUPE AU MICROTOME (SUITE) Le tissu reste plissé à la surface de l eau. La température du bain d étalement est trop basse. Ajuster la température de l eau du bain d étalement qui doit être maintenue à environ 10 C sous le point de fusion de la paraffine. Les coupes se désagrègent ou les échantillons se déchirent. Le tissu est étiré, gonflé ou déformé. La technique d étalement du ruban est inadéquate. Le tissu a été insuffisamment déshydraté, éclairci ou imprégné de paraffine (solutions trop usées ou circulation trop rapide). La fixation est insuffisante. La paraffine a été refroidie trop lentement et a cristallisé. Les solutions du circulateur sont contaminées par de l eau. La température de l eau du bain d étalement est trop élevée. Étaler le ruban avec un mouvement facilitant l étirement du tissu (balayage). Effectuer le processus de circulation à l inverse et circuler à nouveau en s assurant de changer et de bien remplir les bains de réactifs dans le circulateur. Vérifier et corriger au besoin le protocole de circulation. La fixation étant une étape irréversible, le problème ne peut être corrigé. Revoir et respecter les délais de fixation, le volume utilisé et l état du fixateur afin d éviter que la problématique ne se reproduise. Reprendre l enrobage en refroidissant le bloc de paraffine plus rapidement. Remplacer les solutions dans le circulateur. Effectuer le processus de circulation à l inverse et circuler à nouveau. Ajuster la température de l eau du bain d étalement qui doit être maintenu à environ 10 C sous le point de fusion de la paraffine. Certains tissus, tel que le cerveau peuvent requérir une température plus basse. Pour certains tissus, récupérer la coupe rapidement. Il y a des trous dans le tissu, le fragment de tissu est incomplet ou il y a une zone manquante. Il y a eu une manipulation inadéquate lors de la séparation du ruban ou de la récupération de la coupe. Le tissu a séjourné dans le bain d étalement trop longtemps. Le rabotage est insuffisant. Lors du rabotage, le tissu a été coupé trop grossièrement. Les fragments dans le bloc de paraffine sont à différents niveaux de profondeur. Éviter de déformer le tissu lors de la séparation du ruban et lors de la récupération de la coupe en le séparant délicatement. Le tissu doit rester à la surface de l eau du bain d étalement juste le temps nécessaire pour qu il reprenne sa forme initiale. Raboter jusqu à l obtention de la surface complète du tissu avant de procéder à la coupe. Ajuster l épaisseur de rabotage selon le type de tissu. Après le rabotage, effectuer quelques coupes (polissage du bloc) avant d effectuer la coupe définitive. Effectuer des coupes à niveaux si nécessaire ou reprendre l inclusion si l'on constate que les fragments ne sont pas tous au même niveau. Le tissu se fend ou présente des stries longitudinales. (suite...) Des biopsies sont difficiles à repérer lors de l inclusion (présence de petits fragments de tissu qui se confondent avec la paraffine). Le rabotage est excessif. Le tissu a été endommagé lors des manipulations à l enrobage. Le biseau du rasoir est ébréché. Le tissu contient des particules dures (broches, fils, calculs). L utilisation d éosine 1 % dans un des bains d alcool du circulateur donne une teinte rosée au tissu qui aide à repérer les petits fragments sans pour autant nuire à la coloration. Un rabotage excessif est irréversible. Arrêter le rabotage lorsque la surface tissulaire est complètement exposée. Tissu endommagé définitivement. Revoir la technique d enrobage. Déplacer le rasoir latéralement afin d utiliser les sections encore intactes ou changer de rasoir. Extraire la particule dure, lorsque possible. LE LABEXPERT DÉCEMBRE 2013 11
SECTION I : RÉSOLUTION DES PROBLÈMES RENCONTRÉS LORS DE LA COUPE AU MICROTOME (SUITE) (...suite) Le tissu se fend ou présente des stries longitudinales. Le tissu contient des calcifications. Le biseau du rasoir est sale. Les calcifications peuvent avoir une incidence sur le diagnostic. Consulter le pathologiste pour déterminer s il a lieu de décalcifier le tissu. Nettoyer prudemment le biseau du rasoir. La paraffine contient des impuretés. Remplacer la paraffine et inclure le bloc à nouveau. Nettoyer régulièrement le réservoir de paraffine. Pendant la remontée du bloc, les coupes se décollent du rasoir et adhèrent au bloc. Le bloc est trop chaud. Le biseau du rasoir est sale. Il y a un mouvement trop faible ou inexistant de retrait du porte-objet ou du porterasoir (selon les modèles). Refroidir le bloc. Nettoyer prudemment le biseau du rasoir. Procéder aux ajustements nécessaires selon les instructions du fabricant. est insuffisant. Les coupes adhèrent au rasoir. Le biseau du rasoir est sale. est insuffisant. Nettoyer prudemment le biseau du rasoir. Les coupes s envolent : elles viennent se coller sur le microtome et sur d autres objets. Il y a présence de courants d air. Il y a présence d électricité statique. Positionner le poste de travail de microtomie dans une zone en retrait et hors des courants d air. La meilleure façon de prévenir les problèmes attribuables à l électricité statique est d avoir un taux d humidité et une température ambiante adéquate dans le laboratoire. Faire fonctionner un humidificateur près du poste de microtomie. La température ambiante ne devrait pas dépasser 22 C. Garder la zone du microtome propre. Vaporiser un produit antistatique en aérosol sur le bloc de paraffine et sur le rasoir. Éviter la statique sur les vêtements. Il y a des bulles sous le tissu ou le tissu est non uniforme sur la lame. Des bulles d air ont été emprisonnées sous la coupe lors de l étalement, provenant du fond ou de la surface de l eau du bain d étalement. Enlever les bulles d air avant de déposer le ruban sur l eau du bain d étalement. La température du bain d étalement est trop basse. Ajuster la température de l eau du bain d étalement qui doit être maintenu à environ 10 C sous le point de fusion de la paraffine. Il y a présence de débris sous le tissu. Nettoyer régulièrement la surface du bain d étalement ainsi que le rasoir et le porte-rasoir. Les lames sont insuffisamment égouttées. Laisser égoutter et faire sécher les lames suffisamment pour augmenter l adhérence des coupes sur la lame. Le temps de séchage est trop court ou la température de séchage est trop basse. Ajuster le temps et la température de séchage. La mise à niveau du bloc de paraffine est difficile lors de recoupes ; perte inutile ou même dangereuse de tissu. L utilisation d un microtome différent que lors de la coupe originale. Le positionnement du bloc de paraffine est différent dans le porte-objet d une fois à l autre. Il est pertinent d identifier sur quel microtome la coupe a été faite afin de faire les recoupes sur le même microtome, surtout dans le cas des petites biopsies. Les blocs de paraffine doivent toujours être positionnés de la même façon dans le porte-objet. La position du porte-objet a été changée. Les porte-objets des différents microtomes devraient être ajustés régulièrement de façon similaire en utilisant un bloc de paraffine vierge. 12 DÉCEMBRE 2013 LE LABEXPERT
IN VIVO SECTION I : RÉSOLUTION DES PROBLÈMES RENCONTRÉS LORS DE LA COUPE AU MICROTOME (SUITE) Bloc de tissu Pince à objet Biseau Porte-objet Rasoir Rasoir Angle de dégagement Porte-rasoir Levier de serrage Angle d'inclinaison Figure 1 : Certaines composantes du microtome Figure 2 : Angle de dégagement et angle d inclinaison L angle de dégagement, et par ricochet, l angle d inclinaison peuvent varier, entre autres, selon le fournisseur de rasoir, le type de rasoir ou l ajustement effectué sur le microtome. Pour ajuster l angle de dégagement, il suffit de modifier l angle d inclinaison. SECTION : RÉSOLUTION DES PROBLÈMES RENCONTRÉS LORS DE LA CRYOTOMIE Il y a présence de givre sur les parois de l enceinte et sur le microtome. Les coupes se déchirent. Les coupes se compriment. (suite...) L air ambiant est trop humide. Le cryostat est exposé aux courants d air. Il y a de la buée provenant de la respiration. Le biseau du rasoir est émoussé. Le tissu contient des particules dures (broches, fils, etc.). Le tissu contient des calcifications Le rebord de la plaque anti-roulement est abîmé. Le tissu est trop froid. Le tissu n est pas suffisamment froid. Le biseau du rasoir est émoussé. La plaque anti-roulement est mal ajustée. Contrôler l humidité du local. Éliminer les courants d air ou revoir l emplacement du cryostat. Utiliser un masque. Déplacer le rasoir latéralement afin d utiliser les sections encore intactes ou changer de rasoir. Extraire la particule dure, lorsque possible. Consulter le pathologiste. Remplacer la plaque anti-roulement Ajuster la température. S assurer que le tissu est à une température optimale (temps ou température sélectionnée). Déplacer le rasoir latéralement afin d utiliser les sections encore intactes ou changer de rasoir. Ajuster la plaque anti-roulement. Voir l encadré intitulé «Ajustement de la plaque anti-roulement». LE LABEXPERT DÉCEMBRE 2013 13
SECTION : RÉSOLUTION DES PROBLÈMES RENCONTRÉS LORS DE LA CRYOTOMIE (SUITE) (...suite) Les coupes se compriment. La plaque anti-roulement ou le rasoir ne sont pas assez froids et font fondre la coupe. Lors de changements de composantes, attendre que celles-ci soient à la température requise avant d effectuer la coupe. Le rasoir ou la plaque anti-roulement ne sont pas propres. Nettoyer le rasoir ou la plaque anti-roulement. Le rebord de la plaque anti-roulement est abîmé. Remplacer la plaque anti-roulement. est mal ajusté. Ajuster l angle d inclinaison en se référant aux instructions du fabricant. Présence d artéfacts de congélation (trous dans le tissu) Une congélation trop lente où l eau contenue dans le tissu a eu le temps de prendre de l expansion et déformer ou déplacer les composantes tissulaires. Congeler le tissu le plus rapidement possible. Conserver les platines dans le cryostat et la solution d enrobage au réfrigérateur. Vérifier la température de l enceinte du cryostat avant d y déposer le tissu. Les coupes s enroulent ou adhèrent sur la plaque anti-roulement La plaque anti-roulement est mal ajustée. Ajuster la plaque anti-roulement. Voir l encadré intitulé «Ajustement de la plaque anti-roulement». Étaler la coupe avec un pinceau. La plaque anti-roulement est sale. Nettoyer la plaque anti-roulement. Le tissu frotte sur la plaque anti-roulement La plaque anti-roulement n est pas assez froide. La plaque anti-roulement est mal ajustée. Lors de changements de composantes, attendre que celles-ci soient à la température requise avant d effectuer la coupe. Refroidir au besoin avec un réfrigérant rapide. Ajuster la plaque anti-roulement. Voir l encadré intitulé «Ajustement de la plaque anti-roulement». Les coupes sont ondulées. Le biseau du rasoir est émoussé. Déplacer le rasoir latéralement afin d utiliser les sections encore intactes ou changer de rasoir. Le rebord de la plaque anti-roulement est abîmé. Remplacer la plaque anti-roulement. Une des composantes est instable. Vérifier les leviers de serrage et ajuster au besoin. Vibration pendant la coupe. La platine est instable. Le tissu est très dur ou de consistance inégale. Vérifier les ajustements de la platine. Ajuster la vitesse et l épaisseur de coupe. Le rasoir est instable. S assurer que le rasoir est bien retenu en serrant les leviers d ajustement. Le tissu est mal fixé sur la platine. S assurer que le tissu est bien retenu sur la platine. est mal ajusté. Le tissu se détache de la platine. Le tissu a mal adhéré à la platine. S assurer que le tissu est bien retenu sur la platine en y ajoutant de la solution d enrobage. L épaisseur de rabotage est excessive. Ajuster le réglage de l épaisseur de rabotage. La plaque anti-roulement et le rasoir s embuent lorsqu on les nettoie. Le pinceau, la pince et le chiffon sont trop chauds. Les conserver sur le plateau dans l enceinte. 14 DÉCEMBRE 2013 LE LABEXPERT
IN VIVO SECTION : RÉSOLUTION DES PROBLÈMES RENCONTRÉS LORS DE LA CRYOTOMIE (SUITE) Les coupes sont d épaisseurs différentes. Le retrait de la platine n est pas possible. La température sélectionnée ne convient pas au tissu. Il y a trop de variation dans la vitesse de coupe. La platine est instable. Le rasoir est instable. est mal ajusté. Il y a du givre sur le dos du rasoir. La platine est collée par le givre au support de congélation rapide ou au porte-objet. Sélectionner une température appropriée pour le type de tissu à couper. Maintenir une vitesse de coupe lente et régulière sans arrêt durant la coupe. Vérifier les ajustements de la platine. Vérifier les ajustements du rasoir. Éliminer le givre en essuyant prudemment le rasoir. Humecter le point de contact avec de l alcool absolu. AJUSTEMENT DE LA PLAQUE ANTI-ROULEMENT Les indications suivantes sont inspirées de manuels d instructions de fabricants de cryostats. La plaque anti-roulement doit être ajustée de façon à guider la coupe. C est donc le rasoir qui touche à la pièce en premier et, tout près du biseau de ce dernier, la plaque anti-roulement viendra guider la coupe et l'empêchera de s'enrouler sur elle-même. Si la plaque anti-roulement touche la pièce en premier, elle comprimera le tissu et il sera impossible d obtenir des coupes ou celles-ci seront striées. Si la plaque anti-roulement n est pas suffisamment près du biseau, la coupe s enroulera sur elle-même au lieu d être guidée par celle-ci. RÉFÉRENCES : LEICA MICROSYSTEMS. Leica CM 1950 Cryostat Mode d emploi, Rev C, 1v3-04/2010. MICROM INTERNATIONAL GMBH. Microtome Cryostat HM525 Instruction Manual Nº 387779, 2004. LE LABEXPERT DÉCEMBRE 2013 15
SECTION I : VÉRIFICATION DE LA QUALITÉ D UNE COLORATION DE ROUTINE La qualité de la coloration de routine doit être évaluée afin de s assurer que le pathologiste aura la meilleure image possible du tissu à examiner. La première colonne de la section qui suit énonce les critères de qualité à chercher lors de l évaluation de la coloration de routine, que ce soit avec H&E (hématoxyline et éosine), HPS (hématoxyline, phloxine et safran), HES (hématoxyline, érythrosine et safran) ou avec une autre technique. La deuxième colonne présente les écarts par rapport aux critères de qualité qui peuvent être observés et la troisième colonne énumère les actions qui peuvent être apportées afin d améliorer cet aspect de la coloration. Les méthodes de coloration sont établies de concert avec le pathologiste et validées dans chaque établissement. Il est primordial de vérifier la qualité des colorants et autres réactifs impliqués dans la coloration avant leur usage et de les remplacer au besoin. Coloration HPS Coloration H&E Ces images proviennent du Quality Management Program Laboratory Services, reproduit avec permission. À noter que cette autorisation est exclusive et non transférable. Critère de qualité Écarts possibles Actions correctives Les noyaux sont clairement visibles à faible grossissement (4X à 10X) et contrastant avec les structures tissulaires environnantes. La coloration des noyaux est trop pâle. La coloration des structures tissulaires environnantes est trop foncée. Augmenter le temps passé dans le bain d hématoxyline. Vérifier le ph de l eau courante. Ajuster les temps de coloration, de rinçage ou de différenciation en fonction du ph de l eau. En fonction de la méthode utilisée (régressive ou progressive), diminuer le temps de différenciation. Alcaliniser le réactif bleuissant. Remplacer le réactif bleuissant. Diminuer le temps dans le contre-colorant. Augmenter le temps de différenciation du contre-colorant. La coloration des noyaux est trop foncée. Diminuer le temps dans l hématoxyline. En fonction de la méthode utilisée (régressive ou progressive), augmenter le temps de différenciation. Vérifier le ph de l hématoxyline (optimal 2.5). La chromatine est visible à 40X et présente une variation d intensité en fonction du type de cellule observé L intensité de la coloration est trop foncée. L intensité de coloration est trop pâle. Diminuer le temps dans l hématoxyline. En fonction de la méthode utilisée (régressive ou progressive), augmenter le temps de différenciation. Vérifier le ph de l hématoxyline (optimal 2.5). Augmenter le temps passé dans le bain d hématoxyline. Vérifier le ph de l eau courante. Ajuster les temps de coloration, de rinçage ou de différenciation en fonction du ph de l eau. En fonction de la méthode utilisée (régressive ou progressive), diminuer le temps de différenciation. Alcaliniser le réactif bleuissant. Remplacer le réactif bleuissant. Il y a une perte du détail nucléaire. La fixation peut avoir été incomplète. La fixation étant une étape irréversible, le problème ne peut être corrigé. Revoir et respecter les délais de fixation, le volume utilisé et l état du fixateur (usure, contamination, etc.) afin d éviter que la problématique ne se reproduise. Éviter de trop décalcifier. Vérifier régulièrement la fin de la décalcification et bien rincer après la décalcification. Les noyaux sont colorés en bleu. (suite...) Les noyaux sont colorés en rouge. Les noyaux sont colorés en pourpre. Effectuer une étape de bleuissement. Remplacer l agent bleuissant. 16 DÉCEMBRE 2013 LE LABEXPERT
IN VIVO SECTION I : VÉRIFICATION DE LA QUALITÉ D UNE COLORATION DE ROUTINE (SUITE) Critère de qualité Écarts possibles Actions correctives (...suite) Les noyaux sont colorés en bleu. Les noyaux sont colorés en gris. Régénérer l hématoxyline. Les noyaux sont colorés en brun. Régénérer l hématoxyline. Ajuster la durée ou le ph de l agent bleuissant. Absence de coloration non spécifique (hématoxyline) Des structures autres que les noyaux sont colorées par l hématoxyline. Diminuer le temps dans l hématoxyline. En fonction de la méthode utilisée (régressive ou progressive), augmenter le temps de différenciation Il y a présence de précipité (points de colorant sur toute la lame). Filtrer les réactifs (hématoxyline, bleuissant, contre-colorants). Il y a des dépôts de colorants (amas de colorant déposé au hasard sur toute la lame). Bien mélanger les réactifs, en fonction des instructions du fabricant. Il y a une coloration de fond extratissulaire. Diminuer la quantité d adhésif du bain d étalement. La contre-coloration démontre la morphologie sous-jacente et contrastante avec la cible. La contre-coloration est trop foncée (elle cache les noyaux). La contre-coloration est trop pâle (elle ne démontre pas la morphologie tissulaire). Pour la coloration H&E : Il y a moins de 3 teintes dans la contre-coloration ou les tissus sont rouge brillant. Diminuer le temps dans le contre-colorant. Augmenter le temps de différenciation du contre-colorant. Augmenter le temps dans le contre-colorant. Diminuer le temps de différenciation du contre-colorant. Remplacer la solution contre-colorante. La fixation peut avoir été incomplète. La fixation étant une étape irréversible, le problème ne peut être corrigé. Revoir et respecter les délais de fixation, le volume utilisé et l état du fixateur (usure, contamination, etc.) afin d éviter que la problématique ne se reproduise. Réviser le processus de circulation. Augmenter le temps de différenciation de l éosine. Ajuster le ph de l éosine entre 4.0-4.5. Pour la coloration HPS : La couleur rose est trop pâle. Augmenter le temps dans la phloxine. Renouveler la solution de phloxine. Diminuer le temps de différenciation de la phloxine. Pour la coloration HPS : La couleur rose est trop foncée. Diminuer le temps dans la phloxine. Augmenter le temps de différenciation de la phloxine. Pour la coloration HPS : La couleur jaune est trop pâle. Augmenter le temps dans le safran. Remplacer la solution de safran. Diminuer le temps de différenciation du safran. Pour la coloration HPS : Les structures tissulaires ciblées sont colorées en orange (couleurs jaune et rose mélangées). Ajuster les temps de coloration ou de différenciation des contre-colorants en fonction de l observation microscopique. Coloration égale sur toute la lame (applicable à tout type de colorations) Zones arrondies de coloration inégales due à un déparaffinage inadéquat. Zones arrondies de coloration inégales due à la présence de bulles sur le tissu. Renouveler les bains de toluène ou de xylène. Laisser reposer les solutions avant de s en servir. Ajuster le débit d eau utilisé. Zones plus pâles dans les noyaux. Égoutter les lames suffisamment longtemps avant de les exposer à la chaleur. LE LABEXPERT DÉCEMBRE 2013 17
ADN Cet outil a été préparé par plusieurs membres du sous-comité d anatomopathologie de l OPTMQ. Cette équipe dynamique est composée de : Première rangée, de gauche à droite : Denis Bouchard, T.M., Chantale Tremblay, T.M, Bruno Houde, T.M., vice-président de l OPTMQ Deuxième rangée, de gauche à droite : Martine Chalifoux, T.M., Cindy Laliberté, T.M., Louis Gaboury, M.D., pathologiste, Anne-Marie Martel, T.M., chargée de dossiers scientifiques de l OPTMQ et Josée Senécal, T.M. Ce sous-comité prépare également un guide d anatomopathologie qui sera publié d ici la fin de 2014 ainsi qu un guide sur la macroscopie qui sera publié ultérieurement. RÉFÉRENCES : BROWN, W. RICHARD, Histologic Preparations Common Problems and Their Solutions, College of American Pathologists, Northfield, Illinois, 2009. CARSON, L. Freida et HLADIK, Christa. Histotechnology A Self-Instructional Text, Third Edition, ASCP Press, 2009. FORTIER, JACQUES C. et HOULD, RENÉ. Histotechnologie théorie et procédés, Centre collégial de développement de matériel didactique Collège de Maisonneuve, Montréal, 2003. 18 DÉCEMBRE 2013 LE LABEXPERT