MYCOTOXINES : changements règlementaires et analytiques E. MARENGUE ( LDA22 ) et S. HULOT ( IDAC )
PLAN 1) La problématique 2) Les évolutions règlementaires 3) L échantillonnage : étape clé 4) Les techniques d analyses 5) Conclusion
1) Problématique 25 % des denrées alimentaires seraient contaminées par des moisissures : Moisissures = mycotoxines? bénéfiques (fermentation ) ou nuisibles (altération des aliments, production de mycotoxines )!!!
Les mycotoxines : métabolites secondaires de diverses moisissures. Malgré des niveaux extrêmement élevés de mycotoxines dans certains grains, la concentration moyenne dans un lot est souvent très faible. Attention : même à des niveaux très bas, les mycotoxines affectent la santé des hommes et des animaux.
Analyse de traces : le µg/kg 10-3 10-3 10-3 Kg g mg µg 1 µg/kg = 1 mm sur l axe Brest-Strasbourg 1 grain de maïs dans 3,5 wagons 1 plant de maïs dans 16200 hectares
Conséquences économiques du développement des moisissures DIRECTES - Marchands de grains : Qualité pauvre en apport nutritionnel. INDIRECTES Prix de revient augmenté - Eleveurs : Réduction de la performance, Diminution de la reproduction, Pertes nombreuses dues aux maladies. Dépenses pour les soins des animaux - Industries alimentaires : Substances non vendables d aspect et de caractère organoleptique altéré
Localisation dans la chaîne alimentaire (complexité des différents types d échantillons) CHAMP Pathogène des Plantes Fusarium graminearum Colonise la plante Fusarium roseum Plantes stressées Fusarium moniliforme RÉCOLTE TRANSFORMATION Sol, ventilation, Aspergillus Penicillium STOCKAGE Viande, lait, oeufs Frigidaire ALIMENTATION HUMAINE!!! FOURRAGE
Moisissures, mycotoxines et denrées Champignons Toxines Denrées Aspergillus Aflatoxines Stérigmatocystine Ochratoxine A Maïs, cacahuètes, graines de coton, graines de potiron, riz, haricots, tissus d animaux (jambon, lard, saucisses), lait et dérivés Penicillium Patuline, Citrinine, Pénitrem A, Acide cyclopiazonique, ochratoxine A Fruits et jus de fruits, blé, riz, fromage, noix Alternaria Alternariol Acide Tenuazonique Fruits, légumes et produits dérivés de pomme et tomates Claviceps Alcaloïdes de l Ergot Blé et dérivés, seigle Fusarium Trichothécènes (DON, NIV, Toxine T-2, DAS) Zéaralénone, Fumonisines, Fusarine, Moniliformine Blé, Maïs, orge, riz, seigle, avoine, noix
2) Evolutions règlementaires L arsenal règlementaire s étoffe, notamment au niveau européen ( années 1980). Les derniers textes publiés en 2005 concernent les toxines de Fusarium : la DON (Déoxynivalénol), la zéaralénone, les fumonisines (B1+B2) et les toxines T-2 et HT-2 (règlement CE n 856/2005) : mise à jour envisagée au 01/07/2007 (alimentation humaine). et l ochratoxine A (règlement CE n 123/2005 alimentation humaine)
(réglementation suite) Cette évolution règlementaire concerne : les teneurs maximales à ne pas dépasser par type d aliments/matières premières mais également les conditions de prélèvement/représentativité des échantillons pour analyses ainsi que les performances des méthodes analytiques. Exemples : toxines de Fusarium (directive 2005/38 CE) et règlement CE N 401/2006 (23/02/06) «portant fixation des modes de prélèvement d échantillons et des méthodes d analyse pour le contrôle officiel des teneurs en mycotoxines des denrées alimentaires». http://europa.eu.int/eur-lex/lex/fr/index.htm
3) Un prélèvement représentatif?
Risque d erreur à l échantillonnage Analyse correcte = contamination de l ensemble du lot mesurée. Si procédure d échantillonnage non correctement suivie, les résultats représentant l échantillon reçu au laboratoire vont soit sous estimer ou surestimer la contamination. Notion de faux négatifsn (prélèvement, préparation, sous échantillonnage..) et de faux positifs (moins fréquent mais tout aussi préjudiciable).
4) Les techniques d analyse Préparation Extraction Purification optionnelle Dosage & résultats
Les différentes techniques à votre disposition Méthodes semi-quantitatives : technique immunologique : ELISA et CCM (Chromatographie sur Couche Mince). Techniques de screening! Méthodes quantitatives : techniques chromatographiques : CLHP (Chromatographie Liquide Haute Performance) ou CG (Chromatographie gazeuse) + SM ou SM/SM (couplage pour la détection à la spectrométrie de masse)
Méthodes quantitatives : chromatographie Analyse chromatographique = séparation des composés avant leur détection Injection Séparation Détection
Comparatif des techniques analytiques Sensibilité Spécificité Avantage Inconvénient CLHP/FLUO Sensibilité Dérivation Purification CLHP/UV Pas de dérivation Peu spécifique Purification ELISA Coût (si série) Peu spécifique : risque de faux négatif/faux positif CCM Simple Sensibilité / spécificité GC/MS ou MS/MS Sensibilité spécificité HPLC/MS/MS Sensible Spécifique Dérivation Purification Coût appareil Coût appareil
Mono ou multi-résidus? Méthode mono-résidu : mise en œuvre d une méthode analytique pour rechercher une seule molécule ou une même famille (ex. : aflatoxines B1/B2/G1/G2). ELISA/CCM/CLHP fluo. ou UV/CG coût! Méthode multi-résidus : recherche de plusieurs molécules de différentes familles en une seule analyse! LC/MS/MS
Exemple de méthode semi quantitative : Analyse de trichotécènes A et B par Chromatographie Couche Mince CCM)
Exemple de méthode quantitative : Analyse aflatoxines B et G par Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP)
Exemple de méthode quantitative : Analyse zéaralénone et fumonisines par Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP)
Méthode de Chromatographie Liquide couplée à la Spectrométrie de Masse en tandem (LC-MS/MS) pour analyser les mycotoxines But : - Domaine d application: l ensemble des molécules organiques => molécules mères et métabolites - Analyses multi-résidus ( sensible spécifique et robuste ) - Résultat : sécurité dans l identification de la molécule détectée par le spectre de masse
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Spectre de masse = identité / spécificité ( empreinte chimique de chaque molécule )
LC/MS/MS Avantages : Domaine d application analytique très large Pas ou peu de préparations Méthodologie simple et reproductible Pas ou peu de consommable Utilisation simple et routinière : appareillage robuste et fiable Inconvénients : Coût de l appareillage ( > 200 000 H.T) Formation des techniciens
5) Conclusion Avant toute analyse de mycotoxines : nécessité d un diagnostic en amont (vétérinaire ) pour orienter le type de mycotoxines à rechercher ou l établissement d un cahier des charges réaliste. Méthode mono-résidu. En l absence de symptômes caractéristiques : Méthode multi-résidus (LC/MS/MS)