UFR D HEMATOLOGIE LABORATOIRE D HEMATOLOGIE Polycopié des travaux pratiques 2 ème année Pharmacie FEVRIER 2010 1
Recommandations aux étudiants Il est impératif de respecter la répartition des groupes de TP Le port de la blouse blanche et des gants en latex est obligatoire pendant les séances Chaque étudiant avant de quitter la salle doit nettoyer sa paillasse ainsi que le matériel utilisé en se reportant aux règles de sécurité affichées au laboratoire. 2
Objectifs Pédagogiques 1. CYTOHEMATOLOGIE : Effectuer un frottis sanguin Colorer un frottis sanguin Décrire les cellules sanguines au microscope optique Savoir mesurer un hématocrite Déterminer un taux de réticulocytes Connaître la méthode de détermination d une vitesse de sédimentation. 2. HEMOSTASE : Mesurer le temps de saignement par la méthode d Ivy Réaliser le temps de Quik, le convertir en taux de prothrombine Calculer l INR Réaliser le temps de céphaline activé. 3. IMMUNOHEMATOLOGIE Effectuer le groupage sanguin ABO D selon les épreuves globulaires et sérique Savoir interpréter le résultat du groupage sanguin. 3
CYTOHEMATOLOGIE 4
Confection et coloration d un frottis sanguin Principe Une goutte de sang, étalée de façon uniforme sur une lame de verre, permet d obtenir une seule couche de cellules. Un tel frottis, après fixation et coloration, permet une étude morphologique des éléments sanguins, il peut révéler des anomalies. Matériel Lames hématologique propres, dégraissées et sèches Lamelle pour étaler (ou utiliser une lame à bord rodé) Technique : Déposer une microgoutte de sang (capillaire ou veineux) à 1cm de l extrémité de la lame hématologique Placer l étaleur au devant de la goutte Incliner l étaleur (30-45 ), le sang suit alors l arête par capillarité, et aussitôt étaler d un seul geste en levant la main Sécher rapidement à l air Coloration La coloration panoptique de May Grünwald Giemsa (MGG) repose sur l action complémentaire de deux colorants neutres May Grünwald (éosine et bleu de méthylène) et Giemsa (éosine et azurs de méthylène). Le MG fixe le frottis par son méthanol, le MG dilué au 1/2 dans l eau neutre colore les éléments acidophiles et les granulations différenciées. Le Giemsa surcolore les noyaux et colore les granulations azurophiles. *Technique : Mettre les frottis dans un bac contenant du MG pur pendant 3min Puis dans un bac avec MG dilué au 1/2 dans de l eau neutre pendant 2 min Déposer ensuite les frottis dans un bac contenant du Giemsa dilué au 1/10 dans de l eau neutre pendant 20 min Rincer et laisser sécher à l air *Résultats : les noyaux sont rouge-violet ou rouge les cytoplasmes acidophiles sont roses (polynucléaires et hématies) les cytoplasmes basophiles sont bleus (lymphocytes) les cytoplasmes polychromatophiles sont gris (monocytes) les granulations neutrophiles sont violet lilas les granulations éosinophiles sont orangées Les granulations basophiles sont violet foncé les granulations azurophiles sont rouges 5
Corps Queue Tête 5
Analyse morphologique des éléments figurés du sang Cellules Taille noyau Cytoplasme Globule rouge 7µ -- Beige orangé avec halo clair Polynucléaire neutrophile PNN Polynucléaire éosinophile PNE Polynucléaire basophile PNB Petit lymphocyte 7-9µ Grand lymphocyte Monocyte 10-15µ -Plusieurs lobes réunis par des ponts très fins -Violet foncé -Chromatine dense 10-15µ -2 lobes symétriques, rarement 3 -violet foncé -chromatine moins épaisse que PNN 10-12µ -rond ou ovalaire -violet rouge -chromatine peu marquée -occupe presque toute la cellule -rond, parfois incurvé - violet noir -chromatine très dense 9-15µ -arrondi ou ovalaire -violet rouge -chromatine dense 15-30µ -irrégulier, encoché, central ou périphérique -rouge brun assez clair -chromatine réticulée -rose ou clair - granulations nombreuses, fines, violet lilas -légèrement bleu - granulations volumineuses, nombreuses, rouge orangé brillant -légèrement rose - granulations peu nombreuses, grosses, recouvrant parfois le noyau, violet foncé -très réduit, mince couronne bleue - pas de granulations -clair, bleu ciel - granulations peu nombreuses, volumineuses, rouge pourpre -très clair, gris - granulations très nombreuses, très fines, rouges 7
Schématiser des éléments figurés du sang 8
Mesure de l hématocrite Principe L hématocrite représente le volume occupé par les hématies dans un volume de sang total connu. La détermination se fait en séparant les hématies du plasma par centrifugation du sang dans des conditions standardisées de durée et de vitesse. Matériel Prélèvement sanguin : sang capillaire ou sang veineux prélevé sur EDTA Tube hématocrite : tube capillaire de 75 mm de long et de 1mm de diamètre ouvert aux deux extrémités Centrifugeuse : présente un plateau spécial et peut tourner à 10 000 tours/min Technique Plonger une extrémité du tube dans le sang veineux homogénéisé (ou dans goutte du sang capillaire) Laisser le sang monter par capillarité, arrêter le remplissage à environ 1cm de l autre extrémité Essuyer l extérieur du tube avec un papier imprégné d éthanol fermer l extrémité libre avec la pâte à sceller Placer le tube sur le plateau, l extrémité scellée vers la périphérie Centrifuger 3min à 10 000 tours/min Lire sur un abaque permettant de ramener la hauteur totale du sang à 100% 9
Résultats Homme : 40-54% Femme : 37-47% 10
Numération des réticulocytes Principe Le réticulocyte représente la fin de maturation de la lignée érythrocytaire. Elaboré dans la moelle osseuse, il est libéré dans le sang. Il se différencie d une hématie adulte par un diamètre légèrement plus grand et surtout par la présence dans son cytoplasme d un reste d ARN. Pour le distinguer parfaitement d une hématie mature, on utilise une coloration supra-vitale : le bleu de crésyl brillant. Ce colorant précipite et colore l ARN résiduel en un réseau de petites granulations ou filaments constituant la substance granulo-filamenteuse. Matériel Prélèvement sanguin : sang veineux sur EDTA ou sang capillaire Tubes à hémolyse Lames hématologiques Colorant Bleu de crésyl brillant dans l eau physiologique (NACL 9/1000) additionné d un anticoagulant (citrate de sodium). Cette solution est filtrée et conservée à 4 C. Technique Dans un tube à hémolyse, introduire quelques gouttes de solution colorante Ajouter le même volume de sang Mélanger, boucher, laisser en contact 30 min à température ambiante ou 15 min à 37 C Homogénéiser la suspension et réaliser quelques frottis réguliers et minces Les hématies sont colorées en bleu verdâtre et les réticulocytes plus gros comportent une substance granulo-filamenteuse colorée en bleu foncé, violet. Compter à l objectif à immersion 1000 hématies sur différents champs et noter le nombre de réticulocytes rencontrés. Résultats Adulte : 0,5-2% soit 20-80 Giga/L 11
Mesure de la vitesse de sédimentation Principe Quand un échantillon de sang recueilli sur anticoagulant est laissé au repos dans un tube vertical, les hématies sédimentent. Elles se disposent en rouleaux très denses qui progressivement se tassent, laissant ainsi surnager une couche de plasma. La formation de ces rouleaux d hématies est due à l existence de force électrostatiques neutralisées par les protéines plasmatiques chargées pour la plupart négativement ; Les hématies ne se repoussent plus mais au contraire s agrègent «en pile d assiettes» qui sédimentent plus facilement. La vitesse de sédimentation (VS) dépend donc du courant descendant des cellules et du courant ascendant du plasma. Elle se traduit par la mesure de la hauteur du plasma (en mm) obtenue au bout d un certain temps (1 heure). Matériel Prélèvement sanguin : sang veineux sur citrate trisodique à raison de 4 volumes de sang veineux et 1 volume d anticoagulant ; Pipette de Westergreen : longueur 300mm/2,5mm diamètre intérieur, graduée en mm de 0 à 200 de haut en bas Support adapté aux pipettes pour les maintenir en position verticale Technique Aspirer le mélange solution anticoagulante-sang, bien homogénéisé, dans la pipette de Westergreen, jusqu au trait 0 placer aussitôt la pipette sur le support en position strictement verticale Actuellement, il est commercialisé des pipettes munies d un système individuel de remplissage Lire la hauteur du plasma surnageant (exprimée en mm) au bout d 1 heure Résultat Homme : 3-10 mm Femme : 4-20 mm 12
HEMOSTASE 13
TEMPS DE SAIGNEMENT (TS) Principe Le temps de saignement mesure la durée de l'hémorragie provoquée par une brèche dermoépidermique. Il explore l'hémostase primaire. Indication Bilan d une hémorragie cutanéomuqueuse Techniques Méthode d IVY INCISION Matériel - Appareil de mesure de la pression artérielle - Dispositif jetable pour la réalisation de l incision - Papier filtre épais - Chronomètre - Coton imbibé d'éther, gants Technique Mettre en place le brassard et régler la pression à 4 cm d'hg, qui doit être maintenue tout au long du test. Désinfecter la peau de l'avant-bras par l'éther. Réaliser une incision de 1 cm de long et 1 mm de profondeur (dispositif). Déclencher le chronomètre, absorber le sang avec le papier filtre toutes les 30 secondes jusqu'à l'arrêt de l'hémorragie. Résultats Le TS normal est de 4 à 8 mn, il est allongé s'il est supérieur à10 mn 14
Méthode d IVY 3 POINTS Même matériel et même technique, mais au lieu d'appliquer une incision, réaliser par un vaccinostyle 3 points de piqûres espacés d'un centimètre et formant les sommets d'un triangle. Résultats : Le TS normal est de 2 à 6 mn, il est allongé s'il est supérieur à 6 mn. Variations pathologiques : TS allongé - Thrombopénies ou thrombopathies - Maladie de Willebrand - Déficits constitutionnels ou acquis en fibrinogène - Prise de certains médicaments (aspirine, ticlopidine, AINS,.) 15
LE TEMPS DE QUICK (TQ) 1. Principe Le temps de Quick est le temps de coagulation d'un plasma citraté, recalcifié en présence d'un excès de facteur tissulaire et de phospholipides. Le temps de Quick consiste à comparer en présence de thromboplastine calcique, les temps de coagulation d'un plasma pauvre en plaquettes par rapport à un plasma témoin normal traité dans les mêmes conditions. Le TQ est un test d'orientation et de première intention dans le bilan d'hémostase. 2. Indications - Bilan préopératoire, - Atteinte hépatique, - Bilan d'une hémorragie, - Surveillance de traitement AVK 3. Matériel et méthode Prélèvement sut tube citraté (9 parties sang, 1 partie citrate trisodique), centrifugé 10 minutes à 2500g. Le plasma pauvre en plaquettes peut être conservé à -30 C. 4. Réactifs - Thromboplastine calcique lyophilisée - Tampon type Koller - Pool de plasmas normaux - Contrôle normal et pathologique 5. Mode opératoire Préparation de la gamme d'étalonnage: La gamme d'étalonnage est réalisée à l'aide de plasma étalon titré à 100% : le diluer au 1/2, 1/4, 1/8 en tampon Owren Koller. - Le plasma pur correspond à un taux de prothrombine de 100%. - La dilution au 1/2 correspond à un taux de prothrombine de 50%. - La dilution au 1/4 correspond à un taux de prothrombine de 25%. - La dilution au 1/8 correspond à un taux de prothrombine de 12.5%. 16
6. Technique Dans un tube à hémolyse à 37 C introduire successivement : - Plasma. 0.1 ml (laisser incuber environ: 2minutes) - En déclenchant un chronomètre, ajouter la thromboplastine... 0.2 ml - Mélanger et noter le temps de coagulation. - A partir de cette droite d'étalonnage, déduire les taux de prothrombine des échantillons de patients à étudier. - Calculer l'international Normalized Ratio (INR) chez les patient sous AVK. INR = (TQ M / TQ T) ISI 7. Résultats : Valeurs normales TP= 70 à 100% Patient sous traitement AVK : INR 2 à 3.5 8. Variations pathologiques : - Déficits constitutionnels ou acquis en facteurs de la voie exogène et commune (F I, II, V, X et VII) - CIVD - Anticoagulant circulant - Traitement par AVK 17
TEMPS DE CEPHALINE AVEC ACTIVATEUR (TCA) 1. Principe Le TCA consiste en la coagulation d'un plasma pauvre en plaquettes recalcifié en présence de phospholipides (PL) et d'un activateur (acide ellagique). Comme le temps de quick, le TCA est un test d'orientation et de première intention dans le bilan d'hémostase. 2. Indications - Bilan préopératoire - Bilan d'une hémorragie - Surveillance de l'héparinothérapie curative (HNF) - Anticoagulants circulants 3. Matériels et réactifs Matériel et accessoires BM thermostaté à 37 C Micropipettes 0,1 Chronomètre Gants Crochets Compresses Cristallisoirs contenant l'eau javellisée Tubes à hémolyse en verre Réactifs -Céphaline lyophilisée (céphaline reconstituée par la solution de l'activateur, puis incubée en tube à hémolyse en plastique à 37 C) - Activateur -CaCI 2 -Plasma témoin -Contrôles normal et pathologique 4. Prélèvement - Fait partie de l'examen - Réalisé par ponction veineuse franche - Sur citrate trisodique 0,109M (9 volumes de sang pour 1 volume d'anticoagulant) - Centrifugation sans délai pendant 15 mn à 2500 g 18
5. Mode opératoire Le TCA du malade doit être comparé à celui d un plasma témoin Dans un tube à hémolyse placé au BM à 37 C Plasma témoin, (contrôle, malades) Céphaline + activateur MéIanger et laisser incuber exactement 3 mn En déclenchant un chronomètre, ajouter le CaCI 2 pré incubé à 37 C Mélanger, surveiller l'apparition du caillot par le crochet ou par retournements successifs du tube à réaction. Saisir le moment de la formation du caillot en arrêtant le chronomètre. 0,1 ml 0.1 ml 0,1 ml Vérifier que les résultats pour les contrôles se situent dans s fourchettes fournies par le fabricant. 6. Expression des résultats - Le TCA patient est exprimé en secondes, il est donné par rapport au TCA témoin - Les valeurs normales se situent autour d'un rapport de 1 - Un allongement du temps de coagulation du patient dépassant de 6 secondes celui du témoin définit un désordre du test (ou rapport TCA malade / TCA témoin > 1,2) 7.Variations pathologiques - Déficits constitutionnels ou acquis en facteurs de la voie endogène et commune (F I, II, V, X, VIII, IX, XI, XII, Kininogène HPM et Prékallikréine). - CIVD - Anticoagulants circulants - Héparinothérapie curative (HNF=> TCA patient doit être de 2 à 3 fois celui du témoin) 19
IMMUNOHEMATOLOGIE 20
GROUPAGE ABO, RH 1. Principe : Le groupage standard ABO se fait par deux épreuves : - Epreuve globulaire : Epreuve de Beth Vincent consiste à rechercher, par technique d'agglutination, les antigènes à la surface des globules rouges en utilisant des sérums tests antia, antib et antiab. - Epreuve sérique : Epreuve de Simonin consiste à rechercher, par technique d agglutination, les anticorps Anti A et Anti B dans le plasma en utilisant des globules rouges tests A, B et O. Le groupage standard RH consiste à rechercher, par technique l'agglutination, l'antigène D à la surface des globules rouges en utilisant le sérum test antid. 2. Indications : - Donneur de sang - Receveur d'une transfusion - Bilan prénatal - Bilan d'une allo-immunisation f tomaternelle 3. Prélèvement : Obtenu par ponction veineuse sur tube contenant un anticoagulant. 4. Matériel, consommables, réactifs : Matériel et consommables - Verres à pied contenant de l'eau physiologique - Cristallisoir contenant de l'eau javellisée - Pipettes Pasteur - Plaque d opaline - Tubes à hémolyse en verre - Cartes à gel Réactifs - Sérums tests antia, antib, antiab - GR tests A, B, O - Sérum test antid 21
5. Technique Techniques sur plaque d opaline, tube à hémolyse, carte à gel. Technique sur plaque : sur une même plaque, réaliser le groupage standard ABO et le groupage standard RH : épreuves globulaire et sérique (ABO) et épreuve globulaire (RH D). Epreuve de Beth Vincent : Sur la plaque, placer successivement une goutte de chaque sérum test, Ajouter à l'aide d'une pipette Pasteur une goutte d'une suspension globulaire de l'échantillon en eau physiologique à côté des gouttes des sérums tests, Mélanger à l'aide d'un agitateur qui sera chaque fois nettoyé Constater l'agglutination immédiate des globules rouges. Epreuve de Simonin : Sur la même plaque, placer successivement une goutte de chaque globule rouge test Ajouter à l'aide d'une pipette Pasteur une goutte du plasma de l échantillon à côté des gouttes des globules rouges tests, Mélanger à l'aide d'un agitateur qui sera chaque fois nettoyé Constater l'agglutination des globules rouges tests avec le sérum. Recherche de l'antigène D : Sur la même plaque, les globules rouges de l échantillon sont testés avec le sérum test antid. 22
6. Interprétation des résultats : L étudiant doit respecter l'ordre des réactions antigène anticorps du tableau. Epreuve globulaire : Sérum test Sérum test Technique Sérum test Sérum test Résultat AntiB AntiA AntiAB AntiD Groupe + 1 goutte de suspension de GR à grouper - + + + A RH+ - + + - A RH- + - + + B RH+ + - + - B RH- + + + + AB RH+ + + + - AB RH- - - - + O RH+ - - - - O RH- 23
Epreuve sérique : Technique Résultat GR test A1 GR test B GR test O Groupe + 1 goutte du plasma du sujet à grouper - + - A + - - B - - - AB + + - O La détermination doit être réalisée deux fois par deux techniciens différents, deux techniques différentes et deux lots de réactifs différents. Une carte de groupe sanguin ne devrait être délivrée qu'après deux déterminations pratiquées sur deux prélèvements différents 24
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