Le stress oxydant se définit comme l incapacité de l organisme de se défendre contre les espèces réactives de l oxygène ERO en raison de la perturbation d équilibre endogène entre ces derniers et les agents oxydants AO. Ce déséquilibre conduit potentiellement à des dégâts structuraux et fonctionnels. Les ERO sont des espèces chimiques oxygénées tels que les radicaux libres ions oxygénés, peroxydes, rendues chimiquement très réactives par la présence d électrons de valence non appariés dans l orbitale la plus externe. L équilibre est rétabli soit par oxydation (perte de cet é libre) ou par réduction (gain d un autre é). Le caractère radicalaire de la molécule ne disparait pas, l électron libre peut passer sur d autres molécules ; c est le phénomène d oxydation en chaine. Sommaire 1 Facteurs influençant le stress oxydatif 2 Étude des espèces réactives produites lors du stress oxydatif 2.1 Propriétés 2.2 Mécanisme de génération des ERO 2.3 Formation des radicaux libres 3 Toxicité des ERO 4 Les espèces réactives de l azote 5 Source des espèces réactives 6 Les moyens de lutte contre le stress oxydatif 7 Quantification des ERO Facteurs influençant le stress oxydatif Facteurs augmentant la production des ROS : exemple : consommation élevée d O 2 (activité sportive intense) avec dépenses énergétiques. Facteurs réduisant les capacités antioxydantes : exemple : déficit enzymatique congénital (G6PD) Analytical Toxicology - Stress Oxydatif 1
Étude des espèces réactives produites lors du stress oxydatif Propriétés Les ERO sont des espèces électrophiles de courte durée de vie (ns), elles font partie des systèmes ubiquitaires ayant une réactivité chimique délétère à l égard des biomolécules, cette réactivité est inversement proportionnelle au pouvoir oxydant (OH > RO > HOO > ROO ). Mécanisme de génération des ERO Au niveau de la respiration mitochondriale : lors de l inhibition du transfert d électron par découplage de la phosphorylation oxydative. Modification du potentiel REDOX favorisant l auto-oxydation des biomolécules. Exacerbation des phénomènes inflammatoires, et augmentation du taux du Fe libre et autres métaux de transition. Bioactivation lors de processus de biotransformation (Formation des RO ), induction des NOS (Oxyde nitrique synthétase) I, II, III ; Stimulation des oxydases (NOX, MAO, XO) Formation des radicaux libres >> Par Scission Scission homolytique de la liaison covalente Scission hétérolytique >> Par dismutation Réduction monoélectronique : Analytical Toxicology - Stress Oxydatif 2
1. Oxydation monoélectronique : 1. Les espèces réactives d O 2 (ROS) Oxygène singlet 1 O 2, anion superoxyde O 2 *-, peroxyde d hydrogène, radical hydroxyle * OH, l ozone O 3. Toxicité des ERO Dommage oxydatifs lipidiques : principalement par peroxydation lipidique : ensemble des phénomènes oxydatifs non spécifiques des lipides (oxydation non enzymatique). Cibles : constituants membranaire (acides gras poly insaturés) lipides circulants (lipoprotéines Cholestérol libre). Dommage oxydatifs protéiques : cible : les acides aminés (surtout soufrés (Cystéine) aromatique (Histidine), les protéines les plus sensibles étant celles qui ont le plus de groupements sulfhydrile SH. Deux modes d action : direct : cible les chaines peptidiques et les chaines latérales. Le mode indirect essentiellement par glycation (formation de groupement carbonyle) ou par lipooxydation (formation de bases de Schiff + adduits de Michael). Dommage oxydatifs de l ADN : cible : ADN mitochondrial/nucléaire. Le * OH généré par H 2 O 2 et O 2 *- est directement responsable de diverses altérations de l ADN. Analytical Toxicology - Stress Oxydatif 3
Les espèces réactives de l azote NO * et ses dérivés : l anhydride nitreux N 2 O 3, l ion peroxynitrite (ONOO ). NO * : la réaction est catalysée par la NOS mitochondriale, implique un atome d azote de la L-Arginine et une O 2. Ce radical est peu réactif et diffusible dans les milieux biologiques. Il peut être cependant oxydé en ion nitrosonium NO + ou réduit en ion nitroxyle NO +. Rôle : les ERN interviennent essentiellement dans le processus de coagulation sanguine, ceux sont des vasodilatateurs (cardiovasculaires), responsables d une relaxation des cellules musculaires lisses. Sur le plan neurologique, sont impliqués dans la neurotransmission et la plasticité neuronale ; immunologique, signalisation intra et intercellulaire, dans l apoptose, et les mécanismes de défenses, physiologique, maintien de l intégrité muqueuse gastrointestinale. Toxicité : NO * > ions nitrites (NO 2 ) il peut aussi fixer un groupement nitroxyle sur les acides aminés, comme la tyrosine, pour générer la nitrotyrosine. En présence d un excès de NO, on parle de «stress nitrant». La réaction de NO avec l O 2 entraîne la formation de l ion peroxynitrite (ONOO ) qui est considéré (espèce réactive de l azote & de l oxygène). La protonation en acide peroxynitreux (ONOOH) donne une espèce très oxydante. L autooxydation du NO par O 2 est à l origine de la formation d anhydride nitreux, le N 2 O 3. Ainsi, chaque ERN possède une réactivité qui lui est propre et peut agir sur divers constituants cellulaires. Source des espèces réactives La chaine respiratoire mitochondriale : formation de trois espèces radicalaires O 2 *-, OH *, H 2 O 2 : sources majeures : Complexe I (NADH-ubiquinone réductase) & Complexe III (Ubiquinone-cytochrome C réductase) Enzymes inflammatoires : NADPH oxydase (ubiquitaire) au cours de la phagocytose, cette enzyme est capable de réduire l O 2 en O 2 * Analytical Toxicology - Stress Oxydatif 4
NO synthétase (I, II, III, m) MPO (myéloperoxydase) : à l intérieur de la vacuole phagocytaire, l anion superoxyde est dismuté en péroxyde d hydrogène qui se transforme en acide hypochloreux sous l action de la myeloperoxydase. Systèmes des Cyt P450 : surtout CYP2E1+++ : l autooxydation du Cyt P450 (Fe II ) en Cyt P450 (Fe III ) entraine une réduction de l O 2 en O 2 -*. Autres sources enzymatiques : MAO (monoamine réductase et H 2 O 2 ) Sources non enzymatiques : auto-oxydation de l adrénaline, dopamine, flavines, hydroquinone, hémoglobine à O 2 -*, H 2 O 2, * OH Les moyens de lutte contre le stress oxydatif Les antioxydants : toute substance qui, présente à faible concentration par rapport au substrat oxydable, est capable de ralentir ou inhiber l oxydation de ce dernier. Les antioxydants enzymatiques : 1 ère ligne de défense principalement représentée par : Superoxyde dismutase (SOD) métalloenzyme ubiquitaire (élimine l anion superoxyde par dismutation) Catalase: Enzyme héminique ubiquitaire (GR+++) (élimine H 2 O 2 par dismutation) Système Glutathion peroxydase / Glutathion réductase (GPx/GR) sélénoprotéine ubiquitaire (7 isoformes) (élimine 70% des proxydes organique et 94% de H 2 O 2 par réduction) Thiorédoxines peroxydases (Trx): sélénoenzymes NADPH dépendante (élimine H 2 O 2, ROOH, ONOO ) par réduction. Les antioxydants non enzymatiques : Vitamine E: sous forme α-tocophérol (la plus active et la plus absorbée) antioxydant majeur des structures lipidiques autre action ; neutralisation 1 O 2 Vitamine C : acide ascorbique : agent réducteur et chélateur sous forme d acide déhydro-l-ascorbique (DHA) réagit directement sur les radicaux libres et élimine H 2 O 2. Provitamine A (caroténoïdes) : β-carotène : précurseur de la vitamine A (interruption du processus de la peroxydation lipidique) Analytical Toxicology - Stress Oxydatif 5
Autres vitamines : Vitamine P (flavonoïdes), Coenzyme Q 10 Les oligoéléments : Se, Zn comme cofacteurs GPx, SOD1, SOD3 respectivement Protéines transporteuses : par séquestration des métaux impliqués dans la génération des ERO (transferrine Fe). Glutathion : comme cofacteur d enzyme (GPx) Autres mécanismes : réparation de l ADN Ceci en cas d insuffisance ou de défaillance des systèmes antioxydants précédents. La réparation de l ADN prévient les risques de mutagenèse (cancers). Agents toxiques et production endogène des ERO Chimiques : Métaux (As), Solvant(CCl 4 ), médicament (Paracétamol) Physiques : radiations ionisantes, rayonnement UV Dans certaines pathologies le stress oxydatif peut être une cause primordiale (cancers), ou bien facteur déclenchant (Maladie d Alzheimer), d autres peuvent être la cause secondaire du stress oxydatif (Diabète). Quantification des ERO Par mesure directe : (Chimiluminescence, résonance paramagnétique électronique) Par mesure indirecte : (marqueurs immuno-histochimiques) Quantification des marqueurs d oxydation Marqueurs d oxydation lipidiques (Ac anti-ldl oxydés) Marqueurs d oxydation protéiques : principalement par dosage des protéines carbonylées Analytical Toxicology - Stress Oxydatif 6