Conditions de culture Consommation d O 2 (nmoles O 2 /min)

Transcription

1 Effets de l anoxie/ré-oxygénation sur les chondrocytes équins Respiration cellulaire (fonction mitochondriale) des chondrocytes équins Pour les essais en oxymétrie, 10 7 chondrocytes articulaires équins ont été cultivés pendant 48 h à 21 % ou à 5 % d O 2 et en présence de 0, 1 ou 4,5 g/l de glucose. Durant ces 48 h de préconditionnement, le nombre des cellules est resté stable (faibles variations non significatives), sauf à 21 % d O 2 et 0 g/l de glucose où la décroissance est significative par rapport aux conditions de culture à 1 g/l de glucose (figure 52). Les conditions de culture les mieux adaptées au maintien cellulaire sont 5 % d O 2 et 1 g/l de glucose, avec une légère augmentation (non significative) du nombre de cellules. Figure 52 : Nombre de chondrocytes vivants après 48 h de préconditionnement sous différentes tensions d O 2 et à différentes concentrations en glucose dans le milieu (moyennes ± SD ; n= 3). Après la période de 48 h de préconditionnement aux différentes conditions de culture et pour effectuer les mesures en oxymétrie, la concentration du milieu en O 2 est fixée à 225 nmol d O 2 141

2 (50 % de saturation du milieu), ce qui équivaut à une tension en O 2 de 13%, valeur intermédiaire entre 5% et 21% d O 2. La consommation d O 2 est enregistrée en fonction du temps et le calcul de la pente de la courbe fournit la consommation en O 2, exprimée en nmoles O 2 /minute. Avant anoxie, la consommation d O 2 est linéaire, avec une très faible pente, sans influence de la concentration du glucose dans le milieu ou de la tension d O 2 utilisées lors du préconditionnement (figure 53 I et II, partie gauche avant anoxie). Les consommations d O 2 moyennes varient entre 0,081 et 0,106 nmoles O 2 /min (tableau VII, valeurs de pente avant anoxie). En tenant compte du nombre de cellules dans chaque essai, la consommation moyenne est estimée à 20,5 pmol O 2 /min/10 6 chondrocytes. Comparés à d autres lignées cellulaires comme les cellules THP-1 (promonocytes humains en lignée continue) dépendantes de l O 2 et les cellules thymiques, les chondrocytes consomment 26 fois moins d O 2 que les cellules THP-1 qui, dans nos conditions de culture habituelles, consomment 544 pmol O 2 /min/10 6 cellules (figure 53, III) et environ 10 fois moins que les cellules thymiques qui consomment 200 pmol O 2 /min/10 6 cellules (Verlaet et al., 2002). Conditions de culture Consommation d O 2 (nmoles O 2 /min) O 2 (%) glucose (g/l) Avant anoxie Après anoxie ,083 ± 0, ± ,081 ± 0, ± ± ± Moyenne à 21% O ± ± 0.027* ± ± ± ± ± ± Moyenne à 5% O ± ± Table VII : Consommation d O 2 par les chondrocytes équins, exprimée par les valeurs de pente (valeurs négatives) calculées à partir des courbes en oxymétrie (moyennes ± SD). Les chondrocytes équins ont été préconditionnés à 21 % ou à 5 % d O 2 avec des concentrations variables en glucose dans le milieu de culture (n = 3 pour chaque condition). * p < 0.01 versus avant anoxie. 142

3 Figure 53 : Consommation d O 2 par 10 7 chondrocytes préconditionnés pendant 48 h en suspension à 5 % (I) ou 21 % (II) d O 2 et en présence de concentrations variables en glucose dans le milieu, en comparaison avec cellules THP-1 (III). Courbes A, B et C : 0 g/l, 1 g/l et 4,5 g/l de glucose, respectivement. Les flèches à deux extrémités indiquent la période d anoxie (25 min) : extrémité gauche de la flèche, barbotage de N 2 ; extrémité droite de la flèche, ré-oxygénation. 143

4 La faible consommation d O 2 par les chondrocytes oblige à les amener en anoxie par barbotage de N 2 dans la cellule d oxymétrie (extrémité gauche de la flèche sur la figure 53), tandis que les cellules THP-1 atteignent spontanément l anoxie après 35 minutes de respiration (figure 53 III). Après ré-oxygénation, les courbes d oxymétrie montrent que les chondrocytes préconditionnés à 21 % d O 2 consomment d avantage d O 2, indépendamment de la concentration en glucose dans le milieu : la valeur moyenne de consommation d O 2 est significativement augmentée (figure 53 I et II, partie de droite ; tableau VII, après anoxie). Il n y a cependant pas de modification de l allure de la courbe. Par contre, l anoxie a clairement modifié la pente de la consommation d O 2 par les cellules THP-1 : la courbe est devenue parabolique, signe d une altération de la respiration cellulaire (figure 53 III, partie droite). La viabilité cellulaire est toujours restée supérieure à 90 % après l expérience d A/R. Sur les chondrocytes cultivés à 5 % d O 2, nous avons vérifié le fonctionnement de la cytochrome c oxydase (complexe de la chaîne respiratoire qui réduit l O 2 ) après perméabilisation au Triton X- 100 et l avons comparé à celui des cellules THP-1. Nous avons mesuré les valeurs de 0,35 et 1,02 µmol de cytochrome c oxydé/min/10 6 cellules, pour les chondrocytes et les THP-1 respectivement. La chaîne mitochondriale des chondrocytes est donc fonctionnelle, avec une activité 3 fois inférieure à celle des promonocytes humains Production d espèces radicalaires Les chondrocytes, après préculture, sont soumis à des cycles répétés d A/R puis analysés pour la détection d espèces radicalaires par RPE en présence d un piégeur de spin. La répétition des cycles d A/R n a pas modifié significativement les pentes des courbes d oxymétrie (figure 54) et la recherche d espèces radicalaires n a donné aucun résultat significatif : nous n avons enregistré aucun signal RPE d adduit de spin montrant la production d O 2 ou d un radical lipidique. L absence de signal RPE suggère que les cycles d A/R de courte durée n induisent pas une activation du métabolisme de l O 2 suffisante pour permettre l observation d une production d espèces radicalaires par les chondrocytes équins. 144

5 Figure 54 : Mesure de la consommation d O 2 par 10 7 chondrocytes avant et après plusieurs cycles d anoxie/ré-oxygénation. L anoxie est atteinte par barbotage de N 2 dans la solution (flèche verticale). Les flèches à deux pointes (A) indiquent les périodes d anoxie Effets métaboliques En 2 heures (durée totale de l expérience d A/R et d oxymétrie), les chondrocytes ont consommé entre 23 % et 35 % du glucose disponible dans le milieu (figure 55). La consommation de glucose était significativement plus élevée pour les chondrocytes en milieu à 4,5 g/l glucose, indépendamment de la tension en O 2 appliquée lors de la préculture. La production de lactate était plus élevée en présence de 1g/l de glucose, sans effet de la tension en O 2 utilisée lors de la préculture (figure 56). À 4,5 g/l de glucose, la production de lactate était statistiquement différente selon les conditions d oxygénation lors de la préculture (p < 0,01). 145

6 Figure 55 : Consommation du glucose (moyenne ± SD) par 10 7 chondrocytes pendant la durée de l expérience d oxymétrie avec A/R (n= 3). Les cellules ont été préconditionnées pendant 48 h à 5 % ou à 21 % d O 2, avec 1 ou 4,5 g/l glucose dans le milieu de culture. Figure 56 : Libération du lactate (moyenne ± SD) par 10 7 chondrocytes pendant l expérience d oxymétrie avec A/R (n= 3). Les cellules ont été préconditionnées pendant 48 h à 5 % ou à 21 % d O 2 et 1 ou 4.5 g/l glucose dans le milieu de culture. 146

7 Discussion Cette partie du travail apporte plusieurs observations intéressantes (Schneider et al., 2007) : 1. la faible consommation d O 2 par les chondrocytes équins (20.5 pmol O 2 /min/10 6 cellules comparés aux 544 pmol/min/10 6 consommés par les promonocytes THP-1), avec un effet très limité de l A/R, 2. l absence de formation d espèces radicalaires par les chondrocytes, même après plusieurs cycles d A/R. Il faut tenir compte de la sensibilité limitée de la technique RPE qui nécessite un nombre élevé (de l ordre de centres) pour obtenir un signal détectable, mais l absence de signal permet d exclure une production «massive» d espèces radicalaires par les chondrocytes sous l effet de l A/R et confirme leur métabolisme de type anaérobie. 3. l augmentation de la consommation de glucose et la diminution de la production de lactate par les chondrocytes cultivés à 4,5 g glucose/l, sans effet de la tension en O 2. Il existe peu de données sur l étude de la consommation d O 2 par les chondrocytes, et particulièrement par les chondrocytes équins. La consommation d O 2 par les chondrocytes articulaires bovins (animaux âgés de 18 à 24 mois) soumis à 10 % et 21 % d O 2 se situe entre 7,7 et 12 nanomoles d O 2 /h/10 6 cellules, correspondant à 128,3 et 200 pmoles/min/10 6 cellules (Zhou et al., 2004). Cette consommation est similiaire à celle des cellules thymiques (lignée cellulaire dépendante d O 2 ) (Verlaet et al., 2002) et plus élevée que celle que nous avons mesurée. Cette différence peut difficilement s expliquer par l espèce, mais par les conditions de travail : Zhou et al. ont utilisé des chondrocytes isolés mais non soumis à une période de culture préalable et ont réalisé leurs expériences d oxymétrie en présence de 1 g/l glucose. D autres auteurs ont observé une augmentation de la consommation en O 2 lorsque les chondrocytes sont soumis aux hautes concentrations d O 2 (Lane et al., 1977), augmentation qui contribuerait à la production de radicaux libres suite à une altération de la chaîne mitochondriale. Quelques travaux ont été consacrés à la mesure de la consommation d O 2 par les chondrocytes dans une perspective de «tissue engineering», pour multiplier les chondrocytes et obtenir un nombre important de cellules destinées à une utilisation de réparation du cartilage (Haselgrove et al., 1993; Nehring et al., 1999; Obradovic et Meldon, 2000 ; Malda et al., 2004). Notre but était tout différent : nous avons utilisé des chondrocytes matures maintenus en culture sans dédifférenciation et sans chercher à provoquer leur multiplication, en vue de mesurer leur consommation d O 2 et leur 147

8 réponse à l A/R. Les résultats présentés dans ce travail ne peuvent donc pas être comparés à ceux mentionnés dans ces études. La faible consommation d O 2 par les chondrocytes équins confirme nos observations précédentes où, soumis aux conditions de privation en O 2 quasi totale, les chondrocytes pouvaient survivre en culture pour des durées de plusieurs jours (Schneider et al., 2004). Les chondrocytes ont également survécu à l absence de glucose pendant 48 h et maintenu une consommation d O 2 similaire à celle des chondrocytes préconditionnés en présence de 1 or 4,5 g/l glucose. Ces observations suggèrent que la phosphorylation oxydative mitochondriale contribue peu à l apport énergétique nécessaire aux chondrocytes pour lesquels la glycolyse anaérobie oxydative (ou la β-oxydation des lipides) pourrait être la source dominante d ATP. Les chondrocytes articulaires pourraient disposer d un stock important de réserves en énergie. On a émis l hypothèse que les mitochondries des chondrocytes sont dépourvues en certains cytochromes et que la stimulation de la glycolyse dans le cartilage articulaire est obtenue par des oxydants exogènes tels que l O 2 en condition physiologique ou d autres oxydants en condition d absence d O 2 (Lee et Urban, 2002). Une mesure de l activité de la cytochrome c oxydase des chondrocytes équins a montré que cette activité était présente, bien qu inférieure à celle des cellules THP-1. La très faible consommation d O 2 par les chondrocytes ne peut donc pas s expliquer par une chaîne mitochondriale incomplète au niveau de la cytochrome c oxydase (complexe IV), mais elle pourrait être le résultat d une activité réduite des complexes I, II et III. Dans les chondrocytes articulaires humains ostéoarthritiques cultivés en monocouche, on a décrit une activité réduite des complexes II et III et signalé que la plus grande partie des mitochondries étaient «de-energized», tandis que la masse mitochondriale était augmentée (Maneiro et al., 2003). Les mitochondries présentaient une dépolarisation du potentiel transmembranaire, conduisant à un gonflement mitochondrial avec rupture de la membrane et libération de facteurs inducteurs d apoptose. Le même groupe de chercheurs a signalé une activité réduite du complexe I de la chaîne mitochondriale associée au vieillissement et une suppression de l activité du complexe IV par le NO (Maneiro et al., 2005). Mais ces conditions ne correspondent pas à nos conditions de travail. Après anoxie, la consommation d O 2 par les chondrocytes articulaires équins reste linéaire (pas de modification de l allure de la pente respiratoire). Les chondrocytes conditionnés à 5 % d O 2 montraient une réduction de la respiration mitochondriale, mais sans atteindre la signification 148

9 statistique, et ceux préconditionnés à 21 % O 2 une accélération significative de la consommation d O 2, indépendamment de la concentration en glucose du milieu. Cette accélération est modeste si on la compare aux modifications de pente et d allure observées pour les cellules THP-1 soumises à l A/R. Actuellement, il est impossible de déterminer si cette augmentation postanoxique de la consommation d O 2 est due à une augmentation de l activité mitochondriale ou à l activité d une autre oxydase comme une oxydase cytoplasmique «NADPH-oxidase-like» (Moulton et al., 1997). La faible activité de la fonction respiratoire mitochondriale peut expliquer que les chondrocytes articulaires équins ne répondent pas (même en l absence de glucose) à l anoxie profonde et aux cycles d A/R par une importante production d espèces radicalaires. Des études antérieures sur chondrocytes humains et sur chondrocytes de lapin, cultivés à 21 % d O 2, ont montré l existence d un métabolisme oxydant activé après anoxie (Henrotin et al., 1993 ; Tiku et al., 1998). On ne peut exclure une réactivité différente des chondrocytes équins, mais l explication la plus vraisemblable à cette divergence de résultats se trouve dans les différences entre techniques utilisées. La formation de ROS après anoxie a été démontrée par des mesures en fluorescence, essentiellement pour la détection d H 2 O 2, et par la mesure du pentane formé lors de la peroxydation lipidique, deux produits dont la formation est consécutive à une production d espèces radicalaires mais qui sont des produits plus stables que les espèces radicalaires et qui peuvent s accumuler au cours de la réaction (Henrotin et al., 1993). Tiku et al. (1998) mentionnent une production d O 2 et d H 2 O 2 par les chondrocytes, mais après une stimulation par le PMA en présence de Fe 2+, et la formation d OH par le cartilage non stimulé (lapin et homme) toujours en présence de Fe 2+. Leurs conditions de travail simulent les conditions rencontrées dans l inflammation, considérée comme pouvant être accompagnée d une production des ROS (Kawai et al., 2000), plutôt qu une situation d A/R sans autre stimulation. Lorsque les chondrocytes sont cultivés in vitro à 21 % d O 2, ils se trouvent en état d hyperoxie (par rapport à leurs conditions in vivo) capable de perturber leur statut redox (Cernanec et al., 2002 ; Schneider et al., 2004 ; Mathy-Hartert et al., 2005) et d entraîner une réponse à l anoxie. Par ailleurs, aucune étude en RPE n a démontré la formation d espèces radicalaires par les chondrocytes, quelle que soit leur espèce d origine. La détection d un signal RPE nécessite un 149

10 nombre important de cellules pour obtenir le nombre suffisant de centres radicalaires capables de former le signal RPE. On peut donc conclure que la production d espèces radicalaires par les chondrocytes sans stimulation autre que l A/R reste très faible, en deçà des limites de détection par RPE couplée au spin trapping. Une dernière observation surprenante fut que la consommation en glucose et la libération de lactate étaient dépendantes de la concentration en glucose dans le milieu et non de la tension en O 2 appliquée lors du préconditionnement. À 4.5 g/l de glucose, les chondrocytes ont consommé davantage de glucose, sans modification significative de la pente respiratoire. On peut invoquer un transport accru du glucose conduisant au stockage sous forme de glycogène ou à une synthèse accrue des protéoglycanes ou des lipides (Lee et Urban, 2002). On a décrit une réduction de la consommation d O 2 induite par le glucose (effet Crabtree) avec une glycolyse limitée, suggérant un possible empoisonnement des chondrocytes articulaires par un excès de glucose (Otte, 1991) et trouvé que la consommation en glucose et la production de lactate par les chondrocytes aux basses tensions d O 2 étaient supérieures à celles des fibrocytes cultivés à 21 % (effet Pasteur) (Marcus, 1973). Dans nos expériences, la consommation du glucose était supérieure à la libération du lactate, indépendamment des conditions de culture, et la production de lactate était réduite pour les cellules conditionnées à 4,5 g/l de glucose, indicateur possible d une modification du métabolisme du glucose lorsque sa concentration extracellulaire est élevée, permettant d éviter un excès de lactate et une réduction du ph intracellulaire. Pour une expérimentation sur les chondrocytes articulaires équins imitant au mieux les conditions in vivo, il est sans doute préférable d utiliser un milieu de culture avec une concentration physiologique en glucose Production des ROS par les synoviocytes Respiration cellulaire (fonction mitochondriale) lors de l A/R Après culture jusqu à confluence suivie de trypsination (viabilité cellulaire > 95%), les synoviocytes (HIG-82 et cellules primaires équines) présentent une respiration mitochondriale régulière. Les courbes de consommation d O 2 sont semblables pour les deux lignées de synoviocytes ; elles sont linéaires, avec une valeur de pente égale à 11 nanomoles O 2 /min/

11 cellules (figure 57, courbe 1) cellules consomment en 20 minutes la totalité de l O 2 dissous dans le milieu et atteignent l anoxie sans nécessité d un barbotage à l azote. Les cycles d A/R entraînent une diminution progressive de la pente respiratoire (figure 57, courbes 2, 3 et 4). Figure 57 : Consommation d O 2 par 10 7 synoviocytes (HIG-82) et effets de cycles répétitifs d A/R (n= 3). Les flèches à deux pointes (A) indiquent les périodes d anoxie. Les 4 pentes respiratoires (1 à 4) sont égales à 11, 5,5, 4 et 3,2 nanomoles d O 2 consommé/min/10 7 cellules. Après la première période d anoxie, la valeur de la pente respiratoire est tombée à 5,55 nanomoles O 2 /min/10 7 cellules (réduction de 50 %) et ce ralentissement a continué aux deuxième et troisième périodes d anoxie avec des valeurs de pente respiratoire égales à 4.0 et 3.22 nanomoles O 2 /min/10 7 cellules respectivement, ce qui montre une diminution de moins en moins marquée. Après la dernière période d anoxie, l allure de la courbe change: elle n est plus linéaire, signe de l existence de dommages mitochondriaux. La viabilité cellulaire était 75 % à la fin de l étude. Pour vérifier l effet d une stimulation préalable des synoviocytes sur leur réponse ultérieure à l A/R, nous avons utilisé le PMA, un activateur du complexe NADPH-oxydase via la protéine kinase C. Il a été ajouté (à 10-7 M) aux synoviocytes après 7 minutes de respiration cellulaire et a provoqué une accélération de la consommation d O 2 : la valeur de la pente mesurée en oxymétrie a atteint, après PMA, 150% de la valeur avant PMA. Mais cette stimulation au PMA n a pas 151

12 influencé la réponse ultérieure à l A/R: le ralentissement de la respiration cellulaire s est maintenu dans les mêmes proportions Mise en évidence d une production d espèces radicalaires par RPE-spin trapping lors de l A/R La production d espèces radicalaires par 10 7 synoviocytes (cellules HIG-82 et synoviocytes équins primaires) a été démontrée par RPE en présence de POBN avec ou sans addition d éthanol (POBN/EtOH). Les spectres RPE sont représentés sur les figures 58 et 59. Les spectres contrôles sont obtenus avec des synoviocytes équins en normoxie en présence de POBN/EtOH : aucun signal RPE n est mesurable (figures 58 A et 59 A). Par contre, après les cycles d A/R, on enregistre un spectre RPE à six lignes, caractéristique des adduits de spin POBN/ CH(OH)CH 3 (POBN/ethoxy) avec les constantes de couplage suivantes : a N = 15.7 G et a H = 2.7 G (figures 58 B et 59 B). Le signal RPE des synoviocytes équins primaires (figure 58 B) était plus intense que celui des synoviocytes HIG-82 (figure 59 B). En l absence d éthanol, le spectre RPE montre un signal à 3 lignes, avec la constante de couplage a N = 15,2 G, caractéristique d un adduit de spin POBN/lipide suggérant la formation de radicaux centrés sur un carbone d une chaîne lipidique (figure 59 C). 152

13 Figure 58 : Signal RPE produit par 10 7 synoviocytes équins après 3 cycles d A/R (spin trap : POBN en présence d éthanol). Les flèches verticales indiquent les lignes caractéristiques du signal: présence d un adduit POBN/éthoxy. Nombre de scans : 6. (A) Contrôle (cellules en normoxie) et (B) cellules soumises aux cycles d A/R. La flèche horizontale indique le sens de l augmentation du champ magnétique (H). 153

14 Figure 59 : Signal RPE produit par 10 7 synoviocytes (HIG-82) à la fin de 3 cycles d A/R (spin trap : POBN). Les flèches verticales indiquent les lignes caractéristiques du signal. La flèche horizontale indique le sens de l augmentation du champ magnétique A : contrôle (cellules en normoxie). B : cellules soumises aux cycles d A/R en présence d éthanol, signal d un adduit POBN/éthoxy. C : cellules soumises aux cycles d A/R en l absence d éthanol, signal d un adduit POBN/lipide. 154

15 Effets de stimulateurs sur la production globale de ROS (mesure de l éthylène par chromatographie en phase gazeuse) Variabilité de la production de ROS selon l origine des synoviocytes Les synoviocytes présentent un métabolisme oxydatif de base, mesurable sans aucune stimulation préalable et correspondant à une production d éthylène de 2 à 25 picomoles/10 6 cellules, avec une importante variabilité selon la culture et l origine de la membrane synoviale. Pour cette raison, dans toutes les expériences, la production d éthylène par les cellules activées a été comparée à celle des cellules non activées prise comme 100 % (contrôle). Cette importante variabilité de base a rendu impossible la démonstration claire d un effet de l A/R sur la production d éthylène. Réponse à une stimulation par le PMA et effet du DPI Le PMA exerce un effet activateur, extrêmement variable selon l origine des synoviocytes (figure 60, histogrammes 2, 3 et 4). La production d éthylène après PMA atteint parfois jusqu à 1000 % par rapport au contrôle sans stimulation, mais elle peut aussi ne pas dépasser 150 %. L intensité de l effet du PMA est liée à l activité oxydante de base que présentent déjà les synoviocytes sans stimulation. L effet activateur est lié à la concentration en PMA utilisée (figure 60, histogrammes 4, 5 et 6). Il augmente avec le nombre de synoviocytes utilisés, mais pas de manière proportionnelle à leur nombre (figure 61, histogrammes 2 et 3) et est aboli lorsque l activation est faite après addition de diphényl iodonium (DPI), un inhibiteur des enzymes à flavine (figure 61, histogramme 4). L utilisation du DPI peut entraîner une chute de la production d éthylène endessous de la valeur du contrôle. 155

16 Figure 60 : Production d espèces oxydantes (estimée par la mesure de l éthylène libéré à partir du KMB) par synoviocytes équins activés par le PMA, exprimée en % de la valeur contrôle (C : synoviocytes non activés) (n=3). Histogrammes 2, 3 et 4 : activation par 10-7 M PMA ; les synoviocytes sont isolés à partir de trois échantillons de membrane synoviale différents. Histogrammes 5 et 6 : activation respectivement par 10-8 et 10-9 M PMA ; les synoviocytes proviennent de la même membrane synoviale que ceux de l histogramme 4. Figure 61 : Production d espèces oxydantes (estimée par la mesure de l éthylène libéré à partir du KMB) par les synoviocytes équins activés par 10-8 M PMA, exprimée en % de la valeur contrôle (C : synoviocytes non activés) (n=3). Histogramme 2 : synoviocytes ; histogramme 3 : synoviocytes ; histogramme 4 : synoviocytes M DPI. 156

17 Réponse à une stimulation par le TNF-α et les LPS Comme les synoviocytes répondent à une stimulation par un agent pharmacologique, nous avons aussi utilisé deux agents de stimulation naturels pour tester leur réponse: le TNF-α et les LPS. Ces agents ont été pré-incubés durant une nuit avec les cellules avant l étude de production d éthylène. Ils ont induit une stimulation modérée des synoviocytes (figure 62, histogrammes 2 et 3), avec un effet inhibiteur du DPI (figure 62, histogramme 4). Figure 62 : Production d espèces oxydantes (estimée par la mesure de l éthylène libéré à partir du KMB) par les synoviocytes équins activés par 10 U de TNF-α (histogramme 2) ou 1 µg de LPS (histogramme 3) exprimée en % de la valeur contrôle (C : synoviocytes non activés) (n=3). Histogramme 4 : effet du DPI sur l activation par le LPS. Nous avons confirmé l action stimulante du TNF-α par des essais en RPE en utilisant le spin trap DMPO. Un signal RPE de faible intensité a été enregistré lorsque les cellules sont stimulées par 100 U de TNF-α. Le spectre RPE est constitué de quatre raies d intensité 1 :2 :2 :1, caractéristique de l adduit de spin DMPO-OH résultant de la décomposition de l adduit DMPO- OOH formé lors de la réaction du spin trap avec d O 2 (figure 63, flèches noires) (Britigan et al., 1990 ; Mouithys-Mickalad et al., 2001). La présence d un signal RPE confirme qu il y a une faible production de radicaux par les synoviocytes stimulés au TNF-α, mais des essais complémentaires sont nécessaires pour préciser ces premiers résultats, particulièrement parce que 157

18 le spectre RPE montre également trois raies plus intenses (figure 63, flèches rouges) qui sont dues à l oxydation du spin trap DMPO au contact des cellules et qui viennent masquer l adduit de spin formé. Figure 63 : Signal RPE produit par 10 7 synoviocytes stimulés par le TNF-α (100 U) en présence du spin trap DMPO. Les 4 flèches verticales noires indiquent les lignes caractéristiques du signal et les trois flèches rouges les raies caractéristiques de l oxydation du DPMO par les cellules. La flèche horizontale indique le sens de l augmentation du champ magnétique (en Gauss) Discussion Les observations essentielles de cette partie du travail sont les suivantes (Schneider et al., 2005) : - l étude en oxymétrie a démontré que les synoviocytes consomment l O 2, que la fonction mitochondriale des synoviocytes est altérée par les cycles répétitifs d A/R et que leur consommation d O 2 peut être activée par le PMA. - la RPE a prouvé que les synoviocytes produisent des radicaux libres sous l effet des cycles d A/R. 158

19 - l étude par la mesure de l éthylène a montré que les synoviocytes sont capables de produire des ROS, que cette activité oxydante existe à l état basal (auto-activation) avec une grande variabilité selon le lot cellulaire et qu elle peut être augmentée par une stimulation au PMA, au TNF-α et par les LPS. La consommation d O 2 par les synoviocytes est élevée (de l ordre de la nanomole d O 2 /min/10 6 cellules), environ deux fois plus élevée que celle des cellules THP-1. Cette consommation importante pourrait expliquer leur sensibilité à l A/R. Sous l effet des cycles d A/R, la courbe oxymétrique montre une augmentation du temps nécessaire pour consommer tout l O 2 réintroduit lors de la ré-oxygénation (diminution de la pente respiratoire) et ce retard s accroît après chaque nouvelle période d anoxie. Cette diminution ne peut pas être totalement imputée à une mortalité cellulaire en cours d expérience puisque la viabilité cellulaire comptée à la fin des manipulations est toujours restée égale ou supérieure à 75 %. De plus, lors de la dernière mesure de la consommation d O 2, la courbe oxymétrique n est plus linéaire, témoin d une altération de la fonction mitochondriale. La mesure de la consommation d O 2 est considérée comme le reflet de la fonction mitochondriale, mais pour les synoviocytes équins, on ne peut pas exclure la participation d une activité enzymatique de type «NADPH-oxidase like» ou NOX puisque la stimulation par le PMA augmente la consommation d O 2 et qu il est admis que cet agent pharmacologique agit, via la PKC, sur l activité de la NADPH-oxydase (Babior, 1999). L existence d une activité de type NOX dans les synoviocytes à l état basal est confirmée par les mesures de l éthylène. Les synoviocytes sont capables de produire de l éthylène à partir du KMB : la formation d éthylène résulte de l attaque du KMB par les espèces radicalaires ( OH, ions ferryls, radicaux alcoxyles ou peroxyles) et deux molécules d éthylène sont produites à partir de deux molécules de KMB (Winston et al., 1998 ; Mouithys-Mickalad et al., 2001). Dans le modèle de mesure de l éthylène comme témoin d une attaque oxydante du KMB, l addition d HRP augmente considérablement la réaction parce que cette enzyme en utilisant H 2 O 2 produit des espèces plus oxydantes qu H 2 O 2 lui-même (Rush et Koppenol, 1986). La production d éthylène induite par l activité oxydante des synoviocytes équins peut être attribuée à une production d H 2 O 2, lui-même dérivé d O 2 produit par l activité d une enzyme de type NADPH oxydase. Sans stimulation, les synoviocytes équins en culture présentent déjà cette activité, mais 159

20 la stimulation par le PMA l augmente de manière dose-dépendante. L effet stimulateur du PMA est bloqué par le DPI, un composé qui agit au niveau de la flavine dans les NOX. Mais le PMA active également la NOS (Tepperman et al., 2000) et le DPI n est pas spécifique des NOX mais touche d autres enzymes à flavine (Hancock et Jones, 1987), comme la NOS dont on admet qu elle peut produire O 2 en plus du NO, capables de réagir in situ et de produire le peroxynitrite, un puissant agent peroxydant (Vasquez-Vivar et al., 1998). La réponse positive des synoviocytes à une stimulation par le TNF-α ou les LPS (augmentation de la production d éthylène), deux substances agissant par la voie des récepteurs membranaires et aboutissant à la stimulation de la PKC, apporte un argument supplémentaire au rôle des NOX et NOS. L A/R a induit des altérations de la chaîne respiratoire mitochondriale (observées en oxymétrie) et il est admis qu une chaîne mitochondriale altérée conduit à une production d O 2 ou d autres espèces radicalaires (Di Lisa et Bernardi, 1998 ; Bernardi et al., 2001 ; Andreyev et al., 2005). Cependant, sur la production globale de ROS par les synoviocytes équins mesurée par la production d éthylène à partir de l oxydation du KMB, nous n avons pas observé d effet significatif de l A/R. Ici, il faut rappeler que la méthode chromatographique utilisant l oxydation du KMB en éthylène mesure surtout l activité de production des ROS par des enzymes situées près ou à la surface des cellules. Pour que les espèces radicalaires et oxydantes produites dans la mitochondrie ou le cytosol puissent agir sur le KMB, il faut soit que le KMB et l HRP pénètrent dans la cellule, ce qui n est pas démontré pour le KMB et impossible pour l HRP, soit que ces espèces atteignent la surface cellulaire. On ne peut pas exclure qu au cours de l A/R une production d O 2 et de ses dérivés ait eu lieu au niveau de la chaîne respiratoire mitochondriale, par la NOS mitochondriale activée ou par la xanthine oxydase, mais qu elle ait été insuffisante pour amener l oxydation du KMB à la surface de la cellule. Il faut rappeler aussi que la durée de chaque période d anoxie était courte (25 minutes). L étude en RPE confirme cependant que les synoviocytes réagissent aux cycles d A/R par une production de radicaux libres, sans addition de stimulateurs exogènes. Les signaux observés sont ceux des adduits POBN/éthoxy qui peuvent être attribués à la réaction d une espèce radicalaire dérivée de l O 2 avec le couple POBN/EtOH (Du et al., 1999). Des études antérieures ont montré que la POBN peut traverser la membrane mitochondriale, arriver dans le compartiment matriciel 160

21 et former des adduits avec des dérivés de l O 2 produit pendant l A/R (Du et al., 1998 et 1999). Les spectres RPE enregistrés avec les synoviocytes de type B sont similaires aux spectres RPE obtenus dans les études précédentes faites sur les mitochondries isolées. On admet que lors de l A/R, O 2 est produit du côté matriciel de la membrane mitochondriale (Andreyev et al., 2005) et peut induire des dégâts cellulaires par une réaction avec le fer complexé des enzymes hémiques. L O 2 est capable d attaquer l aconitase, de libérer le fer labile du groupe [4Fe-4S] 2+ et de former Fe 2+ (Vasquez-Vivar et al., 2000). Il produit aussi H 2 O 2 par dismutation (spontanée ou catalysée par la SOD) et, via H 2 O 2, des espèces à haute réactivité comme les radicaux hydroxyles et peroxyles, responsables de dégâts cellulaires importants et en particulier de la peroxydation lipidique. L O 2 peut également réagir avec le NO dont la production est augmentée à l intérieur des mitochondries pendant l anoxie (Andreyev et al., 2005 ; Ghafourifar et Cadenas, 2005). À partir de NO et d O 2 peut se former le peroxynitrite et à partir de ce dernier de nouvelles espèces radicalaires comme OH qui favorise la peroxydation des phopholipides membranaires et produit les espèces radicalaires lipidiques dérivées (Valdez et al., 2000). Avec la POBN sans addition d éthanol, les adduits de spin formés révèlent la présence d espèces radicalaires d une durée de vie prolongée. Ces radicaux dérivent probablement de la peroxydation lipidique mitochondriale et confirment l hypothèse d une production in situ d OH ou d autres espèces radicalaires à l origine de la lipoperoxydation. À ce stade du travail, il est impossible d exclure une origine cytoplasmique de l O 2 et des espèces dérivées (activité de la xanthine oxydase, stimulation de la NOX par l hypoxie), mais l existence simultanée d une fonction respiratoire altérée et d une production de radicaux libres suggère que la chaîne respiratoire mitochondriale altérée est la principale responsable de la production des radicaux. Il est également impossible de définir à quel moment les radicaux libres sont apparus. Sur la base d études précédentes faites avec d autres types de cellules, on peut estimer que la production des radicaux libres débute pendant l anoxie et augmente lors de la réoxygénation (Mouithys-Mickalad et al., 2002). 161

22 Les synoviocytes forment la frontière entre la membrane interne de la capsule articulaire et la cavité articulaire. Ils sont exposés à une tension d O 2 > 12 % sur le versant artériel et à une hypoxie relative (à peu près 7 % d O 2 ) sur le versant qui touche le liquide synovial (Grimshaw et Mason, 2000). Ces conditions de vie pourraient les rendre plus sensibles à l A/R que les chondrocytes articulaires qui n ont que des faibles besoins en O 2. Leur sensibilité à l A/R et leur capacité à produire des ROS suggèrent qu ils pourraient jouer un rôle précoce dans le développement de l OAD, initiateurs de la réaction d autres cellules de l articulation comme les chondrocytes et entraînant une cascade de réactions amplificatrices de la réponse inflammatoire, notamment une production de médiateurs par les chondrocytes avec des effets «retour» sur les synoviocytes eux-mêmes Interactions entre synoviocytes et chondrocytes dans un modèle de coculture Effets de la co-culture sur la production de médiateurs inflammatoires Nous avons précédemment démontré qu après 48 h de co-culture synoviocytes/chondrocytes, il y avait une réduction catastrophique de la viabilité des synoviocytes lorsque ceux-ci avaient été précultivés à 10 % d O 2 avant leur utilisation en co-culture (voir figure 51). Sur la base de ces résultats, seul le modèle de co-culture utilisant des synoviocytes pré-cultivés à 21 % d O 2 a été utilisé pour l étude de la production des médiateurs. La PGE 2, l IL-1β, les protéines nitrées et les nitrites/nitrates ont été mesurés dans les surnageants de pré-culture (2 jours) des synoviocytes à 21 % et des chondrocytes à 10 % d O 2. Les même paramètres ont ensuite été mesurés dans les surnageants après 2 jours d une co-culture effectuée à 10 % d O 2 avec des synoviocytes soumis à une courte période d A/R après la préculture à 21 % d O 2. Les effets de la co-culture synoviocytes/chondrocytes sur la production de médiateurs inflammatoires sont repris dans le tableau VIII et sur la figure 64. Durant la pré-culture, il y a une différence marquée entre synoviocytes et chondrocytes dans la production de PGE 2 et de nitrites (pris comme témoins d une activité de la NOS) : les chondrocytes produisent très peu de PGE 2 par comparaison avec les synoviocytes, mais ils produisent plus de nitrites (figure 64 et tableau VIII). 162

23 Médiateur Surnageant après préculture (2 jours) Synoviocytes (n=3) Chondrocytes (n=6) Surnageant après coculture (2 jours) (n=3) 21 % O 2 10 % O 2 10 % d O 2 PGE 2 (pg/ml) 882±175 7,8±4,3 1617±112 IL-1β (pg/ml 41±22 36,5±4,5 74±9 Nitrites (µm) 19±1 52±10 21±1 Protéines nitrées (nm) 0 0 0,5±0,7 Tableau VIII : Effets de la co-culture synoviocytes ( cellules)/chondrocytes ( cellules) sur la production de médiateurs inflammatoires mesurés dans les surnageants de culture ou de coculture. Les synoviocytes sont précultivés à 21 % d O 2 et soumis à une courte période d A/R avant la mise en co-culture. Figure 64 : Production de PGE 2 par les synoviocytes (S) et les chondrocytes (C) équins après préculture et par les synoviocytes/chondrocytes après co-culture. Les synoviocytes sont précultivés à 21 % d O 2 et soumis à une courte période d A/R avant la mise en co-culture. 163

24 Après la co-culture, la production des nitrites est réduite (inférieure à la valeur attendue si l on additionne la production individuelle des deux types cellulaires). La concentration de l IL-1β paraît augmentée après la co-culture, mais la valeur mesurée correspond pratiquement à la sommation des valeurs avant co-culture. Les protéines nitrées deviennent mesurables après coculture. Quant à la production de PGE 2, elle est doublée Discussion Comme il ressort des mesures de la production globale des ROS et des études en RPE que les synoviocytes ont une activité oxydante stimulable et que cette activité pourrait agir sur les chondrocytes, il était intéressant de développer un modèle de co-culture et d étudier les interactions des deux types cellulaires. Cette étude a été faite d abord en conditions de base, c est-à-dire en l absence de toute stimulation par A/R. Les deux types cellulaires ont été précultivés dans le milieu qui servira pour la co-culture pendant deux jours à 10 % d O 2 pour les chondrocytes et à 21 % pour les synoviocytes, conditions qui assurent leur viabilité (voir plus haut). Ensuite, les synoviocytes ont été soumis à une courte période d A/R puis les synoviocytes et les chondrocytes ont été mis en co-culture à 10 % d O 2 dans un rapport 1/3 pour tenir compte de la capacité de multiplication des synoviocytes et surtout de la perte du nombre de chondrocytes pendant la durée de la co-culture. Pour suivre les effets de la co-culture, les concentrations de PGE 2, d IL-1β et de nitrites ont été mesurées dans les surnageants comme marqueurs d activité cellulaire liés à une réaction inflammatoire et celle des protéines nitrées comme marqueur d un métabolisme oxydant accru. Les effets de la co-culture se traduisent essentiellement sur la production de PGE 2, un médiateur capable d influencer les chondrocytes (Von Rechenberg et al., 2000). La production de PGE 2 est doublée malgré une chute du nombre total de cellules (voir figure 51) et, compte tenu de la faible production de ce médiateur par les chondrocytes durant la pré-culture, on peut penser que les synoviocytes sont les principaux responsables de l augmentation de la PGE 2. On peut suggérer que l A/R a eu un effet de «priming» sur les synoviocytes ou qu ils subissent l effet de médiateurs libérés par les chondrocytes. Mais les résultats obtenus avec ce modèle sont préliminaires. La longueur des manipulations et les difficultés techniques (nombre suffisant de cellules, simultanéité des cultures, difficultés de 164

25 manipulation sous atmosphère contrôlée) n ont pas permis de multiplier les co-cultures pour une étude plus approfondie de cet effet de «priming» ou pour aborder les modifications du métabolisme oxydant des cellules en co-culture, soit par la mesure de l éthylène soit par l étude en RPE. 165

26 6. Discussion générale et perspectives La littérature scientifique consacrée à l ostéo-arthropathie dégénérative équine fait référence à l existence d un stress oxydant en relation avec des phénomènes d A/R et des réactions inflammatoires et au rôle délétère des RNOS (Auer et al., 1990, 1991 et 1993 ; Grootveld et al., 1991). Les chondrocytes sont souvent considérés comme les acteurs principaux dans le développement des pathologies articulaires pour leur sensibilité aux RNOS ou pour leur capacité à en produire (Tiku et al., 1996 et 1998 ; Ayache et al., 2002). Des travaux cliniques récents (Lejeune 2006 ; Lejeune et al., 2007a) ont montré une augmentation des marqueurs sanguins d une oxydation du collagène articulaire en relation avec le développement de la pathologie, soutenant l hypothèse de la présence d un processus oxydant. Une approche histologique (Schneider et al., 2006) a attiré notre attention sur le rôle possible de la membrane synoviale et des synoviocytes en montrant la présence intra-articulaire de formations issues d une dégénérescence de la membrane synoviale qui, selon une hypothèse formulée dans la littérature scientifique, pourraient être attribués aux phénomènes d anoxie/ré-oxygénation et aux réactions inflammatoires (McIlwraith, 1996). La suite de notre travail s inscrit ainsi dans la ligne des données de la littérature scientifique internationale et de nos observations récentes. Il s agissait d apporter des informations nouvelles sur le rôle du stress oxydant au niveau articulaire, en étudiant spécifiquement les deux types cellulaires principaux de l articulation, les chondrocytes et les synoviocytes, et en utilisant un modèle d agression apte à induire une activité oxydante au niveau cellulaire. Notre choix s est porté sur un modèle d A/R parce qu elle est de plus en plus impliquée dans la production de RNOS et s accompagne d une réaction inflammatoire (Roy et Mac Cord, 1982 ; Saris et Eriksson, 1995 ; Andreyev et al., 2005) et parce que son rôle est invoqué dans les pathologies articulaires (Allen et al., 1989). Notre hypothèse était la suivante : si un traumatisme aigu ou chronique peut modifier le débit sanguin dans la membrane synoviale et initier des cycles d A/R (par œdème et hypoxie tissulaire transitoire), il pourra y avoir une production de RNOS dans l articulation, capable de déclencher des dommages tissulaires participant au développement de la pathologie articulaire. 166

27 En premier lieu, il fallait développer des modèles de cultures primaires des cellules articulaires équines, chondrocytes et synoviocytes, et établir les meilleures conditions expérimentales d A/R. Les chondrocytes étant généralement considérés comme les éléments essentiels dans le développement des pathologies articulaires, nous avons commencé notre travail par l essai d établissement d un modèle d A/R de ces cellules. Pour la culture des chondrocytes, nous avons adapté des modèles précédemment développés essentiellement pour d autres espèces (homme, bovin, lapin, rat, ) et utilisé le modèle de culture en billes d alginate (culture en trois dimensions) qui permet de maintenir le phénotype cellulaire pour des cultures de longue durée. Les chondrocytes équins ont été cultivés sous différentes conditions en O 2 : 21 % (condition de culture habituelle mentionnée dans les publications scientifiques internationales), 5 % (condition proche de la situation in vivo) et 1 % (condition d anoxie). Le nombre total des chondrocytes est resté pratiquement constant jusqu au 10 e jour de culture dans toutes les conditions d oxygénation, mais une analyse approfondie de la culture avec identification des cellules vivantes, apoptotiques ou nécrotiques révèle des fluctuations intéressantes. À 21% d O 2, le nombre des cellules apoptotiques augmente régulièrement avec le temps de culture. Par contre, il diminue à partir du 11 e jour à 5 % et à 1% d O 2. À 1 % d O 2, il semble y avoir une adaptation aux conditions de culture après une phase «dépressive» caractérisée par une chute du nombre de cellules vivantes jusqu au 11 e jour de culture. 5 % d O 2 sont les conditions de culture les plus favorables au maintien du nombre de cellules. De ces premières études, il ressort deux observations importantes, la résistance des chondrocytes à l anoxie pendant plus de dix jours de culture, résultats qui sont en accord avec des travaux précédents, et leur sensibilité à 21 % d O 2, condition reconnue comme hyperoxique par rapport aux conditions in vivo. La résistance des chondrocytes à l anoxie rend difficile l établissement d un modèle d A/R sur ces cellules en culture, mais s explique par les conditions «naturelles» existant dans le cartilage où la tension en O 2 se situe vers 7 % (comme décrit dans la littérature scientifique internationale) et où la production des substrats énergétiques nécessaires au métabolisme cellulaire suppose un métabolisme anaérobie (voie de la glycolyse). L absence de variations significatives des concentrations en ATP quelles que soient les conditions d oxygénation de la culture semble confirmer un métabolisme anaérobie. La résistance des chondrocytes équins à l anoxie nous a amené à réfléchir aux concentrations en glucose utilisées pour leur culture, 4,5g/l, une concentration classiquement mentionnée dans les 167

28 publications antérieures. Cette haute concentration leur assure un apport en glucose supérieur à la concentration physiologique dans le liquide synovial et permet le maintien d un apport en substrats utilisables pour la glycolyse anaérobie. Nous avons alors étudié les capacités de survie des chondrocytes équins en faisant varier à la fois la concentration en O 2 et la concentration en glucose dans le milieu de culture, toujours avec l intention de réaliser un modèle d A/R et de déterminer les limites de survie des chondrocytes et leur capacité à être stimulés dans ce modèle. Nous avons observé un effet défavorable d une concentration en glucose non physiologique (4,5 g/l), apparaissant après 5 à 8 jours de culture, mais aussi que les chondrocytes équins sont capables de résister plusieurs jours aux conditions les plus drastiques : privation quasi totale d O 2 et absence de glucose. Cette étude étant originale, il ne nous a pas été permis de comparer nos résultats à ceux de la littérature. La résistance des chondrocytes équins à ces conditions extrêmes peut être attribuée à un métabolisme basé sur l utilisation de substrats lipidiques. Des analyses préliminaires (coloration positive à l Oil Red-O, mesure des lipides intracellulaires) ont permis d identifier des réserves lipidiques importantes dans les chondrocytes équins, avec un pourcentage important de cholestérol et d esters de cholestérol et ± 10 % d acides gras libres, substrats utiles à la production énergétique de la cellule. Il serait intéressant de poursuivre les recherches dans ce sens, de même qu il serait intéressant de compléter l étude des effets de la variation de la concentration en glucose et de la tension en O 2 par une recherche des proportions de cellules vivantes, nécrotiques et apoptotiques, ce qui n a pas été possible dans le cadre de ce travail. Cette résistance des chondrocytes posait la question de leur rôle initiateur potentiel dans le développement des pathologies articulaires liées à l A/R et incitait à nous tourner vers les synoviocytes, le second type de cellules articulaires qui peuvent intervenir dans le développement de l OAD. Pour la culture des synoviocytes équins, il existe peu de données dans la littérature internationale. Pour cette raison, tout au long du développement de notre modèle, nous avons comparé nos résultats à ceux obtenus avec une culture de synoviocytes en lignée continue (cellules HIG-82, synoviocytes de lapin «immortalisés»), culture dont les conditions ont été validées par des publications scientifiques antérieures (Georgescu et al., 1988). Les synoviocytes équins se 168

29 multiplient régulièrement à 10 % d O 2 (condition d oxygénation proche des conditions physiologiques) et peuvent être maintenus en culture pour de longue durée. À 21 % d O 2, ils survivent mais se multiplient plus lentement. Ils ne résistent pas à une période de 24 à 48 h d anoxie. Les conditions in vivo expliquent la sensibilité des synoviocytes à l anoxie : ces cellules sont en contact avec la circulation sanguine d une part et avec le liquide synovial d autre part. Elles reçoivent un apport limité en O 2 via le liquide synovial, mais sont oxygénées par le flux sanguin. Leur sensibilité à l anoxie, ajoutée au fait que nous avons observé une activité de type phagocytose (irrégulière, mais présente), nous permettait d émettre l hypothèse que les synoviocytes équins pourraient répondre à une stimulation comme l A/R par une activation du métabolisme oxydant et que, dans ce cas, ils pourraient exercer un rôle déclencheur dans les pathologies de l articulation liées à l A/R, notamment en stimulant les réactions (oxydante et inflammatoire) des chondrocytes. Nous avons alors abordé la seconde phase du travail, l étude du métabolisme oxydant des chondrocytes et synoviocytes équins sous l effet de l A/R, en envisageant la réponse mitochondriale (estimée par la mesure de la consommation d O 2 ), la production globale de RNOS (estimée par la mesure de l éthylène, produit de l oxydation d un substrat par les RNOS) et la production d espèces radicalaires (mesurée en RPE). La consommation d O 2 par les chondrocytes équins s est avérée être extrêmement réduite, indépendamment des conditions de culture avant la mesure en oxymétrie, et être peu influencée par les cycles d A/R. Cette faible consommation d O 2 ne peut pas être attribuée au dysfonctionnement du complexe terminal de la chaîne respiratoire mitochondriale ni à une mortalité cellulaire pendant l expérience. De même, nous n avons pu mettre en évidence ni une production de RNOS ni une production d espèces radicalaires par les chondrocytes soumis aux cycles d A/R. Il nous est impossible de comparer nos résultats aux données publiées antérieurement puisqu il n existe aucune étude comparable à celle que nous avons menée avec des techniques originales. La stimulation d un métabolisme oxydant par l A/R implique une production d espèces radicalaires dans la mitochondrie. Nos résultats négatifs ne sont pourtant pas inattendus si l on considère la remarquable résistance des chondrocytes lorsqu ils sont cultivés en anoxie et leur très faible utilisation d O 2 en toutes conditions d oxygénation. 169

30 À l opposé des chondrocytes, les synoviocytes équins sont capables d activité oxydante. Ils produisent des RNOS en l absence de stimulation (autre que la culture in vitro) et augmentent cette production sous l effet d une stimulation par des agents endogènes (cytokines) ou exogènes (PMA, LPS). L utilisation du DPI permet de relier cette production de RNOS à l activité d enzymes à flavine comme NOX ou NOS. Mais nous n avons pas pu montrer un effet de l A/R sur cette production globale de RNOS mesurée par la libération d éthylène à partir de l oxydation du KMB, ce que nous expliquons par les conditions expérimentales. L oxydation du KMB dépend essentiellement de l action des RNOS produites près de la surface cellulaire, de sorte que la production de RNOS dans la mitochondrie sous l effet de l A/R peut ne pas être suffisante pour atteindre le KMB, particulièrement si le temps d anoxie est de courte durée. D autre part, le temps nous a manqué pour explorer ce point particulier de manière approfondie en répétant les expériences. L oxymétrie a démontré que les synoviocytes consomment rapidement l O 2 dissous dans le milieu et que cette consommation est ralentie par les cycles d A/R, avec apparition d altérations mitochondriales. Nous pouvions donc supposer que les synoviocytes étaient capables de produire des espèces radicalaires sous l effet des cycles d A/R, ce qui fut confirmé par les études en RPE couplée au spin trapping : elles ont montré la formation d adduits de spin que, par comparaison avec des études antérieures, nous avons identifiés comme caractéristiques d espèces radicalaires dérivées de l anion superoxyde et d une peroxydation lipidique. Comme le spin trap utilisé est capable de pénétrer dans la cellule (à la différence du KMB utilisé dans la méthode de quantification des RNOS par la mesure de l éthylène), cette production d espèces radicalaires sous l effet de l A/R est attribuée aux mitochondries en souffrance. Mais nous ne pouvons pas exclure la participation d espèces radicalaires produites par des enzymes oxydantes cytosoliques comme la xanthine oxydase et surtout la NOX puisque la stimulation par un agent pharmacologique (le PMA) augmente la consommation d O 2 et que la stimulation par le TNF-α induit la production d espèces radicalaires bien qu à un faible niveau. Ces deux agents agissent le premier au niveau de la PKC, le second au niveau des récepteurs membranaires pour atteindre la NOX. De plus, les résultats actuels ne permettent pas de préciser la cinétique de production de ces espèces radicalaires ni leur intensité en fonction du temps d anoxie et du temps de réoxygénation. 170

31 Mais quelles que soient l origine et l intensité des espèces radicalaires observées, leur formation indique que les synoviocytes équins, à la différence des chondrocytes, sont des cellules qui peuvent être stimulées par l A/R et jouer un rôle important dans le développement des pathologies de l articulation, peut-être celui de stimulateurs des chondrocytes. Il était donc intéressant de développer un modèle de culture permettant l étude des interactions synoviocytes/chondrocytes. Les études d interactions entre synoviocytes et chondrocytes ne sont pas nombreuses (Lin et al., 1988 ; Sung et al., 1988) et un modèle de coculture des chondrocytes et des synoviocytes équins en lignée primaire n avait jamais été tenté. Pour réaliser ce modèle, il fallait d abord déterminer les conditions de co-culture permettant la survie des deux types cellulaires (milieu de culture, condition d oxygénation, condition d adhérence pour les synoviocytes, culture en billes d alginate pour les chondrocytes) et les tester sur les deux lignées, séparément d abord, en co-culture ensuite. En fonction des résultats de ces essais, nous avons réalisé un modèle de co-culture où les synoviocytes et les chondrocytes sont cultivés pendant deux jours séparément puis mis en co-culture (rapport synoviocytes/chondrocytes : 1/3) à 10 % d O 2. La co-culture n est pas prévue au-delà de deux jours pour éviter la multiplication des synoviocytes. Curieusement, nous avons observé que la coculture de deux jours provoquait une chute du nombre des chondrocytes (40 % de perte) et des synoviocytes. Pour les synoviocytes, la perte cellulaire devenait catastrophique lorsque les cellules avaient été précultivées à 10 % d O 2. Nous avons donc limité les études sur modèle de co-culture en n utilisant que des synoviocytes précultivés à 21 % d O 2. Il reste bien sûr à comprendre le phénomène de la perte cellulaire, aussi bien des chondrocytes que des synoviocytes pré-cultivés à 10 % d O 2. S agit-il d une toxicité cellulaire réciproque? Si oui, pourquoi est-elle amplifiée lorsque les synoviocytes ont été précultivés à 10 % d O 2? Nous avons aussi observé que lorsque les synoviocytes sont soumis à une période d anoxie avant la co-culture, ils paraissent subir un effet de «priming» et des variations importantes apparaissent dans la production de certains médiateurs inflammatoires comme la PGE 2. Ces curieuses observations restent inexpliquées et demandent des recherches supplémentaires, et surtout la répétition du nombre des essais. 171

32 En conditions normales, les synoviocytes produisent des facteurs qui activent la synthèse des collagénase, gélatinase et caséinase par les chondrocytes. Ils produisent aussi des médiateurs comme la PGE 2 et l IL-1 qui ont des effets importants sur le cartilage. Ils libèrent des facteurs induisant des mécanismes protecteurs des chondrocytes vis-à-vis des ROS (Kurz et al., 1999). Mais, lorsque les synoviocytes sont «perturbés» par l A/R, la stimulation de leur métabolisme oxydant et leur capacité à produire des radicaux libres pourraient annuler leurs effets protecteurs. Les résultats (tout à fait préliminaires) obtenus en co-culture sont stimulants, mais il ne faut pas perdre de vue que le modèle de co-culture créé pour étudier des interactions cellulaires réciproques ne reflète pas la réalité in vivo où les chondrocytes sont séparés des synoviocytes par le liquide synovial. L absence de synovie pourrait expliquer la perte cellulaire. Il faudra sans doute améliorer le modèle de co-culture en mettant au point un milieu de co-culture qui «imite» au mieux le liquide synovial. Une grande partie des résultats présentés dans l ensemble de ce travail ne peut pas être comparée aux données de la littérature scientifique internationale parce que les études sur cellules articulaires équines sont rares et menées sur des modèles différents des nôtres. Certains de nos résultats devront donc être validés par la répétition des expériences et amplement développés, particulièrement pour le modèle de co-culture que, pour des raisons de temps, nous n avons fait qu aborder. Il reste aussi beaucoup à faire pour localiser la production d espèces radicalaires dans les synoviocytes et déterminer la part due aux altérations mitochondriales de celle due à l activation d enzymes oxydantes comme la NOX et la xanthine oxydase. Il faudra notamment utiliser des inhibiteurs enzymatiques spécifiques ou travailler sur mitochondries isolées. Des études complémentaires seront nécessaires pour déterminer les effets de l A/R au niveau moléculaire et sur l expression et l activité des enzymes oxydantes (expression des NOX et NOS) et des facteurs inflammatoires (expression des cytokines, expression des COX). Ce type d étude reste encore difficile faute d accès aisé aux réactifs spécifiques à l espèce équine. Quoi qu il en soit, il ressort de ce travail que les synoviocytes en répondant à l A/R par une production de RNOS et en libérant des médiateurs inflammatoires pourraient jouer un rôle majeur dans l OAD. 172

33 7. Bibliographie Ahlqvist J. A hypothesis on the pathogenesis of rheumatoid and other non-specific synovitides. IV A. The possible intermediate role of local hypoxia and metabolic alterations. Med. Hypotheses, 1984, 13, Allen R.E., Blake D.R., Nazhat N.B., Jones P. Superoxide radical generation by inflamed human synovium after hypoxia. Lancet 1989, 29, Alwan W.H., Carter S.D., Dixon J.B., Bennett D., May S.A., Edwards G.B. Interleukin-1-like activity in synovial fluids and sera of horses with arthritis. Res. Vet. Sci., 1991, 51, Andreyev A.Y., Kushnareva Y.E., Starkov A.A. Mitochondrial metabolism of reactive oxygen species. Biochemistry (Moscow), 2005, 70, Ar Rajab A., Dawidson I., Fabia R. Reperfusion injury. New Horiz., 1996, 4, Armstrong S., Lees P. Effects of carprofen (R and S enantiomers and racemate) on the production of IL-1, IL-6 and TNF-alpha by equine chondrocytes and synoviocytes. J. Vet. Pharmacol. Ther., 2002, 25, Asik M., Eralp L., Cetik Ö., Altinel L. Case report: Rice bodies of synovial origin in the knee joint. Arthroscopy, 2001, 17, E:19. Auer D.E. An hypothesis on the etio-pathogenesis of equine inflammatory joint disease. Vet. Clin. Pathol., 1989, 18, Auer D.E., Ng J.C., Seawright A.A. Effect of palosein (superoxide dismutase) and catalase upon oxygen derived free radical induced degradation of equine synovial fluid. Equine Vet. J., 1990, 22, Auer D.E., Ng J.C., Reilly J.S., Seawright A.A. Anti-inflammatory drugs inhibit degradation of equine synovial fluid induced by free radicals. Aust. Vet. J., 1991, 68, Auer D.E., Ng J.C., Seawright A.A. Free radical oxidation products in plasma and synovial fluid of horses with synovial inflammation. Aust. Vet. J., 1993, 70, Ayache N., Boumediene K., Mathy-Hartert M., Reginster J.Y., Henrotin Y., Pujol J.P. Expression of TGF-betas and their receptors is differentially modulated by reactive oxygen species and nitric oxide in human articular chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage, 2002, 10, Babior M.B. NADPH Oxidase: an update. Blood, 1999, 93, Babior M.B. Phagocytes and oxidative stress. Am. J. Med., 2000, 109,

34 Baker M.S., Feigan J., Lowther D.A. Chondrocytes Antioxidant Defences: The roles of catalase and glutathione peroxidase in protection against H 2 O 2 dependent inhibition of proteoglycan biosynthesis. J. Rheumatol., 1988, 15, Barratt M.E., Fell H.B., Coombs R.R., Glauert A.M. The pig synovium, II. Some properties of isolated intimal cells. J Anat. 1977, 123, Bashir A., Gray M.L., Boutin R.D., Burstein D. Glucosaminoglycan in articular cartilage: in vivo assessment with delayed Gd(DPTA)(2-)-enhanced MR imaging. Radiology, 1997, 205, Bassleer A., Lhoest-Gauthier M.P., Renard A.M.., Heinen E., Goessens G. Histological structure and function of synovium. Department of histology, University of Liège, 1981, Beguin J., Locker B. Chondrocyte rotulienne. In: 2ème Journée d Arthroscopie du Genou, Lyon, France, n 1, 1983, Benton H.P., Cheng T.C., MacDonald M.H. Use of adverse conditions to stimulate a cellular stress response by equine articular chondrocytes. Am. J. Vet. Res., 1996, 57, Bernardi P., Petronelli V., Di Lisa F., Forte M. Mitochondrial perspective on cell death. Trends Biochem. Sci., 2001, 26, Bertone A.L., Palmer J.L., Jones J. Synovial fluid cytokines and eicosanoids as markers of joint disease in horses. Vet. Surg., 2001, 30, Blanco F.J., Ochs R.L., Schwarz H., Lotz M. Chondrocyte apoptosis induced by nitric oxide. Am. J. Pathol., 1995, 146, Bonnet C., Bertin P., Cook-Moreau J., Chable-Rabinovitch H., Treves R., Rigaud M. Lipoxygenase products and expression of 5-lipoxygenase and 5-lipoxygenase-activating protein in human cultured synovial cells. Prostaglandins. 1995, 50, Bonnet C.S., Walsh D.A. Osteoarthritis, angiogenesis and inflammation. Rheumatology (Oxford). 2005, 44, Borderie D., Hilliquin P., Hernvann A., Lemarechal H., Menkes C.J., Ekindjian O.G. Apoptosis induced by nitric oxide is associated with nuclear p53 protein expression in cultured osteoarthritic synoviocytes. Osteoarthritis Cartilage, 1999, 7, Borderie D., Le Marechal H., Ekindjian O.G., Hernvann A. Nitric oxide modifies glycolytic pathways in cultured human synoviocytes. Cell Biol. Int., 2000, 24, Bowker R.M., Abhold H.A., Caron J.P., Sonea I.M., Vex B, Kotyk R. Neuropeptidergic innervation of equine synovial joints. Am. J. Vet. Res., 1993, 54, Breit S., König H.E. Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen zur Synovialmembran an Hufgelenk und Bursa podotrochlearis beim Pferde. Tierärztl. Prax., 1995, 23,

35 Britigan B.E., Goffman T.J., Buettner G.R. Spin trqpping evidence of the lack of significant hydroxyl radical production during the respiration burst of human phagocytes using a spin adduct resistant to superoxide-mediated destruction. J. Biol. Chem., 1990, 265, Brown M.P., West L.A., Merritt K.A., Plaas A.H.K. Changes in sulfation patterns of chondroitin sulfate in equine articular cartilage and synovial fluid in response to aging and osteoarthritis. Am. J. Vet. Res., 1998, 59, Buddecke E. Leukotriene. In: Grundriss der Biochemie. De Gruyter: Berlin, New York, 1985, 392. Butler J.A., Colles M.C., Dyson S.J., Kold S.E. Poulos P.W. Degenerative joint disease. In: Clinical Radiology of the Horse. Blackwell Wiss.-Verlag: Berlin, Oxford, 1995, Cadore J.L., Donabedian M. Implications des cytokines dans la pathogénie des phénomènes articulaires chez le cheval. Prat.Vet. Equine, 1997, 29, Caudron I. Approche orthopédique des affections osteoarticulaires dégénératives de l extremité digitale du cheval. Liège, University of Liège, Thèse de doctorat en Sciences Vétérinaires, Cernanec J., Guilak F., Weinberg J.B., Pisetsky D.S., Fermor B. Influence of hypoxia and reoxygenation on cytokine-induced production of proinflammatory mediators in articular cartilage. Arthitis Rheum., 2002, 46, Chance B., Oshino N., Sugano T., Mayevsky A. Basic principles of tissue oxygen determination from mitochondrial signals. Adv. Exp. Med. Biol., 1973, 37A, Chandra J., Samali A., Orrenius S. Triggering and modulation of apopotosis by oxidative stress. Free Radic. Biol. Med., 2000, 29, Chockalingam P.S., Zeng W., Morris E.A., Flannery C.R. Release of hyaluronan and hyaladherins (aggrecan G1 domain and link proteins) from articular cartilage exposed to ADAMTS-4 (aggrecanase 1) or ADAMTS-5 (aggrecanase 2). Arthritis Rheum., 2004, 50, Chu S.C., Yang S.F., Lue K.H., Hsieh Y.S., Wu C.L., Lu K.H. Regulation of gelatinases expression by cytokines, endotoxin, and pharmacological agents in the human osteoarthritic knee. Connect. Tissue Res., 2004, 45, Clark C.C., Tolin B.S., Brighton C.T. The effect of oxygen tension on Proteoglycan Synthesis and Aggregation in Mammalian Growth Plate Chondrocytes. J. Orthop Res., 1991, 9, Clegg P.D., Carter S.D. Matrix metalloproteinase-2 and-9 are activated in joint diseases. Equine Vet. J., 1999, 31,

36 Cross P.C., Mercer K.L. Ultrastructure cellulaire et tissulaire : approche fonctionnelle. De Boeck University Bruxelles, 1995, p Dämmrich K., Loppnow H. Stoffwechselstörungen mit überwiegend extrazellulären Veränderungen. In: Stünzi H., Weiss E. (Eds): Allgemeine Pathologie für Tierärzte und Studierende der Tiermedizin. Verlag Paul Parey: Berlin et Hamburg, 1990, De Bari C., Dell'Accio F., Tylzanowski P., Luyten F.P. Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane. Arthritis Rheum., 2001, 44, Deberg M., Labasse A., Christgau S., Cloos P., Bang Henriksen D., Chapelle J.P., Zegels B., Reginster J.Y., Henrotin Y. New serum biochemical markers (Coll 2-1 and Coll 2-1 NO2) for studying oxidative-related type II collagen network degradation in patients with osteoarthritis and rheumatoid arthritis. Osteoarthritis Cartilage, 2005, 13, Deby C., Goutier R. New perspectives on the biochemistry of superoxide anion and the efficiency of superoxide dismutase. Biochem. Pharmacol., 1990, 39, Deby C., Hartstein G., Deby-Dupont G., Lamy M. Antioxidant therapy. In: JF Bion, H. Burchardi, RP Dellinger, GJ Dobb (Eds): Current topics in intensive care Number 2, W.B. Saunders: London, 1995, Deby-Dupont G.,Deby C., Lamy M. Neutrophil myeloperoxidase revisited: its role in health and disease. Intensiv med., 1999, 36, Deby C., Deby-Dupont G. Mechanisms of PGH Synthase-1 (COX-1) Activity and Role of Radical States. Chapter 3 in: Peter Curtis-Prior (Ed.): The Eicasonoids, John Wiley & Sons Ltd: Chichester West Sussex, 2004, Del Castillo P., Llorente A.R., Stockert J.C. Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis. Basic Appl. Histochem., 1989; 33, Demasi M., Cleland L.G., Cook-Johnson R.J., James M.J. Effects of hypoxia on the expression and activity of cyclooxygenase 2 in fibroblast-like synoviocytes: interactions with monocytederived soluble mediators. Arthritis Rheum., 2004, 50, Denoix J.M. Functional anatomy of tendons and ligaments in the distal limbs (manus and pes) In: The equine athlete: Tendon, ligament and soft tissue injuries. Dubai International Equine Symposium, 1996, Desgeorges A., Gabay C., Silacci P., Novick D., Roux-Lombard P., Grau G., Dayer J.M., Vischer T., Guerne P.A. Concentrations and origins of soluble interleukin-6 receptor-alpha in serum and synovial fluid. J. Reumatol.,1997, 24,

37 Dijkgraaf L.C., Liem R.S., de Bont L.G., Boering G. Calcium pyrophosphate dihydrate crysal deposition disease: a review of the literature and a light and electron microscopy study of a case of the temporomandibular joint with numerous intracellular crystals in the chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage, , Di Lisa F., Bernardi P. Mitochondrial function as a determinant of recovery or death in cell response to injury. Mol. Cell Biochem., 1998, 184, Dimock A.N., Siciliano P.D., McIlwraith C.W. Evidence supporting an increased presence of reactive oxygen species in the diseased equine joint. Equine vet. J., 2000, 32, Dobbie J.W., Hind C., Meijers P., Bodart C., Tasiaux N., Perret J., Anderson J.D. Lamellar body secretion: ultrastructural analysis of an unexplored function of synoviocytes. Br. J. Rheumatol., 1995, 34, Doige C.E., Weisbrode S.E. Diseases of joints: Normal Structure and Function. In: Carlton W.W., McGavin, M.D. (Eds): Special veterinary pathology. 2nd ed., Mosby: St. Louis, 1995, Domm C., Schunke M,. Christesen K., Kurz B. Redifferentiation of dedifferentiated bovine articular chondrocytes in alginate culture under low oxygen tension. Osteoarthritis Cartilage, 2002, 10, Dröge W. Oxidative stress in aging. Adv. Exp. Med. Biol., 2003, 543, Review. Du G., Mouithys-Mickalad A., Sluse F. Generation of superoxide anion by mitochondria and impairment of their functions during anoxia and re-oxygenation in vitro. Free Radic. Biol. Med., 1998, 25, Du G., Willet K., Mouithys-Mickalad A., Sluse-Goffart C., Droy-Lefaix M.T., Sluse F. EGb 761 protects liver mitochondria against injury induced by in vitro anoxia/re-oxygenation. Free Radic. Biol. Med., 1999, 27, Dumond H., Presle N., Pottie P., Pacquelet S., Terlain B., Netter P., Gepstein A., Livne E., Jouzeau J.Y. Site specific changes in gene expression and cartilage metabolism during early experimental osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage, 2004, 12, Dyce K.M., Sack W.O., Wensing C.J.G. Einige Grundfakten und Begriffe. In: Anatomie der Haustiere. Ferdinand Enke Verlag: Stuttgart, 1991, 18. Dyson S. Clinical questions concerning degenerative joint disease. Equine Vet. J., 1987, 19, 6-7. Edwards J.C. The nature and origins of synovium: experimental approaches to the study of synoviocyte differentiation. J Anat. 1994, 184(Pt 3),

38 Edwards J.C.W. Fibroblast biology. Development and differentiation of synovial fibroblasts in arthritis. Arthritis Res., 2000, 2, Fabry G. Ultrastructural changes in synovium and cartilage in experimental hemarthrosis in dogs. Arch. Orthop. Trauma Surg., 1990, 109, Fell H.B., Glauert A.M., Barratt M.E., Green R. The pig synovium. I. The intact synovium in vivo and in organ culture. J. Anat., 1976, 122, Fehr J.E., Trotter G.W., Oxford J.T., Hart D.A. Comparison of Northern blot hybridization and a reverse transcriptase-polymerase chain reaction technique for measurement of mrna expression of metalloproteinases and matrix components in articular cartilage and synovial membrane from horses with osteoarthritis. Am. J. Vet. Res., 2000, 61, Ferell W.R., Najafipour H. Changes in synovial PO 2 and blood flow in the rabbit knee joint due to stimulation of the posterior articular nerve. J. Physiol., 1992, 449, Fernandes J.C.., Martel-Pelletier J., Pelletier J.P. The role of cytokines in osteoarthritis pathophysiology. Biorheology 2002, 39, Fialkow L., Downey G.P. Reactive oxygen intermediates as signaling molecules regulating leukocyte activation. In: H.J. Forman and E. Cadenas (Eds): Oxidative stress and signal transduction. Chapman & Hall: New York, 1997, Fortier L.A., Kornatowski M.A., Mohammed H.O., Jordan M.T., O'Cain L.C., Stevens W.B. Age-related changes in serum insulin-like growth factor-i, insulin-like growth factor-i binding protein-3 and articular cartilage structure in Thoroughbred horses. Equine Vet J., 2005, 37, Franck T., Grulke S., Deby-Dupont G., Deby C., Duvivier H., Peters F., Serteyn D. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for specific equine neutrophil myeloperoxidase measurement in blood. J. Vet. Diagn. Invest., 2005, 17, Fraser A., Fearon U., Billinghurst R.C., Ionescu M., Reece R., Barwick T., Emery P., Poole A.R., Veale D.J. Turnover of type II collagen and aggrecan in cartilage matrix at the onset of inflammatory arthritis in humans: relationship to mediators of systemic and local inflammation. Arthritis Rheum. 2003, 48, Frean S.P., Bryant C.E., Fröling I.L., Elliott J., Lees P. Nitric oxide production by equine articular cells in vitro. Equine vet. J., , Frean S.P., Lees P. Effects of polysulfated glycosaminoglycan and hyaluronan on prostaglandin E2 production by cultured equine synoviocytes. Am. J. Vet. Res., 2000, 61, Fuller C.J., Barr A.R., Dieppe P.A. Variations in cartilage catabolism in different equine joints in response to interleukin-1 in vitro. Vet. Rec., 2001, 148,

39 Galleron S., Borderie D., Ponteziere C., Lemarechal H., Jambou M., Roch-Arveiller M., Ekindjian O.G., Cals M.J. Reactive oxygen species induce apoptosis of synoviocytes in vitro. Alpha-tocopherol provides no protection. Cell Biol. Int., 1999, 23, Gálvez J., Sola J., Ortuño G., Vicente J., Mesa-del Castillo J., Vicente V., Castellon P. Microscopic Rice Bodies in Rheumatoid Synovial Fluid Sediments. J. Rheumatol., 1992, 19, Gängel H., Rahn A. Zur Frage der diagnostischen Verwertbarkeit der Enzymaktivitäten in der Synovia bei Gelenkerkrankungen des Pferdes. Mh. Vet.-Med., 1992, 47, Gangl M., Deberg M., Lejeune J.P., Schneider N., Grulke S., Peters F., Vila T., Deby-Dupont G., Serteyn D., Henrotin Y. A type-ii collagen derived peptide and its nitrated form as new markers of inflammation and cartilage degradation in equine osteochondral lesions. Res. Vet. Sci., 2007, 82, Geiler G., Mehlhorn U. Vasculitis with anemia infarcts of the villi of the synovial membrane in rheumatoid arthrits. Z. Rheumatol., 1989, 48, Genova M.L., Ventura B., Giuliano G., Bovina C., Formiggini G., Parenti Castelli G., Lenaz G. The site of production of superoxide radical in mitochondrial Complex I is not a bound ubisemiquinone but presumably iron-sulfur cluster N2. FEBS Lett., 2001, 505, Georgescu H.I., Mendelow D., Evans C.H. HIG-82: an established cell line from rabbit periarticular soft tissue, which retains the "activatable" phenotype. In Vitro Cell Dev. Biol., 1988, 24, Ghafourifar P., Cadenas E. Mitochondrial nitric oxide synthase. Trends Pharmacol. Sci., , Review. Giatromanolaki A., Sivridis E., Athanassou N., Zois E., Thorpe P.E., Brekken R.A., Gatter K.C., Harris A.L., Koukourakis I.M., Koukourakis M.I. The angiogenic pathway "vascular endothelial growth factor/flk-1(kdr)-receptor" in rheumatoid arthritis and osteoarthritis. J. Pathol., 2001, 194, Gibson KT, Hodge H, Whittem T. Inflammatory mediators in equine synovial fluid. Aust. Vet. J., 1996, 73, Gonsalves M., Barker A.L., MacPherson J.V., Unwin P.R., O'Hare D., Winlove C.P. Scanning electrochemical microscopy as a local probe of oxygen permeability in cartilage. Biophys. J., 2000, 78, Gow A.J., Chen Q., Gole M., Themistocleous M., Lee V.M.Y., Ischiropoulos H. Two distinct mechanisms of nitric oxide-mediated neuronal cell death show thiol dependency. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 2000, 278, C1099 C

40 Gregory K.E., Marsden M.E., Anderson-MacKenzie J., Bard J.B., Bruckner P., Farjanel J., Robins S.P., Hulmes D.J. Abnormal collagen assembly, though normal phenotype, in alginate bead cultures of chick embryo chondrocytes. Exp. Cell Res., 1999, 246, Grigolo B., Roseti L., Fiorini M., Facchini A. Enhanced lipid peroxidation in synoviocytes from patients with osteoarthritis. J. Rheumatol., 2003, 30, Grimshaw M.J., Mason R.M. Bovine articular chondrocyte function in vitro depends upon oxygen tension. Osteoarthritis Cartilage, 2000, 8, Grootveld M, Henderson EB, Farrell A, Blake DR, Parkes HG, Haycock P. Oxidative damage to hyaluronate and glucose in synovial fluid during exercise of the inflamed rheumatoid joint. Detection of abnormal low-molecular-mass metabolites by proton-n.m.r. spectroscopy. Biochem. J., 1991, 273(Pt 2), Grulke S., Benbarek H., Caudron I., Deby-Dupont G., Mathy-Hartert M., Farnir F., Deby C., Lamy M., Serteyn D. Plasma myeloperoxidase level and polymorphonuclear leukocyte activation in horses suffering from large intestinal obstruction requiring surgery: preliminary results. Can. J.Vet. Res., 1999, 63, Gugala Z., Gogolewski S. In vitro growth and activity of primary chondrocytes on a resorbable polyactide three-dimensional scaffold, growth period of 3, 6 and 9 weeks. J. Biomed. Mater. Res., 2000, 49, Guicheux J., Palmer G., Relic B., Mezin F., Caverzasio J., Apostolides P., Gauchat J.F., Gabay C., Guerne P.A. Primary human articular chondrocytes, dedifferentiated chondrocytes, and synoviocytes exhibit differential responsiveness to interleukin-4: correlation with the expression pattern of the common receptor gamma chain. J. Cell Physiol., 2002, 192, Guo J.F., Jourdian G.W., MacCallum D.K. Culture and growth characteristics of chondrocytes encapsulated in alginate beads. Conn. Tiss. Res., 1989, 19, Hancock J.T., Jones O.T. The inhibition by diphenyleneiodonium and its analogues of superoxide generation by macrophages. Biochem. J., 1987, 242, Haselgrove J.C., Shapiro I.M., Silverton S.F. Computer modeling of the oxygen supply and demand of cells of the avian growth cartilage. Am. J. Physiol., 1993, 265, C Hauselmann H.J., Fernandes R.J., Mok S.S., Schmid T.M., Block J.A., Aydelotte M.B., Kuettner K.E., Thonar E.J. Phenotypic stability of bovine articular chondrocytes after long-term culture in alginate beads. J. Cell Sci., 1994, 107(PT 1), Henrotin Y.E., Deby-Dupont G., Deby C., De Bruyn M., Lamy M., Franchimont P. Production of active oxygen species by isolated human chondrocytes. Br. J. Rheumatol., 1993, 32,

41 Henrotin Y., Zheng S., Deby G., Labasse A., Crielaard J.M., Reginster J.Y. Nitric Oxide down regulates IL-1ß stimulated IL-6, IL-8 and PGE2 productions by human chondrocytes. J. Rheumatol., 1998, 25, Henrotin Y.E. Les enzymes et leur inhibiteurs. Pathogénie de l arthrose. Chapter I in: Approche expérimentale de la pathogénie et du traitement de l arthrose. Mémoire présenté en vue de l obtention du grade d Agrégé de l Enseignement Supérieur. Faculté de Médecine, University of Liège, 2003, Henrotin Y., Deberg M., Dubuc J.E., Quettier E., Christgau S., Reginster J.Y. Type II collagen peptides for measuring cartilage degradation. Biorheology, 2004, 41, Hering T.M. Regulation of chondrocyte gene expression. Front. Biosci., 1999, 15, D Hernvann A., Cynober L., Aussel C., Ekindjian O.G. Rheumatoid arthritis modifies basal and insulin-mediated glucose uptake by human synoviocytes. Cell Mol. Biol., 1991, 37, Heywood H.K., Bader D.L., Lee D.A. Rate of oxygen consumption by isolated articular chondrocytes is sensitive to medium glucose concentration. J. Cell Physiol., 2006, 206, Hills B.A., Crawford R.W. Normal and prosthetic synovial joints are lubricated by surface-active phospholipid: a hypothesis. J. Arthroplasty, 2003, 18, Hiran T.S., Moulton P.J., Hancock J.T. Detection of superoxide qnd NADPH oxidase in porcine articular chondrocytes. Free Radic. Biol. Med., 1997, 23, Howard R.D., McIlwraith C.W. Hyaluronan and its use in the treatment of equine joint disease. Chapter 15 in: McIlwraith C.W. and Wayne, G.W. (Eds): Joint disease of the horse. W.B. Saunders Company: Philadelphia, 1996, Imhof H., Sulzbacher I., Grampp S., Czerny C., Youssefzadeh S., Kainberger F. Subchondral bone and cartilage disease: a rediscovered functional unit. Invest. Radiol., 2000, 35, Inoue K., Masuko-Hongo K., Okamoto M., Nishioka K. Induction of vascular endothelial growth factor and matrix metalloproteinase-3 (stromelysin) by interleukin-1 in human articular chondrocytes and synoviocytes. Rheumatol. Int., 2004, 26, Ishiguro N., Ito T., Ito H., Iwata H., Jugessur H., Ionescu M., Poole A.R. Relationship of matrix metalloproteinases and their inhibitors to cartilage proteoglycan and collagen turnover: analyses of synovial fluid from patients with osteoarthritis. Arthritis Rheum., 1999, 42, Iwanaga T., Shikichi M., Kitamura H., Yanase H., Nozawa-Inoue K. Morphology and functional roles of synoviocytes in the joint. Arch. Histol. Cytol., 2000, 63,

42 Jackson J.R., Minton J.A., Ho M.L., Wei N., Winkler J.D. Expression of vascular endothelial growth factor in synovial fibroblasts is induced by hypoxia and interleukin 1beta. J. Rheumatol., 1997, 24, Jaffe E.A. Culture and identification of large vessel endothelial cells. In: E.A. Jaffé (Ed.): Biology of endothelial cells: Martinus Nijhoff Publishers: Boston, 1984, James M.J., Cleland L.G., Rofe A.M., Leslie A.L. Intraarticular pressure and the relationship between synovial perfusion and metabolic demand. J. Rheumatol., 1990, 17, Jouglin M., Robert C., Valette J.P., Gavard F., Quintin-Colonna F., Denoix J.M. Metalloproteinases and tumor necrosis factor-alpha activities in synovial fluids of horses: correlation with articular cartilage alterations. Vet. Res., 2000, 31, Jovanovic D., Pelletier J.P., Alaaeddine N., Mineau F., Geng C., Ranger P., Martel-Pelletier J. Effect of IL-13 on cytokines, cytokine receptors and inhibitors on human osteoarthritis synovium and synovial fibroblasts. Osteoarthritis Cartilage, 1998, 6, Jovanovic D.V., Mineau F., Notoya K., Reboul P., Martel-Pelletier J., Pelletier J.P. Nitric oxide induced cell death in human osteoarthritic synoviocytes is mediated by tyrosine kinase activation and hydrogen peroxide and/or superoxide formation. J. Rheumatol., 2002, 29, Kainer R.A. Clinical anatomy of the equine foot. Vet. Clin. North Am-Equine Pract., 1989, 5, Karatay S., Kiziltunc A., Yildirim K., Karanfil R.C., Senel K. Effects of different hyaluronic acid products on synovial fluid levels of intercellular adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule-1 in knee osteoarthritis. Ann. Clin. Lab. Sci., 2004, 34, Kawai Y., Kubota E., Okabe E. Reactive oxygen species participation in experimentally induced arthritis of the temporomandibular joint in rats. J. Dent. Res., 2000, 79, Khan J., Brennan D.M., Bradley N., Gao B., Bruckdorfer R., Jacobs M. 3-Nitrotyrosine in the proteins of human plasma determined by an ELISA method. Biochem. J.,1998, 330, Kidd V.J. Proteolytic activities that mediate apoptosis. Annu. Rev. Physiol., 1998, 60, Kitamura H.P., Yanase H., Kitamura H., Iwanaga T. Unique localization of protein gene product 9.5 in type B synoviocytes in the joints of horses. J. Histochem. Cytochem., 1999, 47, Kitamura H., Okumura M., Sato F., Kimoto K., Kohama M., Hashimoto Y., Tagami M., Iwanaga T. Increased concentrations of protein gene product 9.5 in the synovial fluid from horses with osteoarthritis. Jpn. J. Vet. Res., 2001, 49, Klebanoff S.J. Myeloperoxidase: friend and foe. J. Leukocyte Biol., 2005, 77, Review 182

43 Knorth H., Dorfmuller P., Lebert R., Schmidt W.E., Wittenberg R.H., Heukamp M., Wiese M., Willburger R.E. Participation of cyclooxygenase-1 in prostaglandin E2 release from synovitis tissue in primary osteoarthritis in vitro. Osteoarthritis Cartilage, , Kobayashi K., Matsuzaka S., Yoshida Y., Miyauchi S., Wada Y., Moriya H. The effects of intraarticularly injected sodium hyaluronate on levels of intact aggrecan and nitric oxide in the joint fluid of patients with knee osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage, 2004, 12, Kolomytkin O.V., Marino A.A., Waddell D.D., Mathis J.M., Wolf R.E., Sadasivan K.K., Albright J.A. IL- 1beta-induced production of metalloproteinases by synovial cells depends on gap junction conductance. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 2002, 282, C Koppenol W.H. The Haber-Weiss cycle 70 years later. Redox Rep., 2001, 6, Kraus V.B., Huebner J.L., Fink C., King J.B., Brown S., Vail T.P., Guilak F. Urea as a passive transport marker for arthritis biomarker studies. Arthritis Rheum., 2002, 46, Kuettner K.E., Pauli B.U., Gall G. Memoli V.A., Schenk R.K. Synthesis of cartilage matrix by mammalian chondrocytes in vitro. I. Isolation, culture characteristics and morphology. J. Cell Biol., 1982, 23, Kurz B., Schunke M. Articular chondrocytes and synoviocytes in culture: influence of antioxidants on lipid peroxidation and proliferation. Anat. Anz., 1997, 179, Kurz B., Steinhagen J., Schünke M. Articular chondrocytes and synoviocytes in a co-culture system: influence on reactive oxygen species-induced cytotoxicity and lipid peroxidation. Cell Tissue Res., 1999, 296, Lane J.M., Brighton C.T., Menkowitz B.J. Anaerobic and aerobic metabolism in articular cartilage. J. Rheumatol., 1977, 4, Landoni M.F., Foot R., Frean S., Lees P. Effects of flunixin, tolfenamic acid, R(-) and S(+) ketoprofen on the response of equine synoviocytes to lipopolysaccharide stimulation. Equine Vet. J., 1996, 28, Lapadula G., Nico B., Cantatore F.P., La Canna R., Roncali L., Pipitone V. Early ultrastructural changes of articular cartilage and synovial membrane in experimental vitamin A-induced osteoarthritis.j. Rheumatol., 1995, 22, Laufer S. Role of eicosanoids in structural degradation in osteoarthritis. Curr. Opin. Rheumatol., 2003, 15, Review. Lee M.C., Kawai Y., Shoji H., Yoshino F., Miyazaki H., Kato H., Suga M., Kubota E. Evidence of reactive oxygen species generation in synovial fluid from patients with temporomandibular disease by electron spin resonance spectroscopy. Redox Rep., 2004, 9,

44 Lee R.B., Urban J.P. Functional replacement of oxygen by other oxidants in articular cartilage. Arthritis Rheum., 2002, 46, Lehninger A.L., Nelson D.L., Cox M.M. Biosynthesis of Amino Acids, Nucleotides and Related molecules. Chapter 21 in Lehninger A.L., Nelson D.L., Cox M.M (Eds): Principles of Biochemistry. Worth Publishers, Inc. New York, 1993a, p Lehninger A.L., Nelson D.L., Cox M.M. ß Oxidation. Chapter 16 in Lehninger A.L., Nelson D.L., Cox M.M (Eds): Principles of Biochemistry. Worth Publishers, Inc. New York, 1993b, p Lejeune J.P., Schneider N., Duvivier D.H., Michaux C., Leroy P., Caudron I., Serteyn D. Arthropathie interphalangienne dégénérative juvénile chez le cheval ardennais : protocole d'évaluation morphométrique (Partie I), Ann. Med. Vet., 2002a, 146, Lejeune J.P., Schneider N., Duvivier D.H., Michaux C., Caudron I., Serteyn D. Arthropathie interphalangienne dégénérative juvénile chez le cheval ardennais: protocole d évaluation radiographique (Partie II). Ann. Méd. Vét., 2002b, 146, Lejeune J.P. Ostéo-arthropathie interphalangienne dégénérative juvenile chez le cheval ardennais. Liège, Université de Liège, Thèse de doctorat en Sciences Vétérinaires de Lejeune J.P., Schneider N., Henrotin Y., Serteyn D. L ostéo-arthropathie dégénérative du cheval : Pathogénie et moyens diagnostiques. Ann. Méd. Vét., 2006, 150, Lejeune J.P., Serteyn D., Gangl M., Schneider N., Deby-Dupont G., Deberg M., Henrotin Y. Plasma concentration of a type II-collagen derived peptide and its nitrated form in growing Ardenner sound horses and in horses suffering from juvenile digital degenerative osteoarthropathy. Vet. Res. Commun., 2007a, 31, Lejeune J.P., Franck T., Gangl M., Schneider N., Michaux C., Deby-Dupont G., Serteyn D. Plasma concentration of insulin-like growth factor I (IGF-I) in growing ardenner horses suffering from juvenile digital degenerative osteoarthropathy. Vet. Res. Commun., 2007b, 31, Le Lous M., Corvol. M.T., Maroteaux P. Lipid composition of two types of chondrocytes in primary culture. Calcif. Tissue. Int., 1981, 33, Lemburg A.K. Histologische und immunohistologische Untersuchungen an der Synovialmembran von Hunden mit spontanem vorderen Kreuzbandabriss oder Polyarthritis. Dissertation, TiHo, Hannover Mardi 24/08/04. Liang B., Petty H.R. Imaging neutrophil activation: analysis of the translocation and utilization of NAD(P)H associated autofluorescence during antibody-dependent target oxidation. J. Cell Physiol., 1992, 152,

45 Liberg P., Magnusson L.E., Schougaard H.. Studies on the Synovia in Healthy Horse with Particular Reference to the Protein Composition. Equine Vet. J., 1977, 9, Lin C.W., Phillips S.L., Brinckerhoff C.E., Georgescu H.I., Bandara G., Evans C.H. Induction of collagenase mrna in lapine articular chondrocytes by synovial factors and interleukin-1. Arch Biochem. Biophys., 1988, 264, Lipiello L., Walsh T., Fienhold M. The association of lipid abnormalities with tissue pathology in human osteoarthritic articular cartilage. Metabolism, 1991, 40, Lisignoli G., Grassi F., Piacentini A., Cocchini B., Remiddi G., Bevilacqua C., Facchini A. Hyaluronan does not affect cytokine and chemokine expression in osteoarthritic chondrocytes and synoviocytes. Osteoarthritis Cartilage, 2001, 9, Loschen G., Flohe L., Chance B. Respiratory chain linked H2O2 production in pigeon heart mitochondria. FEBS Lett., 1971,18, Lotz M., Hashimoto S., Kühn K. Mechanisms of chondrocyte apoptosis. Osteoarthitis Cartilage, 1999, 7, Lund-Olesen K. Oxygen tension in synovial fluids. Arthritis Rheum., 1970, 13, Lynch T.M., Caron J.P., Arnoczky S.P., Lloyd J.W., Stick J.A., Render J.A. Influence of exogenous hyaluronan on synthesis of hyaluronan and collagenase by equine synoviocytes. Am. J. Vet. Res., 1998, 59, Maier R., Ganu V., Lotz M. Interleukin-11, an Inductible Cytokine in Human Articular Chondrocytes and Synoviocytes, stimulates the Production of the Tissue inhibitor of Metalloproteinases. J. Biol. Chem., 1993, 268, Malda J., van den Brink P., Meeuwse P., Grojec M., Martens D.E., Tramper J., Riesle J., van Blitterswijk C.A. Effect of oxygen tension on adult articular chondrocytes in microcarrier bioreactor culture. Tissue Eng., 2004, 10, Maneiro E., Martin M.A., de Andres M.C., Lopez-Armada M.J., Fernandez-Sueiro J.L., del Hoyo P., Galdo F., Arenas J., Blanco F.J. Mitochondrial respiratory activity is altered in osteoarthritic human articular chondrocytes. Arthritis Rheum. 2003, 48, Maneiro E., Lopez-Armada M.J., de Andres M.C., Carames B., Martin M.A., Bonilla A., Del Hoyo P., Galdo F., Arenas J., Blanco F.J. Effect of nitric oxide on mitochondrial respiratory activity of human articular chondrocytes. Ann. Rheum. Dis., 2005, 64, Marcouiller P., Pelletier J.P., Guevremont M., Martel-Pelletier J., Ranger P., Laufer S., Reboul P. Leukotriene and prostaglandin synthesis pathways in osteoarthritic synovial membranes: regulating factors for interleukin 1beta synthesis. J. Rheumatol., 2005, 32,

46 Marcus R.E. The effect of low oxygen concentration on growth glycolysis, and sulfate incorporation by articular chondrocytes inmonolayer culture. Arthitis Rheum.,1973, 16, Marino A.A., Waddell D.D., Kolomytkin O.V., Meek W.D., Wolf R., Sadasivan K.K., Albright J.A. Increased intercellular communication through gap junctions may contribute to progression of osteoarthritis. Clin. Orthop., 2004, 422, Martel-Pelletier J., Faure M.P., McCollum R., Mineau F., Cloutier J.M., Pelletier J.P. Plasmin, plasminogen activators and inhibitor in human osteoarthritic cartilage. J. Rheumatol., 1991, 18, Martel-Pelletier J., Mineau F., Fahmi H., Laufer S., Reboul P., Boileau C., Lavigne M., Pelletier J.P. Regulation of the expression of 5-lipoxygenase-activating protein/5-lipoxygenase and the synthesis of leukotriene B(4) in osteoarthritic chondrocytes: role of transforming growth factor beta and eicosanoids. Arthritis Rheum., 2004, 50, Martin J.A., Miller B.A., Scherb M.B., Lembke L.A., Buckwalter J.A. Co-localization of insulinlike growth factor binding protein 3 and fibronectin in human articular cartilage. Osteoarthritis Cartilage, 2002, 10, Martin J.A., Klingelhutz A.J., Moussavi-Harami F., Buckwalter J.A. Effects of oxidative damage and telomerase activity on human articular cartilage chondrocyte senescence. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci., 2004, 59, Mathy-Hartert M., Burton S., Deby-Dupont G., Devel P., Reginster J.Y., Henrotin Y. Influence of oxygen tension on nitric oxide and prostaglandin E2 synthesis by bovine chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage , Matsushita T., Fukuda K., Yamazaki K., Yamamoto N., Asada S., Yoshida K., Munakata H., Hamanishi C. Hypoxia-induced nitric oxide protects chondrocytes from damage by hydrogen peroxide. Inflamm. Res., 2004, 53, May S.A., Hooke R.E., Lees P. The characterisation of equine interleukin-1. Vet. Immunol. Immunopathol., 1990, 24, May S.A., Hooke R.E., Lees P. Adverse conditions in vitro stimulate chondrocytes to produce prostaglandin E2 and stromelysin. Equine Vet. J., 1991, 23, May S.A., Hooke R.E., Lees P. Species restrictions demonstrated by the stimulation of equine cells with recombinant human interleukin-1. Vet. Immunol. Immunopathol., 1992a, 30, May S.A., Hooke R.E., Lees P. Interleukin-1 stimulation of equine articular cells. Res. Vet. Sci. 1992b, 52, May S.A., Hooke R.E., Lees P. Inhibition of interleukin-1 activity by equine synovial fluid. Equine Vet. J., 1992c, 24,

47 May S.A., Hooke R.E., Lees P. Equine chondrocyte activation by a variety of stimuli. Br. Vet. J., 1992d, 148, McIlwraith C.W. Erkrankungen der Gelenke, Sehnen, Bänder sowie ihrer Hilfseinrichtungen. In: T.S. Stashak (Ed.): Adams Lahmheit bei Pferden. 4. Auflage, Verlag M.&H. Shaper: Alfeld, Hannover, 1989, McIlwraith C.W. General pathophysiology of the joint and response to injury. Chapter 3 in: McIlwraith C.W. and Wayne, G.W. (Eds): Joint disease in the horse. W.B. Saunders Company: Philadelphia, 1996, McIlwraith. W. Interphalangeal Arthroscopy. 6 th Geneva Congress of Equine Medicine and Surgery, 1999a, McIlwraith W. Intra articular and systemic medication used in the treatment of equine traumatic joint disease. 6 th Geneva Congress of Equine Medicine and Surgery, 1999b, McIlwraith C.W. Anatomy and Physiology of Equine Joints. [en ligne] (sans date). Consulté le 09/04/01.URL: Moe S.M., Bailey A.M. A coculture model of synoviocytes and bone for the evaluation of potential arthritis therapies. J. Pharmacol. Toxicol. Methods, 1999, 41, Mouithys-Mickalad A., Deby-Dupont G., Nys M., Lamy M., Deby C. Oxidative Processes in Human Promonocytic Cells (THP-1) after Differentiation into Macrophages by Incubation with Chlamydia pneumoniae Extracts. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2001, 287, Mouithys-Mickalad A., Mathy-Hartert M., Du G., Sluse F., Deby C., Lamy M, Deby-Dupont G. Oxygen consumption and electron spin resonance studies of free radical production by alveolar cells exposed to anoxia: inhibiting effects of the antibiotic ceftazidime. Redox Report, 2002, 7, Moulton P.J., Hiran T.S., Goldring M.B. Hancock J.T. Detection of protein and mrna of various components of the NADPH oxidase complex in an immortalized human chondrocyte line. Br. J. Rheumatol., 1997, 36, Murphy C.L., Sambanis A. Effect of oxygen tension and alginate encapsulation on restoration of the differentiated phenotype of passaged chondrocytes. Tissue Eng., 2001a, 7, Murphy C.L., Sambanis A. Effect of oxygen tension on chondrocyte extracellular matrix accumulation. Connect Tissue Res., 2001b, 42, Nagao M., Ishii S., Kitamura K., Akino T. Arachidonic acid metabolism in articular chondrocytes. Clin. Orthop., 1991a, 271,

48 Nagao M., Ishii S., Murata Y., Akino T. Effect of extracellular fatty acids on lipid metabolism in cultured rabbit articular chondrocytes. J. Orthop. Res., 1991b, 9, Nagase H., Kashiwagi M. Aggrecanases and cartilage matrix degradation. Arthritis Res. Ther., 2003, 5, Review. Nakamura K., Bossy-Wetzel E., Burns K., Fadel M.P., Lozyk M., Goping I.S., Opas M., Bleackley R.C., Green D.R., Michalak M. Changes in endoplasmic reticulum luminal environment affect cell sensitivity to apoptosis. J. Cell Biol., 2000, 150, Nehring D., Adamietz P., Meenen N.M., Pörtner R. Perfusion cultures and modelling of oxygen uptake with three-dimensional chondrocyte pellets. Biotechnology Techniques, 1999, 13: Nevo Z., Beit-Or A., Eilam Y. Slowing down aging of cultured embryonal chick chondrocytes by maintenance under lowered oxygen tension. Mech. Ageing Dev., 1988, 45, Nevo Z., Silver J., Chorev Y., Riklis I., Robinson D., Yosipovitch Z. Adhesion characteristics of chondrocytes cultured separately and in co-cultures with synovial fibroblasts. Cell Biol. Int., 1993, 17, Nio J., Yokoyama A., Okumura M., Iwanaga T. Three-dimensional ultrastructure of synoviocytes in the knee joint of rabbits and morphological changes in osteoarthritis model. Arch. Histol. Cytol., 2002, 65, Nishimura M., Segami N., Kaneyama K., Suzuki T., Miyamaru M. Relationships between painrelated mediators and both synovitis and joint pain in patients with internal derangements and osteoarthritis of the temporomandibular joint. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod., 2002, 94, Nixon A.J., Brower-Toland B.D., Bent S.J., Saxer R.A., Wilke M.J., Robbins P.D., Evans C.H. Insulinlike growth factor-i gene therapy applications for cartilage repair. Clin. Orthop., 2000, 379 Suppl, S Nixon A. Growth Factor Gene Therapy Approaches to Equine Cartilage Repair. [en ligne] (sans date) Consulté le 09/04/01. URL: Obradovic B., Melddon J. Glycosaminoglycan deposition in engineered cartilage: Experiments and mathematical model. AlChE J, 2000, 46, O Connor T.M., O Connell J., O Brien D.I., Goode T., Bredin C.P., Shanahan F.J. The role of substance P in inflammatory disease. Cell. Physiol., 2004, 201, Otte P. Basic cell metabolism of articular cartilage. Manometric studies. Z. Rheumatol., 1991, 50,

49 Panasyuk A., Colantuoni G., Khatib A.M., Lomri A., Mitrovic D.R. Human synovium produces substances that inhibit DNA and stimulate proteoglycan and collagen synthesis by cultured human articular chondrocytes and synovial fibroblasts. Scand. J. Rheumatol., 2003, 32, Peloschek P.L. Computergestützte radiologische Quantifizierung der rheumatoiden Arthritis. Vienne: University of Vienna, Dissertation, Platt D. Articular cartilage homeostasis and the role of growth factors and cytokines in regulating matrix composition. In: McIlwraith C.W. and Wayne, G.W. (Eds): Joint disease in the horse. W.B. Saunders Company: Philadelphia, 1996a, Platt D. Isolated chondrocyte and cartilage explant culture systems as techniques to investigate the pathogenesis of equine joint disease. In: McIlwraith C.W. and Wayne, G.W. (Eds): Joint disease in the horse. W.B. Saunders Company: Philadelphia, 1996b, Platt D., Wells T., Bayliss M.T. Proteoglycan metabolism of equine articular chondrocytes cultured in alginate beads. Res. Vet. Sci., 1997, 62, Poli A., Coleman P.J., Mason R.M., Levick J.R. Contribution of F-actin to barrier properties of the blood-joint pathway. Microcirculation, 2002, 9, Pryor W., Squadrito G. The chemistry of peroxynitrite: a product from the reaction of nitric oxide with superoxide. Am. J. Physiol., 1995, 268, L Punzi L., Todesco S., Toffano G., Catena R., Bigon E., Bruni A. Phospholipids in inflammatory synovial effusions. Rheumatol. Int., 1986, 6, Rajpurohit R.,Koch C.J.,Tao Z.,Teixeira C.M.,Shapiro I.M. Adaptation of Chondrocytes to Low Oxygen tension: relationship between hypoxia and cellular metabolism. J. Cell. Physiol., 1996, 118, Rathakrishnan C., Tiku M.L. Lucigenin-dependent chemiluminescence in articular chondrocytes. Free Radic. Biol. Med., 1993, 15, Reboul P., Pelletier J.P., Tardif G., Cloutier J.M., Martel-Pelletier J. The new collagenase, collagenase-3, is expressed and synthesized by human chondrocytes but not by synoviocytes. A role in osteoarthritis. J. Clin. Invest., 1996, 97, Reef V.B., Martin B.B., Elser A. Types of tendon and ligament injuries detected with diagnostic ultrasound description and follow-up. Proc. 34th Conv. Am. Ass.: Equine Pract., 1988, Remberger K. Gelenke, Bursen, Sehnenscheiden und Menisci. In: M. Eder, P. Gedegk (Eds.). Allgemeine Pathologie und Pathologische Anatomie. Springer Verlag: Berlin, 1990, Reynolds E.S. The use of lead citrate at high ph as an electron-opaque stain in electron microscopy. J. Cell Biol., 1963, 17,

50 Richman A.I., Su E.Y., Ho G.Jr. Reciprocal relationship of synovial fluid volume and oxygen tension. Arthritis Rheum., 1981, 24, Ritchlin C. Fibroblast biology. Effector signals released by the synovial fibroblast in arthritis. Arthritis Res., 2000, 2, Ronchetti P.I., Guerra D., Taparelli F., Boraldi F., Bergamini G., Mori G., Zizzi F., Frizziero L. Morphological analysis of knee synovial membrane biopsies from a randomized controlled clinical study comparing the effects of sodium hyaluronate (Hyalgan) and methylprednisolone acetate (Depomedrol) in osteoarthritis. Rheumatology (Oxford), 2001, 40, Roy R.S., McCord J.M. Ischemia-induced conversion of xanthine dehydrogenase to xanthine oxidase. Fed. Proceed., 1982, 41, Rubin E., Farber J.L. Cell injury. In: Rubin, E. (Ed.): Essential Pathology. 3rd ed, Lippinkott Williams & Wilkins: Philadelphia, 2001, Rush, J.D., Koppenol W.H. Oxidizing intermediates in the raction of ferrous EDTA with hydrogen peroxide. Reactions with organic molecules and ferrocytochrome c. J. Biol. Chem., 1986, 261, Sakurai H., Kohsaka H., Liu M.F., Higashiyama H., Hirata Y., Kanno K., Saito I., Miyasaka N. Nitric oxide production and inducible nitric oxide synthase expression in inflammatory arthritides. J. Clin. Invest., 1995, 96, Sampson J.B., Ye Y., Rosen H, Beckmann J.S. Myeloperoxidase and horseradish peroxidase catalyze tyrosin nitration in proteins from nitrite and hydrogen peroxide. Arch. Biochem. Biophys., 1998, 356, Sanchez C., Mateus M.M., Defresne M.P., Crielaard J.M., Reginster J.Y., Henrotin Y.E. Metabolism of human articular chondrocytes cultured in alginate beads. Longterm effects of interleukin 1beta and nonsteroidal antiinflammatory drugs. J. Rheumatol., 2002, 29, Sandhu J.K., Robertson S., Birnboim H.C., Goldstein R. Distribution of protein nitrotyrosine in synovial tissues of patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. J. Rheumatol., 2003, 30, Saris N.E.L., Eriksson K.O. Mitochondrial dysfunction in ischaemia-reperfusion. Acta Anaesthesiol. Scand., 1995, 39, Savill J. Recognition and phagocytosis of cells undergoing apoptosis. Br. Med. Bull., 1997, 53,

51 Saxne T., Palladino M.A. Jr, Heinegard D., Talal N., Wollheim F.A. Detection of tumor necrosis factor alpha but not tumor necrosis factor beta in rheumatoid arthritis synovial fluid and serum. Arthritis Rheum., 1988, 31, Schäfer D.B., Wendt D., Moretti M., Jakob M., Jay G.D., Heberer M., Martin I. Lubricin reduces cartilage-cartilage integration. Biorheology, 2004, 41, Schäffler A., Ehling A., Neumann E., Herfarth H., Tarner I., Scholmerich J., Gay S., Muller- Ladner U. Adipocytokines in synovial fluid. J.A.M.A., 2003, 290, Schmidt H.H. W. Determination of nitric oxide via measurement of nitrite and nitrate in culture media. Biochemica, 1995, 2, p.22. Schneider N., Lejeune J.P., Deby C., Deby-Dupont G.P., Serteyn D. Viability of equine articular chondrocytes in alginate beads exposed to different oxygen tensions. Vet. J., 2004, 168, Schneider N., Mouithys-Mickalad A.L., Lejeune J.P., Deby-Dupont G.P., Hoebeke M., Serteyn D.A. Synoviocytes, not chondrocytes, release free radicals after cycles of anoxia/re-oxygenation. Biochem Biophys Res Commun., 2005, 334, Schneider N., Heimann M., Lejeune J.P., Verwilghen D.R., Deby-Dupont G.P., Serteyn D.A. Histology of two rice bodies isolated from the stifle of an adult draught horse stallion. J. Vet. Sci., 2006, 7, Schneider N., Mouithys-Mickalad A., Lejeune J.P., Duyckaerts C., Sluse F., Deby-Dupont G., Serteyn D.Oxygen consumption of equine articular chondrocytes: influence of applied oxygen tension and glucose concentration during culture. Cell Biol. Int., 2007, in press. Schreck R., Rieber P., Baeuerle P.A. Reactive oxygen intermediates as apparently widely used messengers in the activiation of the NF-kappa B transcription factor and HIV-1. EMBO J., 1991, 10, Schulze M., Kuettner K.E., Cole A.A. Adult human chondrocytes in alginate culture. Preservation of the phenotype for further use in transplantation model. Orthopäde, 2000, 29, Schwarz I.M., Hills B.A. Synovial surfactant: lamellar bodies in type B synoviocytes and proteolipid in synovial fluid and the articular lining. Br. J. Rheumatol., 1996, 35, Schwarz I.M., Hills B.A. Surface-active phospholipid as the lubricating component of lubricin. Br. J. Rheumatol., 1998, 37, Serteyn D., Mottart E., Deby C., Deby-Dupont G., Pinc J., Philipart C., Lamy M. Equine postanaesthetic myositis : a possible role for free radical generation and membrane lipoperoxidation. Res. Vet. Sci, 1990, 48,

52 Serteyn D., Mouithys-Mickalad A., Franck T., Grulke S., Lamy M., Deby C., Deby-Dupont G. La nature chimique et la réactivité de l oxygène. Ann. Méd. Vét., 2002, 146, Serteyn D., Grulke S., Franck T., Mouithys-Mickalad A., Deby-Dupont G. La myéloperoxydase des neutrophiles, une enzyme de défense aux capacités oxydantes. Ann. Méd. Vét., 2003, 147, Shakibaei M., De Souza P., Merker H.J. Integrin expression and collagen type II implicated in maintenance of chondrocyte shape in monolayer culture: an immunomorphological study. Cell Biol. Int.,1997, 21, Shakibaei M, Schulze-Tanzil G, De Souza P, John T, Rhmanzadeh R, Merker HJ. Inhibition of Mitogen-activated Protein Kinase Kinase induces Apoptosis of Human Chondrocytes. J. Biol. Chem., 2001, 276, Shikichi M., Kitamura H.P., Yanase H., Konno A., Takahashi-Iwanaga H., Iwanaga T. Threedimensional Ultrastructure of Synoviocytes in the Horse Joint as Revealed by the Scanning Electron Microscope. Arch. Histol. Cytol., 1999, 62, Silacci P., Dayer J.M., Desgeorges A., Peter R., Manueddu C., Guerne P.A. Interleukin (IL)-6 and its soluble receptor induce TIMP-1 expression in synoviocytes and chondrocytes, and block IL-1-induced collagenolytic activity. J. Biol. Chem., 1998, 273, Skioldebrand E., Lorenzo P., Zunino L., Rucklidge G.J., Sandgren B., Carlsten J., Ekman S. Concentration of collagen, aggrecan and cartilage oligomeric matrix protein (COMP) in synovial fluid from equine middle carpal joints. Equine Vet. J., 2001, 33, Smith W.L., Marnett L.J. Prostaglandin endoperoxide synthase: structure and catalysis. Biochim. Biophys. Acta, 1991, 1083, Smith M.D., Barg E., Weedon H., Papengelis V., Smeets T., Tak P.P., Kraan M., Coleman M., Ahern M.J. Microarchitecture and protective mechanisms in synovial tissue from clinically and arthroscopically normal knee joints. Ann. Rheum. Dis., 2003, 62, Stark D.D., Bradley W.G. Knee Bony injuries. Chapter 38 in: Corra E. (Ed.): Magnetic Resonance Imaging. Mosby by Greenwood G.: St. Louis, Missouri, 1999, Stefanovic-Racic M., Stadler J., Georgescu H.I., Evans C.H. Nitric oxide synthesis and its regulation by rabbit synoviocytes. J. Rheumatol., 1994, 21, Stoya G., Klemm A., Baumann E, Vogelsang H., Ott U., Linss W., Stein G. Determination of autofluorescence of red blood cells (RbCs) in uremic patients as a marker of oxidative damage. Clin. Nephrol., 2002, 58, Sung K., Mendelow D., Georgescu H.I., Evans C.H. Characterisation of chondrocyte activation in response to cytokines synthesised by a synovial cell line. Biochim. Biophys. Acta, 1988, 971,

53 Suzuki K., Shimizu K., Hamamoto T., Nakagawa Y., Hamakubo T., Yamamuro T. Biochemical demonstration of calpains and calpastatin in osteoarthritic synovial fluid. Arthritis Rheum., 1990, 33, Taguchi K., Hirano T., Iwasaki K., Sugihara H. Reconstruction culture system simulating human synovium: a three-dimensional collagen gel culture of synoviocytes. Cell Struct. Funct., 1997, 22, Tanaka H., Matsumara M., Veliky A. Diffusion of peptides through polymerized alginate. Biotechnolog. Bioeng., 1984, 26, Tanimoto K., Ohno S., Fujimoto K., Honda K., Ijuin C., Tanaka N., Doi T., Nakahara M., Tanne K. Proinflammatory cytokines regulate the gene expression of hyaluronic acid synthetase in cultured rabbit synovial membrane cells. Connect. Tissue Res., 2001, 42, Teppermann B.L., Chang Q., Soper B.D. Proteinkinase C mediates lipopolysaccharide- and phorbol-induced nitric-oxide synthase activity and cellular injury in the rat colon. J. Pharmacol. Exper. Therap., 2000, 295, Thannickal V.J., Fanburg B.L. Reactive oxygen species in cell signaling. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., 2000, 279, L1005-L1028. Thonar E.J.M., Masuda K., Manicourt D.H., Kuettner K.E. Structure and function of normal human adult articular cartilage. In: Reginster J.Y., Pelletier J.P., Martel-Pelletier J., Henrotin Y. (Eds): Osteoarthritis. Clinical anf experimental aspects. Springer : Berlin, 1999, Tiku M.L., Liesch J.B., Robertson F.M. Production of hydrogen peroxide by rabbit articular chondrocytes. Enhancement by cytokines. J. Immunol., 1990, 145, Tiku M.L., Yan Y.P., Chen K.Y. Hydroxyl radical formation in chondrocytes and cartilage as detected by electron paramagnetic resonance spectroscopy using spin trapping reagents. Free Radic. Res., 1998, 29, Tiku M.L., Shah R., Allison G.T. Evidence linking chondrocyte lipid peroxidation to cartilage matrix protein degradation. Possible role in cartilage aging and the pathogenesis of osteoarthritis. J. Biol. Chem., 2000, 275, Todhunter R.J., Lust G. Synovial joint anatomy, biology, and pathobiology. In: Auer J.A. (Ed.): Equine Surg. 1992, Todhunter R.J., Fubini S.L., Freeman K.P., Lust G. Concentrations of keratan sulfate in plasma and synovial fluid from clinically normal horses and horses with joint disease. J. Am. Vet. Med. Assoc., 1997, 210,

54 Tolboom T.C., Pieterman E., Van der Laan W.H., Toes R.E., Huidekoper A.L., Nelissen R.G., Breedveld F.C., Huizinga T.W. Invasive properties of fibroblast-like synoviocytes: correlation with growth characteristics and expression of MMP-1, MMP-3, and MMP-10. Ann. Rheum. Dis., 2002, 61, Tomita M., Sato E.F., Nishikawa M., Yamano Y., Inoue M. Nitric oxide regulates mitochondrial respiration and functions of articular chondrocytes. Arthritis Rheum., 2001, 44, Toppets V., Pastoret V., De Behr V., Antoine N., Dessy C., Gabriel A. Morphologie, croissance et remaniement du tissu osseux. Ann. Méd. Vét., 2004, 148, Trumble T.N., Trotter G.W., Thom Oxford J.R., McIlwraith C.W., Cammarata S., Goodnight J.L., Billinghurst R.C., Frisbie D.D. Synovial fluid gelatinase concentrations and matrix metalloproteinase and cytokine expression in naturally occurring joint disease in the horses. Am. J. Vet. Res., 2001, 9, Tucci M.A., Tsao A., Hughes J., Baker R., Benghuzzi H. Release of inflammatory cytokines by macrophages and synovial cells challenged with tumor necrosis factor. Biomed. Sci. Instrum., 2002, 38, Tulamo R.M., Bramlage L.R., Gabel A.A. The influence of corticosteroids on sequential clinical and synovial fluid parameters in joints with acute infectious arthritis in the horse. Equine Vet. J., 1989a, 21, Tulamo R.M., Bramlage L.R., Gabel A.A. Sequential clinical and synovial fluid changes associated with acute infectious arthritis in the horse. Equine Vet. J., 1989b, 21, Valdez L.B., Alvarez S., Arnaiz L.S., Schöpffer F., Carreras M.C., Poderoso J.J., Boveris A. Reactions of peroxynitrite in the mitochondrial matrix. Free Radic. Biol. Med., 2000, 29, Vandenabeele F., De Bari C., Moreels M., Lambrichts I., Dell Accio F., Lippens P.L., Luyten F.P. Morphological and immunocytochemical characterization of cultured fibroblast-like cells derived from adult human synovial membrane. Arch. Histol. Cytol., 2003, 66, Van den Boom R., Brama P.A., Kiers G.H., de Groot J., Van Weeren P.R. Assessment of the effects of age and joint disease on hydroxyproline and glycosaminoglycan concentrations in synovial fluid from the metacarpophalangeal joint of horses. Am. J. Vet. Res., 2004, 65, Van de Lest C.H, Van den Hoogen B.M., Van Weeren P.R., Brouwers J.F., van Golde L.M., Barneveld A. Changes in bone morphogenic enzymes and lipid composition of equine osteochondrotic subchondral bone. Equine Vet. J. Suppl., 1999, 31, Vankemmelbeke M.N., Ilic M.Z., Handley C.J., Knight C.G., Buttle D. Coincubation of bovine synovial or capsular tissue with cartilage generates a soluble «Aggrecanase» activity. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, 255,

55 Vasquez-Vivar J., Kalyanarama B., Martasek P., Hogg N., Masters B.S., Karoui I H., Tordo P., Pritchard K.A.Jr. Superoxide generation by endothelial nitric oxide synthase: the influence of cofactors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1998, 95, Vasquez-Vivar J., Kalyanarama B., KennedyM.C. Mitochondrial aconitase is a source of hydroxyl radical. An electron spin resonance investigation. J. Biol. Chem., 2000, 275, Vergne B., Bertin P., Bannet C., Pairet M., Ueu L.P., Rigaud M. Differential inhibition of COX-1 and COX-2 by NSAIDs in cultured synovial cells. [en ligne] (sans date) consulté le 30 mai URL: Verlaet M., Duyckaerts C., Rahmouni S., Denis G., Humblet C., Greimers R., Sluse F.E., Boniver J., Defresne M.P. Transient modifications of respiratory capacity in thymic cells during murine radioleukemogenesis. Free Radic. Biol. Med., 2002, 33, Vermes I., Haanen C., Steffens-Nakken H., Reutelingsperger C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J. Immunol. Methods, 1995, 184, Viitanen M., Bird J., Maisi P., Smith R., Tulamo R.M., May S. Differences in the concentration of various synovial fluid constituents between the distal interphalangeal joint, the metacarpophalangeal joint and the navicular bursa in normal horses. Res. Vet. Sci., 2000, 69, Von Rechenberg B., McIlwraith C.W., Akens M.K., Frisbie D.D., Leutenegger C., Auer J.A. Spontaneous production of nitric oxide (NO), prostaglandin (PGE2) and neutral metalloproteases (NMPs) in media of explant cultures of equine synovial membrane and articular cartilage from normal and osteoarthritic joints. Equine Vet. J., 2000, 32, Wakabayashi T., Karbowski M. Structural Changes of Mitochondrial Related to Apoptosis. Biol. Signals Recept., 2001, 10, Winston G.B., Regoli F., Dugas A.J., Jr., Fong J.H., Blanchard K.A. A rapid gas chromatographic assay for determing oxydoradical scavenging capacity of antioxidants and biological fluids. Free Radic. Biol. Med., 1998, 24, Wittenberg R.H., Willburger R.E., Kleemeyer K.S., Peskar B.A. In vitro release of prostaglandins and leukotrienes from synovial tissue, cartilage, and bone in degenerative joint diseases. Arthritis Rheum., 1993, 36, Yamamoto S., Suzuki H., Ueda N., Takahashi Y., Yoshimoto T. Mammalian lipoxygenases. Chapter 5 in: Peter Curtis-Prior (Ed): The eicosanoids. John Wiley & Sons Ltd: Chichester, West Sussex, 2004,

56 Yao Q., Wang S., Glorioso J.C., Evans C.H., Robbins P.D., Ghivizzani S.C., Oligino T.J. Gene transfer of p53 to arthritic joints stimulates synovial apoptosis and inhibits inflammation. Mol Ther., 2001, 3, Ysart G.E., Mason R.E. Responses of articular explant cultures to different oxygen tensions. Biochim. Biophys. Acta, 1994, 1221, Zhang X., Mao Z., Yu C.J. Suppression of early experimental osteoarthritis by gene transfer of interleukin-1 receptor antagonist and interleukin-10. Orthop. Res. 2004, 22, Zhou S., Cui Z, Urban J.P.G. Factors influencing the oxygen concentration gradient from the synovial surface of articular cartilage to the cartilage-bone interface. Arthritis Rheum., 2004, 50, Zimmering T. Radiological and arthroscopic examination in comparison with light microscopical diagnosis of synovia of clinical sound fetlock joints of horses. Dissertation, TiHo Hannover Vendredi, 28 août 2004, Zoratti M., Szabo I. The mitochondrial permeability transition. Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1241,