Conditions de culture Consommation d O 2 (nmoles O 2 /min)

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1 Effets de l anoxie/ré-oxygénation sur les chondrocytes équins Respiration cellulaire (fonction mitochondriale) des chondrocytes équins Pour les essais en oxymétrie, 10 7 chondrocytes articulaires équins ont été cultivés pendant 48 h à 21 % ou à 5 % d O 2 et en présence de 0, 1 ou 4,5 g/l de glucose. Durant ces 48 h de préconditionnement, le nombre des cellules est resté stable (faibles variations non significatives), sauf à 21 % d O 2 et 0 g/l de glucose où la décroissance est significative par rapport aux conditions de culture à 1 g/l de glucose (figure 52). Les conditions de culture les mieux adaptées au maintien cellulaire sont 5 % d O 2 et 1 g/l de glucose, avec une légère augmentation (non significative) du nombre de cellules. Figure 52 : Nombre de chondrocytes vivants après 48 h de préconditionnement sous différentes tensions d O 2 et à différentes concentrations en glucose dans le milieu (moyennes ± SD ; n= 3). Après la période de 48 h de préconditionnement aux différentes conditions de culture et pour effectuer les mesures en oxymétrie, la concentration du milieu en O 2 est fixée à 225 nmol d O 2 141

2 (50 % de saturation du milieu), ce qui équivaut à une tension en O 2 de 13%, valeur intermédiaire entre 5% et 21% d O 2. La consommation d O 2 est enregistrée en fonction du temps et le calcul de la pente de la courbe fournit la consommation en O 2, exprimée en nmoles O 2 /minute. Avant anoxie, la consommation d O 2 est linéaire, avec une très faible pente, sans influence de la concentration du glucose dans le milieu ou de la tension d O 2 utilisées lors du préconditionnement (figure 53 I et II, partie gauche avant anoxie). Les consommations d O 2 moyennes varient entre 0,081 et 0,106 nmoles O 2 /min (tableau VII, valeurs de pente avant anoxie). En tenant compte du nombre de cellules dans chaque essai, la consommation moyenne est estimée à 20,5 pmol O 2 /min/10 6 chondrocytes. Comparés à d autres lignées cellulaires comme les cellules THP-1 (promonocytes humains en lignée continue) dépendantes de l O 2 et les cellules thymiques, les chondrocytes consomment 26 fois moins d O 2 que les cellules THP-1 qui, dans nos conditions de culture habituelles, consomment 544 pmol O 2 /min/10 6 cellules (figure 53, III) et environ 10 fois moins que les cellules thymiques qui consomment 200 pmol O 2 /min/10 6 cellules (Verlaet et al., 2002). Conditions de culture Consommation d O 2 (nmoles O 2 /min) O 2 (%) glucose (g/l) Avant anoxie Après anoxie ,083 ± 0, ± ,081 ± 0, ± ± ± Moyenne à 21% O ± ± 0.027* ± ± ± ± ± ± Moyenne à 5% O ± ± Table VII : Consommation d O 2 par les chondrocytes équins, exprimée par les valeurs de pente (valeurs négatives) calculées à partir des courbes en oxymétrie (moyennes ± SD). Les chondrocytes équins ont été préconditionnés à 21 % ou à 5 % d O 2 avec des concentrations variables en glucose dans le milieu de culture (n = 3 pour chaque condition). * p < 0.01 versus avant anoxie. 142

3 Figure 53 : Consommation d O 2 par 10 7 chondrocytes préconditionnés pendant 48 h en suspension à 5 % (I) ou 21 % (II) d O 2 et en présence de concentrations variables en glucose dans le milieu, en comparaison avec cellules THP-1 (III). Courbes A, B et C : 0 g/l, 1 g/l et 4,5 g/l de glucose, respectivement. Les flèches à deux extrémités indiquent la période d anoxie (25 min) : extrémité gauche de la flèche, barbotage de N 2 ; extrémité droite de la flèche, ré-oxygénation. 143

4 La faible consommation d O 2 par les chondrocytes oblige à les amener en anoxie par barbotage de N 2 dans la cellule d oxymétrie (extrémité gauche de la flèche sur la figure 53), tandis que les cellules THP-1 atteignent spontanément l anoxie après 35 minutes de respiration (figure 53 III). Après ré-oxygénation, les courbes d oxymétrie montrent que les chondrocytes préconditionnés à 21 % d O 2 consomment d avantage d O 2, indépendamment de la concentration en glucose dans le milieu : la valeur moyenne de consommation d O 2 est significativement augmentée (figure 53 I et II, partie de droite ; tableau VII, après anoxie). Il n y a cependant pas de modification de l allure de la courbe. Par contre, l anoxie a clairement modifié la pente de la consommation d O 2 par les cellules THP-1 : la courbe est devenue parabolique, signe d une altération de la respiration cellulaire (figure 53 III, partie droite). La viabilité cellulaire est toujours restée supérieure à 90 % après l expérience d A/R. Sur les chondrocytes cultivés à 5 % d O 2, nous avons vérifié le fonctionnement de la cytochrome c oxydase (complexe de la chaîne respiratoire qui réduit l O 2 ) après perméabilisation au Triton X- 100 et l avons comparé à celui des cellules THP-1. Nous avons mesuré les valeurs de 0,35 et 1,02 µmol de cytochrome c oxydé/min/10 6 cellules, pour les chondrocytes et les THP-1 respectivement. La chaîne mitochondriale des chondrocytes est donc fonctionnelle, avec une activité 3 fois inférieure à celle des promonocytes humains Production d espèces radicalaires Les chondrocytes, après préculture, sont soumis à des cycles répétés d A/R puis analysés pour la détection d espèces radicalaires par RPE en présence d un piégeur de spin. La répétition des cycles d A/R n a pas modifié significativement les pentes des courbes d oxymétrie (figure 54) et la recherche d espèces radicalaires n a donné aucun résultat significatif : nous n avons enregistré aucun signal RPE d adduit de spin montrant la production d O 2 ou d un radical lipidique. L absence de signal RPE suggère que les cycles d A/R de courte durée n induisent pas une activation du métabolisme de l O 2 suffisante pour permettre l observation d une production d espèces radicalaires par les chondrocytes équins. 144

5 Figure 54 : Mesure de la consommation d O 2 par 10 7 chondrocytes avant et après plusieurs cycles d anoxie/ré-oxygénation. L anoxie est atteinte par barbotage de N 2 dans la solution (flèche verticale). Les flèches à deux pointes (A) indiquent les périodes d anoxie Effets métaboliques En 2 heures (durée totale de l expérience d A/R et d oxymétrie), les chondrocytes ont consommé entre 23 % et 35 % du glucose disponible dans le milieu (figure 55). La consommation de glucose était significativement plus élevée pour les chondrocytes en milieu à 4,5 g/l glucose, indépendamment de la tension en O 2 appliquée lors de la préculture. La production de lactate était plus élevée en présence de 1g/l de glucose, sans effet de la tension en O 2 utilisée lors de la préculture (figure 56). À 4,5 g/l de glucose, la production de lactate était statistiquement différente selon les conditions d oxygénation lors de la préculture (p < 0,01). 145

6 Figure 55 : Consommation du glucose (moyenne ± SD) par 10 7 chondrocytes pendant la durée de l expérience d oxymétrie avec A/R (n= 3). Les cellules ont été préconditionnées pendant 48 h à 5 % ou à 21 % d O 2, avec 1 ou 4,5 g/l glucose dans le milieu de culture. Figure 56 : Libération du lactate (moyenne ± SD) par 10 7 chondrocytes pendant l expérience d oxymétrie avec A/R (n= 3). Les cellules ont été préconditionnées pendant 48 h à 5 % ou à 21 % d O 2 et 1 ou 4.5 g/l glucose dans le milieu de culture. 146

7 Discussion Cette partie du travail apporte plusieurs observations intéressantes (Schneider et al., 2007) : 1. la faible consommation d O 2 par les chondrocytes équins (20.5 pmol O 2 /min/10 6 cellules comparés aux 544 pmol/min/10 6 consommés par les promonocytes THP-1), avec un effet très limité de l A/R, 2. l absence de formation d espèces radicalaires par les chondrocytes, même après plusieurs cycles d A/R. Il faut tenir compte de la sensibilité limitée de la technique RPE qui nécessite un nombre élevé (de l ordre de centres) pour obtenir un signal détectable, mais l absence de signal permet d exclure une production «massive» d espèces radicalaires par les chondrocytes sous l effet de l A/R et confirme leur métabolisme de type anaérobie. 3. l augmentation de la consommation de glucose et la diminution de la production de lactate par les chondrocytes cultivés à 4,5 g glucose/l, sans effet de la tension en O 2. Il existe peu de données sur l étude de la consommation d O 2 par les chondrocytes, et particulièrement par les chondrocytes équins. La consommation d O 2 par les chondrocytes articulaires bovins (animaux âgés de 18 à 24 mois) soumis à 10 % et 21 % d O 2 se situe entre 7,7 et 12 nanomoles d O 2 /h/10 6 cellules, correspondant à 128,3 et 200 pmoles/min/10 6 cellules (Zhou et al., 2004). Cette consommation est similiaire à celle des cellules thymiques (lignée cellulaire dépendante d O 2 ) (Verlaet et al., 2002) et plus élevée que celle que nous avons mesurée. Cette différence peut difficilement s expliquer par l espèce, mais par les conditions de travail : Zhou et al. ont utilisé des chondrocytes isolés mais non soumis à une période de culture préalable et ont réalisé leurs expériences d oxymétrie en présence de 1 g/l glucose. D autres auteurs ont observé une augmentation de la consommation en O 2 lorsque les chondrocytes sont soumis aux hautes concentrations d O 2 (Lane et al., 1977), augmentation qui contribuerait à la production de radicaux libres suite à une altération de la chaîne mitochondriale. Quelques travaux ont été consacrés à la mesure de la consommation d O 2 par les chondrocytes dans une perspective de «tissue engineering», pour multiplier les chondrocytes et obtenir un nombre important de cellules destinées à une utilisation de réparation du cartilage (Haselgrove et al., 1993; Nehring et al., 1999; Obradovic et Meldon, 2000 ; Malda et al., 2004). Notre but était tout différent : nous avons utilisé des chondrocytes matures maintenus en culture sans dédifférenciation et sans chercher à provoquer leur multiplication, en vue de mesurer leur consommation d O 2 et leur 147

8 réponse à l A/R. Les résultats présentés dans ce travail ne peuvent donc pas être comparés à ceux mentionnés dans ces études. La faible consommation d O 2 par les chondrocytes équins confirme nos observations précédentes où, soumis aux conditions de privation en O 2 quasi totale, les chondrocytes pouvaient survivre en culture pour des durées de plusieurs jours (Schneider et al., 2004). Les chondrocytes ont également survécu à l absence de glucose pendant 48 h et maintenu une consommation d O 2 similaire à celle des chondrocytes préconditionnés en présence de 1 or 4,5 g/l glucose. Ces observations suggèrent que la phosphorylation oxydative mitochondriale contribue peu à l apport énergétique nécessaire aux chondrocytes pour lesquels la glycolyse anaérobie oxydative (ou la β-oxydation des lipides) pourrait être la source dominante d ATP. Les chondrocytes articulaires pourraient disposer d un stock important de réserves en énergie. On a émis l hypothèse que les mitochondries des chondrocytes sont dépourvues en certains cytochromes et que la stimulation de la glycolyse dans le cartilage articulaire est obtenue par des oxydants exogènes tels que l O 2 en condition physiologique ou d autres oxydants en condition d absence d O 2 (Lee et Urban, 2002). Une mesure de l activité de la cytochrome c oxydase des chondrocytes équins a montré que cette activité était présente, bien qu inférieure à celle des cellules THP-1. La très faible consommation d O 2 par les chondrocytes ne peut donc pas s expliquer par une chaîne mitochondriale incomplète au niveau de la cytochrome c oxydase (complexe IV), mais elle pourrait être le résultat d une activité réduite des complexes I, II et III. Dans les chondrocytes articulaires humains ostéoarthritiques cultivés en monocouche, on a décrit une activité réduite des complexes II et III et signalé que la plus grande partie des mitochondries étaient «de-energized», tandis que la masse mitochondriale était augmentée (Maneiro et al., 2003). Les mitochondries présentaient une dépolarisation du potentiel transmembranaire, conduisant à un gonflement mitochondrial avec rupture de la membrane et libération de facteurs inducteurs d apoptose. Le même groupe de chercheurs a signalé une activité réduite du complexe I de la chaîne mitochondriale associée au vieillissement et une suppression de l activité du complexe IV par le NO (Maneiro et al., 2005). Mais ces conditions ne correspondent pas à nos conditions de travail. Après anoxie, la consommation d O 2 par les chondrocytes articulaires équins reste linéaire (pas de modification de l allure de la pente respiratoire). Les chondrocytes conditionnés à 5 % d O 2 montraient une réduction de la respiration mitochondriale, mais sans atteindre la signification 148

9 statistique, et ceux préconditionnés à 21 % O 2 une accélération significative de la consommation d O 2, indépendamment de la concentration en glucose du milieu. Cette accélération est modeste si on la compare aux modifications de pente et d allure observées pour les cellules THP-1 soumises à l A/R. Actuellement, il est impossible de déterminer si cette augmentation postanoxique de la consommation d O 2 est due à une augmentation de l activité mitochondriale ou à l activité d une autre oxydase comme une oxydase cytoplasmique «NADPH-oxidase-like» (Moulton et al., 1997). La faible activité de la fonction respiratoire mitochondriale peut expliquer que les chondrocytes articulaires équins ne répondent pas (même en l absence de glucose) à l anoxie profonde et aux cycles d A/R par une importante production d espèces radicalaires. Des études antérieures sur chondrocytes humains et sur chondrocytes de lapin, cultivés à 21 % d O 2, ont montré l existence d un métabolisme oxydant activé après anoxie (Henrotin et al., 1993 ; Tiku et al., 1998). On ne peut exclure une réactivité différente des chondrocytes équins, mais l explication la plus vraisemblable à cette divergence de résultats se trouve dans les différences entre techniques utilisées. La formation de ROS après anoxie a été démontrée par des mesures en fluorescence, essentiellement pour la détection d H 2 O 2, et par la mesure du pentane formé lors de la peroxydation lipidique, deux produits dont la formation est consécutive à une production d espèces radicalaires mais qui sont des produits plus stables que les espèces radicalaires et qui peuvent s accumuler au cours de la réaction (Henrotin et al., 1993). Tiku et al. (1998) mentionnent une production d O 2 et d H 2 O 2 par les chondrocytes, mais après une stimulation par le PMA en présence de Fe 2+, et la formation d OH par le cartilage non stimulé (lapin et homme) toujours en présence de Fe 2+. Leurs conditions de travail simulent les conditions rencontrées dans l inflammation, considérée comme pouvant être accompagnée d une production des ROS (Kawai et al., 2000), plutôt qu une situation d A/R sans autre stimulation. Lorsque les chondrocytes sont cultivés in vitro à 21 % d O 2, ils se trouvent en état d hyperoxie (par rapport à leurs conditions in vivo) capable de perturber leur statut redox (Cernanec et al., 2002 ; Schneider et al., 2004 ; Mathy-Hartert et al., 2005) et d entraîner une réponse à l anoxie. Par ailleurs, aucune étude en RPE n a démontré la formation d espèces radicalaires par les chondrocytes, quelle que soit leur espèce d origine. La détection d un signal RPE nécessite un 149

10 nombre important de cellules pour obtenir le nombre suffisant de centres radicalaires capables de former le signal RPE. On peut donc conclure que la production d espèces radicalaires par les chondrocytes sans stimulation autre que l A/R reste très faible, en deçà des limites de détection par RPE couplée au spin trapping. Une dernière observation surprenante fut que la consommation en glucose et la libération de lactate étaient dépendantes de la concentration en glucose dans le milieu et non de la tension en O 2 appliquée lors du préconditionnement. À 4.5 g/l de glucose, les chondrocytes ont consommé davantage de glucose, sans modification significative de la pente respiratoire. On peut invoquer un transport accru du glucose conduisant au stockage sous forme de glycogène ou à une synthèse accrue des protéoglycanes ou des lipides (Lee et Urban, 2002). On a décrit une réduction de la consommation d O 2 induite par le glucose (effet Crabtree) avec une glycolyse limitée, suggérant un possible empoisonnement des chondrocytes articulaires par un excès de glucose (Otte, 1991) et trouvé que la consommation en glucose et la production de lactate par les chondrocytes aux basses tensions d O 2 étaient supérieures à celles des fibrocytes cultivés à 21 % (effet Pasteur) (Marcus, 1973). Dans nos expériences, la consommation du glucose était supérieure à la libération du lactate, indépendamment des conditions de culture, et la production de lactate était réduite pour les cellules conditionnées à 4,5 g/l de glucose, indicateur possible d une modification du métabolisme du glucose lorsque sa concentration extracellulaire est élevée, permettant d éviter un excès de lactate et une réduction du ph intracellulaire. Pour une expérimentation sur les chondrocytes articulaires équins imitant au mieux les conditions in vivo, il est sans doute préférable d utiliser un milieu de culture avec une concentration physiologique en glucose Production des ROS par les synoviocytes Respiration cellulaire (fonction mitochondriale) lors de l A/R Après culture jusqu à confluence suivie de trypsination (viabilité cellulaire > 95%), les synoviocytes (HIG-82 et cellules primaires équines) présentent une respiration mitochondriale régulière. Les courbes de consommation d O 2 sont semblables pour les deux lignées de synoviocytes ; elles sont linéaires, avec une valeur de pente égale à 11 nanomoles O 2 /min/

11 cellules (figure 57, courbe 1) cellules consomment en 20 minutes la totalité de l O 2 dissous dans le milieu et atteignent l anoxie sans nécessité d un barbotage à l azote. Les cycles d A/R entraînent une diminution progressive de la pente respiratoire (figure 57, courbes 2, 3 et 4). Figure 57 : Consommation d O 2 par 10 7 synoviocytes (HIG-82) et effets de cycles répétitifs d A/R (n= 3). Les flèches à deux pointes (A) indiquent les périodes d anoxie. Les 4 pentes respiratoires (1 à 4) sont égales à 11, 5,5, 4 et 3,2 nanomoles d O 2 consommé/min/10 7 cellules. Après la première période d anoxie, la valeur de la pente respiratoire est tombée à 5,55 nanomoles O 2 /min/10 7 cellules (réduction de 50 %) et ce ralentissement a continué aux deuxième et troisième périodes d anoxie avec des valeurs de pente respiratoire égales à 4.0 et 3.22 nanomoles O 2 /min/10 7 cellules respectivement, ce qui montre une diminution de moins en moins marquée. Après la dernière période d anoxie, l allure de la courbe change: elle n est plus linéaire, signe de l existence de dommages mitochondriaux. La viabilité cellulaire était 75 % à la fin de l étude. Pour vérifier l effet d une stimulation préalable des synoviocytes sur leur réponse ultérieure à l A/R, nous avons utilisé le PMA, un activateur du complexe NADPH-oxydase via la protéine kinase C. Il a été ajouté (à 10-7 M) aux synoviocytes après 7 minutes de respiration cellulaire et a provoqué une accélération de la consommation d O 2 : la valeur de la pente mesurée en oxymétrie a atteint, après PMA, 150% de la valeur avant PMA. Mais cette stimulation au PMA n a pas 151

12 influencé la réponse ultérieure à l A/R: le ralentissement de la respiration cellulaire s est maintenu dans les mêmes proportions Mise en évidence d une production d espèces radicalaires par RPE-spin trapping lors de l A/R La production d espèces radicalaires par 10 7 synoviocytes (cellules HIG-82 et synoviocytes équins primaires) a été démontrée par RPE en présence de POBN avec ou sans addition d éthanol (POBN/EtOH). Les spectres RPE sont représentés sur les figures 58 et 59. Les spectres contrôles sont obtenus avec des synoviocytes équins en normoxie en présence de POBN/EtOH : aucun signal RPE n est mesurable (figures 58 A et 59 A). Par contre, après les cycles d A/R, on enregistre un spectre RPE à six lignes, caractéristique des adduits de spin POBN/ CH(OH)CH 3 (POBN/ethoxy) avec les constantes de couplage suivantes : a N = 15.7 G et a H = 2.7 G (figures 58 B et 59 B). Le signal RPE des synoviocytes équins primaires (figure 58 B) était plus intense que celui des synoviocytes HIG-82 (figure 59 B). En l absence d éthanol, le spectre RPE montre un signal à 3 lignes, avec la constante de couplage a N = 15,2 G, caractéristique d un adduit de spin POBN/lipide suggérant la formation de radicaux centrés sur un carbone d une chaîne lipidique (figure 59 C). 152

13 Figure 58 : Signal RPE produit par 10 7 synoviocytes équins après 3 cycles d A/R (spin trap : POBN en présence d éthanol). Les flèches verticales indiquent les lignes caractéristiques du signal: présence d un adduit POBN/éthoxy. Nombre de scans : 6. (A) Contrôle (cellules en normoxie) et (B) cellules soumises aux cycles d A/R. La flèche horizontale indique le sens de l augmentation du champ magnétique (H). 153

14 Figure 59 : Signal RPE produit par 10 7 synoviocytes (HIG-82) à la fin de 3 cycles d A/R (spin trap : POBN). Les flèches verticales indiquent les lignes caractéristiques du signal. La flèche horizontale indique le sens de l augmentation du champ magnétique A : contrôle (cellules en normoxie). B : cellules soumises aux cycles d A/R en présence d éthanol, signal d un adduit POBN/éthoxy. C : cellules soumises aux cycles d A/R en l absence d éthanol, signal d un adduit POBN/lipide. 154

15 Effets de stimulateurs sur la production globale de ROS (mesure de l éthylène par chromatographie en phase gazeuse) Variabilité de la production de ROS selon l origine des synoviocytes Les synoviocytes présentent un métabolisme oxydatif de base, mesurable sans aucune stimulation préalable et correspondant à une production d éthylène de 2 à 25 picomoles/10 6 cellules, avec une importante variabilité selon la culture et l origine de la membrane synoviale. Pour cette raison, dans toutes les expériences, la production d éthylène par les cellules activées a été comparée à celle des cellules non activées prise comme 100 % (contrôle). Cette importante variabilité de base a rendu impossible la démonstration claire d un effet de l A/R sur la production d éthylène. Réponse à une stimulation par le PMA et effet du DPI Le PMA exerce un effet activateur, extrêmement variable selon l origine des synoviocytes (figure 60, histogrammes 2, 3 et 4). La production d éthylène après PMA atteint parfois jusqu à 1000 % par rapport au contrôle sans stimulation, mais elle peut aussi ne pas dépasser 150 %. L intensité de l effet du PMA est liée à l activité oxydante de base que présentent déjà les synoviocytes sans stimulation. L effet activateur est lié à la concentration en PMA utilisée (figure 60, histogrammes 4, 5 et 6). Il augmente avec le nombre de synoviocytes utilisés, mais pas de manière proportionnelle à leur nombre (figure 61, histogrammes 2 et 3) et est aboli lorsque l activation est faite après addition de diphényl iodonium (DPI), un inhibiteur des enzymes à flavine (figure 61, histogramme 4). L utilisation du DPI peut entraîner une chute de la production d éthylène endessous de la valeur du contrôle. 155

16 Figure 60 : Production d espèces oxydantes (estimée par la mesure de l éthylène libéré à partir du KMB) par synoviocytes équins activés par le PMA, exprimée en % de la valeur contrôle (C : synoviocytes non activés) (n=3). Histogrammes 2, 3 et 4 : activation par 10-7 M PMA ; les synoviocytes sont isolés à partir de trois échantillons de membrane synoviale différents. Histogrammes 5 et 6 : activation respectivement par 10-8 et 10-9 M PMA ; les synoviocytes proviennent de la même membrane synoviale que ceux de l histogramme 4. Figure 61 : Production d espèces oxydantes (estimée par la mesure de l éthylène libéré à partir du KMB) par les synoviocytes équins activés par 10-8 M PMA, exprimée en % de la valeur contrôle (C : synoviocytes non activés) (n=3). Histogramme 2 : synoviocytes ; histogramme 3 : synoviocytes ; histogramme 4 : synoviocytes M DPI. 156

17 Réponse à une stimulation par le TNF-α et les LPS Comme les synoviocytes répondent à une stimulation par un agent pharmacologique, nous avons aussi utilisé deux agents de stimulation naturels pour tester leur réponse: le TNF-α et les LPS. Ces agents ont été pré-incubés durant une nuit avec les cellules avant l étude de production d éthylène. Ils ont induit une stimulation modérée des synoviocytes (figure 62, histogrammes 2 et 3), avec un effet inhibiteur du DPI (figure 62, histogramme 4). Figure 62 : Production d espèces oxydantes (estimée par la mesure de l éthylène libéré à partir du KMB) par les synoviocytes équins activés par 10 U de TNF-α (histogramme 2) ou 1 µg de LPS (histogramme 3) exprimée en % de la valeur contrôle (C : synoviocytes non activés) (n=3). Histogramme 4 : effet du DPI sur l activation par le LPS. Nous avons confirmé l action stimulante du TNF-α par des essais en RPE en utilisant le spin trap DMPO. Un signal RPE de faible intensité a été enregistré lorsque les cellules sont stimulées par 100 U de TNF-α. Le spectre RPE est constitué de quatre raies d intensité 1 :2 :2 :1, caractéristique de l adduit de spin DMPO-OH résultant de la décomposition de l adduit DMPO- OOH formé lors de la réaction du spin trap avec d O 2 (figure 63, flèches noires) (Britigan et al., 1990 ; Mouithys-Mickalad et al., 2001). La présence d un signal RPE confirme qu il y a une faible production de radicaux par les synoviocytes stimulés au TNF-α, mais des essais complémentaires sont nécessaires pour préciser ces premiers résultats, particulièrement parce que 157

18 le spectre RPE montre également trois raies plus intenses (figure 63, flèches rouges) qui sont dues à l oxydation du spin trap DMPO au contact des cellules et qui viennent masquer l adduit de spin formé. Figure 63 : Signal RPE produit par 10 7 synoviocytes stimulés par le TNF-α (100 U) en présence du spin trap DMPO. Les 4 flèches verticales noires indiquent les lignes caractéristiques du signal et les trois flèches rouges les raies caractéristiques de l oxydation du DPMO par les cellules. La flèche horizontale indique le sens de l augmentation du champ magnétique (en Gauss) Discussion Les observations essentielles de cette partie du travail sont les suivantes (Schneider et al., 2005) : - l étude en oxymétrie a démontré que les synoviocytes consomment l O 2, que la fonction mitochondriale des synoviocytes est altérée par les cycles répétitifs d A/R et que leur consommation d O 2 peut être activée par le PMA. - la RPE a prouvé que les synoviocytes produisent des radicaux libres sous l effet des cycles d A/R. 158

19 - l étude par la mesure de l éthylène a montré que les synoviocytes sont capables de produire des ROS, que cette activité oxydante existe à l état basal (auto-activation) avec une grande variabilité selon le lot cellulaire et qu elle peut être augmentée par une stimulation au PMA, au TNF-α et par les LPS. La consommation d O 2 par les synoviocytes est élevée (de l ordre de la nanomole d O 2 /min/10 6 cellules), environ deux fois plus élevée que celle des cellules THP-1. Cette consommation importante pourrait expliquer leur sensibilité à l A/R. Sous l effet des cycles d A/R, la courbe oxymétrique montre une augmentation du temps nécessaire pour consommer tout l O 2 réintroduit lors de la ré-oxygénation (diminution de la pente respiratoire) et ce retard s accroît après chaque nouvelle période d anoxie. Cette diminution ne peut pas être totalement imputée à une mortalité cellulaire en cours d expérience puisque la viabilité cellulaire comptée à la fin des manipulations est toujours restée égale ou supérieure à 75 %. De plus, lors de la dernière mesure de la consommation d O 2, la courbe oxymétrique n est plus linéaire, témoin d une altération de la fonction mitochondriale. La mesure de la consommation d O 2 est considérée comme le reflet de la fonction mitochondriale, mais pour les synoviocytes équins, on ne peut pas exclure la participation d une activité enzymatique de type «NADPH-oxidase like» ou NOX puisque la stimulation par le PMA augmente la consommation d O 2 et qu il est admis que cet agent pharmacologique agit, via la PKC, sur l activité de la NADPH-oxydase (Babior, 1999). L existence d une activité de type NOX dans les synoviocytes à l état basal est confirmée par les mesures de l éthylène. Les synoviocytes sont capables de produire de l éthylène à partir du KMB : la formation d éthylène résulte de l attaque du KMB par les espèces radicalaires ( OH, ions ferryls, radicaux alcoxyles ou peroxyles) et deux molécules d éthylène sont produites à partir de deux molécules de KMB (Winston et al., 1998 ; Mouithys-Mickalad et al., 2001). Dans le modèle de mesure de l éthylène comme témoin d une attaque oxydante du KMB, l addition d HRP augmente considérablement la réaction parce que cette enzyme en utilisant H 2 O 2 produit des espèces plus oxydantes qu H 2 O 2 lui-même (Rush et Koppenol, 1986). La production d éthylène induite par l activité oxydante des synoviocytes équins peut être attribuée à une production d H 2 O 2, lui-même dérivé d O 2 produit par l activité d une enzyme de type NADPH oxydase. Sans stimulation, les synoviocytes équins en culture présentent déjà cette activité, mais 159

20 la stimulation par le PMA l augmente de manière dose-dépendante. L effet stimulateur du PMA est bloqué par le DPI, un composé qui agit au niveau de la flavine dans les NOX. Mais le PMA active également la NOS (Tepperman et al., 2000) et le DPI n est pas spécifique des NOX mais touche d autres enzymes à flavine (Hancock et Jones, 1987), comme la NOS dont on admet qu elle peut produire O 2 en plus du NO, capables de réagir in situ et de produire le peroxynitrite, un puissant agent peroxydant (Vasquez-Vivar et al., 1998). La réponse positive des synoviocytes à une stimulation par le TNF-α ou les LPS (augmentation de la production d éthylène), deux substances agissant par la voie des récepteurs membranaires et aboutissant à la stimulation de la PKC, apporte un argument supplémentaire au rôle des NOX et NOS. L A/R a induit des altérations de la chaîne respiratoire mitochondriale (observées en oxymétrie) et il est admis qu une chaîne mitochondriale altérée conduit à une production d O 2 ou d autres espèces radicalaires (Di Lisa et Bernardi, 1998 ; Bernardi et al., 2001 ; Andreyev et al., 2005). Cependant, sur la production globale de ROS par les synoviocytes équins mesurée par la production d éthylène à partir de l oxydation du KMB, nous n avons pas observé d effet significatif de l A/R. Ici, il faut rappeler que la méthode chromatographique utilisant l oxydation du KMB en éthylène mesure surtout l activité de production des ROS par des enzymes situées près ou à la surface des cellules. Pour que les espèces radicalaires et oxydantes produites dans la mitochondrie ou le cytosol puissent agir sur le KMB, il faut soit que le KMB et l HRP pénètrent dans la cellule, ce qui n est pas démontré pour le KMB et impossible pour l HRP, soit que ces espèces atteignent la surface cellulaire. On ne peut pas exclure qu au cours de l A/R une production d O 2 et de ses dérivés ait eu lieu au niveau de la chaîne respiratoire mitochondriale, par la NOS mitochondriale activée ou par la xanthine oxydase, mais qu elle ait été insuffisante pour amener l oxydation du KMB à la surface de la cellule. Il faut rappeler aussi que la durée de chaque période d anoxie était courte (25 minutes). L étude en RPE confirme cependant que les synoviocytes réagissent aux cycles d A/R par une production de radicaux libres, sans addition de stimulateurs exogènes. Les signaux observés sont ceux des adduits POBN/éthoxy qui peuvent être attribués à la réaction d une espèce radicalaire dérivée de l O 2 avec le couple POBN/EtOH (Du et al., 1999). Des études antérieures ont montré que la POBN peut traverser la membrane mitochondriale, arriver dans le compartiment matriciel 160