La chromatographie sur couche mince ou chromatographie planaire (CCM, en anglais TLC pour Thin layer chromatography) est une technique de chromatographie couramment utilisée pour séparer des composants dans un but d analyse (CCM analytique) ou de purification (CCM préparative). Elle comprend : Une phase stationnaire : une couche mince de matériel adsorbant (usuellement du gel de silice, de l oxyde d aluminium ou de la cellulose) de 100-200 mm généralement déposée sur une plaque rectangulaire en verre, en aluminium, de quelques cm de côté. On distingue 3 étapes : Préparation des plaques Dépôt de l échantillon Développement des plaques Le développement des plaques se fait sur des milieux spécifiques dits phases liquides. Une phase liquide, dite phase mobile ou éluant est un solvant ou un mélange de solvants qui va entraîner les composés à séparer le long de la phase stationnaire. Généralement, le phénomène d adsorption est prépondérant (mais il y a également partage si le solvant est un mélange). La chromatographie sur couche mince multi-système se fait sur 4 systèmes de phases mobiles dans des milieux clos suffisamment saturés dans cuves d élution, à savoir TA, TD, TE, TB Protocole opératoire Réactifs 1. Ether 2. Chloroforme 3. Acétone 4. Méthanol 5. Ammoniaque 6. Ethyle Acétate 7. NaOH 10N 8. HCl 6N Analytical Toxicology - CCM Multi-système 1
Matériel 1. 2. Plaques de CCM en gel de silice (10 x 10 cm) Cuves de développement des plaques (4) (en verre borosilicaté dimensions : hauteur : 14 cm, largeur 13 cm, épaisseur : 9 cm.) Cuves de développement des plaques 1. 2. Ampoules à décanter (4) Cristallisoirs (4) Préparation des phases mobiles Dessiccation des plaques : 30 mn à 100 C dans l étuve. Préparation des phases mobiles : La phase TA: Méthanol + Ammoniaque (50 : 0.750) ml volume : volume La Phase TD: Chloroforme + Acétone (40 : 10) ml volume : volume La phase TE: Ethyle Acétate, Méthanol, Ammoniaque (42.3 : 5 : 2.5) ml volume :volume :volume. La phase TB: Cyclohexane, Toluène, Diéthylamine (37.5 : 7.5 : 5) ml volume : volume : volume Laisser saturer les cuves pendant au moins 30mn. Extraction Procéder à une extraction acide à l éther et basique au dichlorométhane (se référer au chapitre «identification des toxiques»). Séchage : L extractum (phase organique) récupéré après déshydratation (au sulfate de sodium anhydre) et filtration à l aide d un papier filtre, dans des cristallisoirs en verre et desséché Analytical Toxicology - CCM Multi-système 2
sur la plaque chauffante. Dépôt de l échantillon On commence par déposer un petit volume (compris entre quelques nanolitres et plusieurs microlitres) de l échantillon en solution diluée, à proximité du bord inférieur de la plaque sous forme d une tache de 1 à 3 mm de diamètre. Ce dépôt est réalisé soit manuellement, soit de manière automatique, avec un capillaire à extrémité plane (fig. 5.1). La tache peut également avoir la forme d un trait horizontal de quelques mm, obtenu par pulvérisation de l échantillon au moyen d un dispositif automatique dont l intérêt est de pouvoir maîtriser la reproductibilité des quantités déposées, ce qui est indispensable en analyse quantitative. La plaque ainsi préparée est introduite dans une cuve spéciale munie d un couvercle, au fond de laquelle se trouve un peu de la phase mobile servant d éluant. L endroit où l échantillon se trouve doit être situé au-dessus du niveau d immersion. Appareil de dépôt automatique en CCM et de lecture de plaque. Applicateur Linomat IV programmable, et densitomètre mesurant la lumière réfléchie ou transmise par la plaque. Le schéma optique est assez semblable à celui d un spectromètre UV/Visible (modèle Scanner 3, reproduit avec l autorisation de la société Camag). On utilise des plaques de 10 10 cm pour 8 points de dépôts. On dépose pour chaque plaque, la molécule de référence (voir tableau dans la section annexes ) du système de migration et une molécule étalon. Pour le système TA on dépose 4 points de l extractum alcalin et un point de l extractum acide. Inversement pour le TD on dépose 4 points de l extractum acide et un point de l extractum alcalin. Analytical Toxicology - CCM Multi-système 3
On dépose en parallèle pour le système TE ss2 points de l extractum acide et 2 points de l extractum basique. Même étape précédente pour le système TB si les trois milieux précédents n ont pas permis de séparer les substances en question. Développement des plaques La phase mobile migre par capillarité à travers la phase stationnaire sèche, entraînant à des vitesses différentes les constituants à séparer. Le temps de migration (plusieurs minutes) dépend de divers paramètres. Quand le front de solvant a parcouru une distance considérée comme suffisante (quelques centimètres), on retire la plaque de la cuve, on repère la position limite atteinte par la phase mobile et on évapore cette dernière. Lorsqu on utilise une plaque à polarité de phase inversée («RP TLC»), l éluant comporte de l eau. Il est alors utile d ajouter un sel, tel du chlorure de lithium, pour limiter les phénomènes de diffusion et augmenter ainsi la résolution. Le solvant met environ 20 mn pour atteindre le front. Tableau de référence des Rf (rapports frontaux) Nous avons procédé à un traitement de 21 étalons (y compris les molécules de référence Amitriptyline (TA) Paracétamol (TD) Prazépam (TE) et Trimipramine (TB)). La même procédure a été répétée 3 fois par trois manipulateurs différents mais toujours dans les mêmes conditions opératoires. Le tableau ci-dessous montre les valeurs moyennes des Rf obtenus après les 3 manipulations. A noter que pour une même molécule, les valeurs des Rfs retenues sont seules qui présentaient un écart type faible au cours des 3 manipulations. Analytical Toxicology - CCM Multi-système 4
Tableau 1: Rapport frontaux des substances médicamenteuses. Rapport frontaux (RF) x 100 Molécule TA TD TE TB Glimépiride 86 55 12 0 Prednisone 86 21 62 0 Betametazone 85 40 78 0 Atorrvastatine 85 8 2 0 Valsartan 85 10 1 0 Gliclazide 85 10 0 Hydrocortisone 82 12 61 0 Paracétamol 79 24 66 0 Nifluril 81 35-55 (fusée) 16 0 Ketoprofen 81 59 2 0 Tétrazépam 80 68 89 47 Chlorazépate 80 40 80 8,7 Prazépam 81 69 88 5 Naproxène 80 67 5 0 Diclofénac 80 65 11 0 Acetazolamide 80 6 11 0 Flunastatine 80 0 0 0 Amiloride 80 6 55 0 Lansoprazole 80 8 49 0 DHE 80 0 55 0 Spironolactone 80 75 91 16 Piroxicam 80 67 16 0 Furosémide 79 16 (fusée) 6 0 Dompéridone 79 56 0 Zolpidem 79 21 (fusée) 72 8,75 Pyrazinamide 79 12 59 6 Diazépam 78 65 86 38 Analytical Toxicology - CCM Multi-système 5
Bromazépam 78 9 77 4 Rifampicine 7 12 Metronidazole 78 56 84 11 Hydrochlorothiazide 78 6 46 0 ketoprofène 78 56 4 0 Indométacine 78 42 10 0 Halopéridol 76 0 86 21 Ketoconazole 76 4 65 0 Lamotrigine 76 0 62 0 Fluconazole 75 5 45 0 Carvedilol 74 0 72 4 Amiodarone 73 7,5 79 96 Carbamazépine 72 35 69 6,2 Atarax 72 0 63 16 Amiloride 72 2 55 0 Atropine 71 27 69 0 Dextropropoxyphène 70 4 89 0 Miansérine 68 10 82 59 Trimipramine 66 0 90 84 Lévomépromazine 62 0 90 74 INH 62 9 30 0 Flecainide 62 1,25 68 5 Sertraline 59 0 85 70 Amitriptyline 56 0 80 75 Propranolol 57 0 62 12 Métoprolol 55 0 60 14 Chlorpromazine 53 0 86 72 Clomipramine 53 0 86 80 Ranitidine 52 0 34 0 Salbutamol 51 56 20 0 Ketotifen 49 1 71 31 Imipramine 48 0 82 76 Aténolol 46 0 12 0 Analytical Toxicology - CCM Multi-système 6
Oméprazole 45 10 68 0 Polaramine 45 61 0 0 Acébutolol 41 0 29 0 Sulpiride 40 0 38 0 Codéine 38 38 10 0 Fluoxétine 34 0 49 22 Cyanocobalamine 34 0 0 0 Cocaine 30 0 0 0 Amlodipine 30 0 31 2,5 Paroxétine 25 0 49 10 Pseudoephedrine 21 0 12 9 Betahistidine 12 0 6 8 Captopril 6 0 0 0 Metformine 4 0 1 0 Ibuprofène 0 74 7 0 Note : Les valeurs des rapports frontaux dans le tableau sont multipliées par 100. Analytical Toxicology - CCM Multi-système 7