DIU pathologie moléculaire jan 2013 - Bordeaux Tumeurs mélaniques Cliniciens : Thomas Jouary, M. Beylot-Barry Pathologiste : B. Vergier Biologie des tumeurs : JP Merlio, E. Laharanne et V. Haddad
Le mélanome en quelques chiffres... Incidence France : 7300 nouveaux cas / an incidence par sexe : 8 / 100 000 chez les femmes et 6,4 / 100 000 chez les hommes - 3 à 5% d augmentation annuelle - un taux de doublement tous les 10 à 15 ans La mortalité estimée due au mélanome est de 2,4 / 100 000 par an chez les femmes et 3,2 / 100 000 par an chez les hommes Le pic de fréquence d âge se situe entre 20 et 45 ans avec 50% de mélanomes survenant avant 55 ans dont 30% avant 45 ans (Malher, british 2002)
Un peu de clinique Piège diagnostique courant : naevus / mélanome? Mélanome, 0,7mm Nævus pigmentaire atypique Un grand nombre de lésions trompeuses, mimant des naevus : -de Spitz -De Reed -commun (naevocytoïde, nevoid)
Traitement de référence MM stades I, II, III = chirurgie Survie 5 ans après chirurgie : - stade II : 70% - stade III : 45% - stade IV : 10% La chirurgie seule ne suffit pas
Mélanome métastatique : état des lieux 2000 Survie globale : 5% à 5 ans, soit médiane de survie 7-8 mois (tout site métastatique confondu) Pas de gros progrès thérapeutique jusqu à ASCO 2010
Années 2000 : révolution Découverte des voies de signalisation des kinases dans les cancers, mélanome 2 voies principales en cours d évaluation : - Voie 1 : RAS-RAF-MEK-ERK - Voie 2 : PI3K - AKT Curtin, NEJM, 2005
Tumeurs mélaniques : utilité des outils moléculaires Aide au diagnostic (bénin vs malin, en particulier dans les tumeurs mélaniques «ambigües») Immunohistochimie FISH CGH autre Aide pour prédire la réponse aux thérapies ciblées (mélanome métastatique) BRAF, C-KIT, NRAS Immunohistochimie, biologie moléculaire
Ex : jeune fille 12 ans, lésion 1 cm, dos du pied FISH : cellules anormales présentant gain de CCND1 et de RREB1 Tumeur de Spitz très atypique / Mélanome Spitzoïde (Breslow : 3,7mm) = ré-excision (+/- gg sentinelle?)
FISH 4 couleurs, principe V. Haddad
VYSIS Melanoma FISH Probe kit Recherche d'un lot de sondes FISH comme outil d aide au diagnostic des lésions mélanocytaires Gerami et al.: Am J Surg Pathol 2009 cibles choisies à partir des études CGH-array sur une cohorte de 186 tumeurs mélaniques ( 132 mélanomes vs. 54 naevi bénins ) (Bastian et al. 2003)
VYSIS Melanoma FISH Probe kit tests FISH appliqués sur 3 cohortes (mélanomes vs. naevi) (~ 500 cas au total) choix du lot des sondes les plus pertinentes à l'aide d'un algorithme RREB1 : 6p25 MYB : 6q23 CEP 6 CCDN1 : 11q13
VYSIS Melanoma FISH Probe kit RREB1 CEP6 CCDN1 MYB Chr.6 Chr.11
Protocole de la FISH dans les lésions mélaniques 1) Préparation des échantillons sur lame de microscopie : coupe 5 µm à partir du tissu fixé en formol (AFA, Bouin, Excell incompatibles) et inclus en paraffine 2) Pré-traitement spécifique (chimique et enzymatique) permettant aux sondes d accéder à l ADN et de diminuer le bruit de fond et l'auto-fluorescence 3) Dénaturation de la cible et de la sonde 4) Hybridation entre la cible et la sonde 5) Lavage post-hybridation et montage de la lame ( milieu de montage contenant l intercalant d ADN ) 6) Observation de la lame et analyse microscopique des signaux fluorescents
VYSIS Melanoma FISH Probe kit : exemples de résultats Noyau normal Délétion de MYB Gain de RREB1 2V / 2R / 2J / 2A 2V / 2R / 1J / 2A 2V / 3R / 2J / 2A Gain de RREB1 Gain de CCDN1 et RREB1 + délétion de MYB + délétion MYB Noyau polysomique 2V / 3R / 1J / 2A 3V / 3R / 1J / 2A 4V / 4R / 4J / 4A
Noyaux avec le profil normal 2R / 2V / 2J / 2A Image superposée CCDN1 SpectrumGreen RREB1 SpectrumRed 2 2 Contre-coloration DAPI MYB SpectrumGold CEP6 SpectrumAqua 2 2 Coupe 5μm de tissu fixé en formol inclus en paraffine
Noyaux avec les profils anormaux Image superposée CCDN1 SpectrumGreen RREB1 SpectrumRed 4 4 Contre-coloration DAPI MYB SpectrumGold CEP6 SpectrumAqua 2 4 Coupe 5μm de tissu fixé en formol inclus en paraffine
Recommandations ABBOTT Enregistrer le nombre de signaux RREB1, MYB, CEP6, CCND1 dans 30 noyaux sans chevauchement en les sélectionnant, si possible, dans 3 régions différentes de la lésion Critères de positivité : % gain CCDN1 : + si 38% % gain RREB1 / CEP6 : + si 55% % gain RREB1 : + si 29% % délétion MYB : + si 40% Désigner un échantillon comme mélanome FISH positive si au moins un des critères est satisfait. Désigner un échantillon comme mélanome FISH négative si aucun des critères n est satisfait.
Aspects pratiques de la FISH dans les mélanomes repérer avec le pathologiste sur une lame colorée les zones d intérêt (!!! lésions in situ, zones inflammatoires, différentes composantes!!! ) réaliser la FISH en suivant le protocole ( faire de petites séries 4 ou 6 au max pour respecter les temps ) évaluer la qualité des lames +++!!! la qualité des lames est cruciale pour une analyse fiable!!! les signaux doivent être brillants, distincts et facilement déterminables l arrière-plan doit apparaître sombre ou noir et relativement exempt de particules fluorescentes examiner la lésion dans sa totalité négativité vs. positivité présence de plusieurs zones «mélanome FISH positive» enregistrer le nombre de signaux pour 30 noyaux sans chevauchement
Ex : repérage Formol Importance de repérer zones à examiner FISH A «l aveugle» : pas connaissance du diagnostic
Exemple d'une feuille de comptage RREB1 MYB CCND1 Cep 6 RREB1/CEP 6 % gain % gain % loss % gain SR Sgo SGr SA per cell CCND1 RREB/CEP 6 MYB/CEP 6 RREB1 5 2 3 4 1 80,00 53,33333333 93,33333333 86,67 1 1 4 4 0 4 2 3 4 0 7 2 5 5 1 5 2 3 4 1 5 2 3 3 1 3 1 4 4 0 4 1 3 3 1 5 3 3 4 1 5 2 3 4 1 2 2 3 3 0 3 2 3 3 0 4 2 4 4 0 4 2 4 3 1 3 2 2 2 1 4 2 3 3 1 2 1 2 2 0 5 2 2 4 1 4 2 3 4 0 6 2 3 6 0 3 1 2 3 0 2 1 3 2 0 5 3 3 4 1 3 2 3 3 0 5 2 3 4 1 5 3 3 4 1 3 1 2 1 1 3 2 3 4 0 4 1 3 3 1 3 1 2 5 0
Différents seuils publiés Gérami Abbott Melanosite Kerl
FISH 4 couleurs, aide au diagnostic? (BV) Rappel : test conçu pour mélanome vs naevus Bastian et al : teste combinaisons de 2,3,4 anomalies récurrentes appliquées à 3 cohortes de patients (mélanome vs. naevus) (~ 500 cas) détermine la combinaison d anomalies chromosomiques qui a la meilleure sensibilité et spécificité pour différencier naevus et mélanome. RREB1 RREB1 : 6p25 MYB : 6q23 CEP 6 CCDN1 : 11q13 Chr.6 CEP6 MYB Chr.11 CCDN1
FISH : diagnostic mélanomes «classiques» vs naevus Etudes Rendement Sensibilité Spécificité VPP VPN 2009 Gerami et al, (USA) Am J Surg Path. 83 mélanomes et 86 naevus 2009 A.L. Morey and al. Pathology (Australie) 10 métastases de mélanome 10 mélanomes / 10 naevus 2010 Gerami et al (USA) Arch Dermatol 123 mélanomes / 110 naevus 2011 Vergier et al. Mod Path (lésions ambigües) 23 mélanomes et 21 naevus 2011 Moore and Gasparini (USA), Diagn Pathology 157 naevus, 176 naevus dysplasiques, 167 mélanomes 86,7% 95,4% 90% 95% 83% 94% 91,5% 85% 90% 89,5% 85,7% 83,8% 98% 97,9% 85% Spécificité : capacité à être négative si diagnostic anapath de naevus Sensibilité : capacité à être positive si diagnostic anapath de mélanome
FISH et Tumeurs ambigües : étude européenne 6 centres européens: inclusion de tumeurs mélaniques considérées ambigües (plutôt bénignes A- ou malignes A+) B. Vergier, Cerroni (Autriche), D. Massi (Italie), A. de la Fouchardiere (Lyon), U. Wesselmann (Allemagne), A. Karseladze (Russie) Groupe 1 Patients avec métastases régionales (stade 3) métastases à distance (stade 4). 21 Patients (23.4%) Groupe 2 Patients sans évolution avec un recul de 5 ans 69 Patients (76.6%) Relecture (triple aveugle = triple A) Diagnostic histopathologique final : considéré malin si 2 or 3 A+ (A+A+A+) ou (A+A+A-) considéré bénin si 3 A- (A-A-A-) considéré discordant (D) si 2A- et 1A+
FISH et Tumeurs ambigües : résultats FISH comparée à l évolution Histopath/ évolution Combinaison des 2 / évolution Sensibilité 43% 95% 57% Spécificité 80% 52% 89% VPP 39% 41% 57% VPN 82% 97% 89% Combinaison de la FISH et du diagnostic AP : spécificité du diagnostic anapath seul nbre faux + (patients diagnostiqués comme A+ et sans métastase / AP seule) FISH negative FISH positive p-value of 0.07
FISH 4 couleurs et Spitz 59 tumeurs de Spitz (Bordeaux) A+ ou DA+ A- ou DA- FISH + 11 2 FISH - 7 30 Ambiguë (polysomie) 3 3 Non Interprétable 1 2 Tumeurs de Spitz Sensibilité FISH / au diagnostic AP = 61% Spécificité = 94% VPP = 85% VPN = 81% Mélanome Vs Naevus Sensibilité : 85-90% Spécificité : 90-95%
FISH et tumeurs mélaniques ambigües : comment augmenter la sensibilité?? FISH : ajout de sonde + CGH : pour les cas FISH négatifs et suspect de mélanome
FISH et tumeurs mélaniques ambigües : comment augmenter la sensibilité?? B. Gammon et al. Enhanced Detection of Spitzoid Melanomas Using Fluorescence In Situ Hybridization With 9p21 as an Adjunctive Probe Am J Surg Pathol 2011 Ajouter des sondes correspondant à des anomalies retrouvées dans des tumeurs de Spitz : 43 mélanomes spitzoïdes Sensibilité FISH 4 couleurs 70% Perte 9p21 dans 11/27 (41%) des cas dont 7/11 qui étaient FISH négatifs => Sensibilité FISH + 9p21 (homozygote) = 85%
Autres outils moléculaires pour améliorer sensibilité? CGH Gaiser et al. Mod Pathol 2010 (Heidelberg, Germany) 22 cas dont 12 ambigües FISH/évolution métastatique : Sensibilité 60% et Spécificité 50% CGH : plus d anomalies chromosomiques dans lésions métastatiques (p<0.01) Ali et al (Gerami) Int J Clin Exp Pathol 2011 : FISH et CGH 8 Naevus de Spitz : 7/8 pas d anomalie et 1/8 gains 7q et 11p (validé par FISH) 1 tumeur de Spitz atypique: gain 19p 1 mélanome spitzoide : amplification 6p (FISH+), 17p et délétion 1p, 15p Raskin et al. Am J Surg Pathol 2011 16 tumeurs de Spitz (8 avec méta et 8 naevus de Spitz par CGH et FISH) 2 cas de mélanomes détectés par CGH et pas par FISH CGH: technique moins facile d utilisation que FISH et cout?? mais intérêt : détection d anomalies plus ciblées Spitz/tumeurs ambigües => mise en place d analyses FISH plus sensibles
FISH 4 couleurs : une aide au diagnostic dans les tumeurs mélaniques ambigües? Ex : confirmation mélanome simulant un naevus 33% 33% 34% Aide+ Aide +++ N'aide pas ex : Tumeur de Spitz atypique, épaisse, chez un jeune Ex : mélanome FISHou FISH ambiguë (polysomie)
Cas n 1 20D43 Femme, 33 ans, tumeur pigmentée de l épaule, 8 mm de gd axe
FISH positive : Amplification CCND1 +trisomie 6 associée dans un sous clone
Cas n 1: diagnostic Question initiale : tumeur de Spitz atypique? AP : mélanome spitzoïde > naevus Spitz FISH : amplification Cyclin D1 et trisomie 6 dans un sous-clone renforce diagnostic de mélanome (33 ans) Conclusion = mélanome spitzoïde (B=2,85mm)
Cas n 2 18B42 Homme, 41 ans, depuis 2 ans lésion pigmentée de la jambe, modification récente
FISH positive : Gain RREB1
Cas n 2 : diagnostic Question initiale : naevus composite ou mélanome simulant naevus? AP : mélanome simulant naevus > naevus composite FISH : Gain RREB1 renforce diagnostic de mélanome (41 ans, B=1,2mm)
Cas n 3 18A60 Femme, 66 ans, lésion papuleuse inflammatoire de l abdomen apparue sur cicatrice ancienne
FISH positive : Délétion de MYB
Cas n 3 : diagnostic Question initiale : mélanome simulant naevus (naevocytoide, nevoid)? AP : mélanome simulant naevus FISH : -délétion de MYB -renforce diagnostic de mélanome sur cette petite lésion mimant un naevus
Cas n 4 20C20 Homme, 63 ans, lésion de moins de 1 cm, modification récente
HMB45 Mib1
FISH positive : Gain RREB1 et Délétion MYB
Cas n 4 : diagnostic Question initiale : comment classer cette lésion? AP : mélanome simulant naevus FISH : délétion MYB et gain RREB1 renforce diagnostic de mélanome sur cette lésion mimant un naevus
Attention à la localisation des anomalies!
Cas n 5 19C19 Homme, 59 ans, naevus de grande taille, Question : naevus congénital?
FISH positive : Gain RREB1 Cellules éparses en intraépidermique
Cas n 5 : diagnostic Question initiale : naevus congénital? AP : SSM in situ sur naevus congénital? FISH : localisation gain RREB1 au niveau de la composante jonctionnelle confirme ce diagnostic
Cas 6 (S0913896) : Femme, 64 ans, mélanonychie totale
Polyploïdie (4 à 6 signaux de CCND1, RREB1,CEP6) + délétion MYB (0-2 signaux) noyau avec un profil normal noyau avec un profil anormal
Take home message Tumeur mélanique ambigüe plutôt malin histopathologie douteux plutôt bénin FISH FISH FISH Positive Négative Positive Négative Positive Négative renforce malignité ne change pas le traitement en faveur de la malignité reste douteux Attention Super! Résultat FISH à comparer tjs avec le diagnostic AP
Arbre décisionnel ambigüe Tumeur mélanique ambiguë (bénin ou malin?) Mince : intraépidermique pure ou épaisseur < 0,75 mm Epais : > 0,75 mm Pas de conséquence majeure Reprise si doute fort mélanome Bien communiquer FISH non utile (sauf cas exceptionnel) «Doute» FISH +/- CGH Consultation 2 avis «Certain» (naevus ou mélanome) FISH +/- CGH si jeune Anomalies cytogénétiques Prise en charge type mélanome Pas d anomalies Discussion Exérèse complète RCP
FISH : difficultés Techniques Ne pas mettre entre toutes les mains Bien corréler avec la morphologie : Sélection de zone Définir problématique Tableau excel pas forcément utile car si + bien visible et critères positifs Analyse longue si négatif Problème polyploïdie : signification? Ajout 9p21 : valeur si délétion homozygote
FISH : difficultés Financières Non pris en charge par CPAM sauf «accord» Cout CGH se rapproche de la FISH mais pas même information
Tumeurs mélaniques : utilité des outils moléculaires Aide au diagnostic (bénin vs malin, en particulier dans les tumeurs mélaniques «ambigües») Immunohistochimie FISH CGH autre Aide pour prédire la réponse aux thérapies ciblées (mélanome métastatique) BRAF, C-KIT, NRAS Immunohistochimie, biologie moléculaire