1 Cyril Iaconelli Doctorant Directeurs de thèse : Pr Patrick Gervais/ Pr Laurent Beney.
1 Introduction au projet F.PARIS - Un microbiote, des probiotiques - Présentation de Faecalibacterium prausnitzii - Objectif du projet F.PARIS 2 3 Production de biomasse - Schéma de production - Equipements de production et stabilisation - Des difficultés, un challenge - Optimisation des conditions de production de biomasse Stabilisation et conservation - Séchage : impact sur les organismes vivants - Mise au point d un procédé pilote de séchage - Optimisation du rendement de lyophilisation - Sensibilité de la souche au passage dans le tractus digestif 2
1 Introduction au projet F.PARIS - Un microbiote, des probiotiques - Présentation de Faecalibacterium prausnitzii - Objectif du projet F.PARIS 2 3 Production de biomasse - Schéma de production - Equipements de production et stabilisation - Des difficultés, un challenge - Optimisation des conditions de production de biomasse Stabilisation et conservation - Séchage : impact sur les organismes vivants - Mise au point d un procédé pilote de séchage - Optimisation du rendement de lyophilisation - Sensibilité de la souche au passage dans le tractus digestif 3
Surface du tractus digestif 200-300 m 2 10 14 bactéries (10x plus que de cellules humaines) 20 000 x Jusqu à1000 espèces différentes au sein d un même individu Rôles multiples : Détoxification Digestibilité de fibres Production de vitamines Prévalence à l obésité Action sur le système immunitaire Vit B9 Vit K 4
Une des bactéries les plus abondantes du colon humain Colon : 10 10 à 10 12 bactéries/g Souche strictement anaérobie et gram négative Productrice de butyrate, formate, lactate et CO 2 F.prausnitzii (et son surnageant) ont un effet anti-inflammatoire important Moins abondante chez des patients atteints par des maladies intestinales chroniques Sélectionner, produire et conserver une souche F.prausnitzii pour réduire les symptômes de patients atteints de maladies intestinales chroniques. 5 Duncan S. et al 2002 Growth requirements and fermentation products of Fusobacterium prausnitzii, and a proposal to reclassify it as Faecalibacterium prausnitzii gen. nov., comb. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 52, 2141 2146 Sokol H. et al. 2008. Faecalibacterium prausnitzii is an anti-inflammatory commensal bacterium identified by gut microbiota analysis of Crohn disease patients. Proceedings of the National Academy of Sciences 105(43):16731-16736
Étude préclinique : - Dossier Novel Food - Statut GRAS - Tests toxicologiques Optimisation des process : - Croissance - Conservation sous Sélection de la forme sèche et/ou «meilleure» souche : liquide - Effets antiinflammatoires vitalité) dans le temps - Stabilité (viabilité et - Croissance et aptitude à être stabilisée - Implantation dans la flore intestinale Production à l échelle industrielle : - Scale-up Étude clinique : - Production d un batch pour l étude - Recrutement - Management de l étude 6
Sélection des souches : - Isolation des souches - Évaluation des effets antiinflammatoires (avant et après stabilisation) - Évaluation des différents taux de croissance - Colonisation du tractus digestif - Résistance au passage dans le tractus digestif - Toxicité et dossier Novel Food : - Étude toxicologique - Production d acide gras à chaine courte - Activités enzymatiques - Resistance aux antibiotiques - Transfert de gène - Preuves cliniques - Conditions de culture et stabilisation : - Optimisation de la production de biomasse - Optimisation de sa stabilisation (forme sèche ou liquide) - Encapsulation protégeant la souche et permettant sa libération au niveau du colon - Scale-up et industrialisation : - Constitution d un milieu industriel - Optimisation du process (production et stabilisation) aux conditions industrielles - Constituition de la formule finale - 7
1 Introduction au projet F.PARIS - Un microbiote, des probiotiques - Présentation de Faecalibacterium prausnitzii - Objectif du projet F.PARIS 2 3 Production de biomasse - Schéma de production - Equipements de production et stabilisation - Des difficultés, un challenge - Optimisation des conditions de production de biomasse Stabilisation et conservation - Séchage : impact sur les organismes vivants - Mise au point d un procédé pilote de séchage - Optimisation du rendement de lyophilisation - Sensibilité de la souche au passage dans le tractus digestif 8
Préparation d une cryobanque Culture en tube (ml) Culture en Schott (~100ml) Culture en fermenteur (L) Gestion de l anaérobie Centrifugation et récolte Optimisation de la formulation Optimisation du procédé Conservation Récupération de la poudre Lyophilisation de la crème
Equipement de production : Equipement de stabilisation et de conservation : Enceinte anaérobie Lyophilisateur Lit fluidisé 10 Fermenteur 5 litres (anaerobe ready) Enceinte pilote de séchage à HR contrôlée
Anaérobie stricte Bactérie commensale du colon Reproduire en laboratoire les conditions (composition en nutriments, composition gazeuse) favorables à sa croissance Compositions gazeuse Croissance UFC.ml -1 (à 20h) N 2 (85%)-H 2 (5%)- CO 2 (10%) 1.5 10 8 N 2 (95%)-H 2 (5%) 5.6 10 7 CO 2 1 10 8 N 2 11
Composition qualitatives et quantitatives en nutriments Atmosphère gazeuses Ajout de micronutriments Volume Milieu de laboratoire 10mL Milieu industriel développé 2L DO (600nm) Inf. à 1 Sup. à 5 Dénombrement Contraintes 10 8 UFC/mL Présence de farines animales 2 10 9 UFC/mL Exempt de farines animales
1 Introduction au projet F.PARIS - Un microbiote, des probiotiques - Présentation de Faecalibacterium prausnitzii - Objectif du projet F.PARIS 2 3 Production de biomasse - Schéma de production - Equipements de production et stabilisation - Des difficultés, un challenge - Optimisation des conditions de production de biomasse Stabilisation et conservation - Séchage : impact sur les organismes vivants - Mise au point d un procédé pilote de séchage - Optimisation du rendement de lyophilisation - Sensibilité de la souche au passage dans le tractus digestif 13
RNS O. ROS Principales perturbations induites par le séchage Physiques Diminution du volume, augmentation du rapport surface volume, déformation membranaire, Changement d état (liquide verre solide), cristallisation, transitions de phase des lipides Chimiques Stress oxydant, augmentation intracellulaire en soluté, stimulation du métabolisme Cinétique de séchage, osmoprotectants, adjuvants vitrifiants, antioxydants Antioxydants, atmosphère 14
Viabilité 50% 50% 40% 40% 30% 30% 20% 20% 10% 10% 0% PBS Tréhalose Tréhalose + Proline Inuline 0% PBS Tréhalose Tréhalose + Proline Séchage en couche mince de la souche Séchage par lyophilisation 15 Mise au point d un procédé de séchage pilote permettant de sélectionner les protectants. Avantages : Rapide Simple Faible volume à produire Homogénéité avec les résultats de lyophilisation
Viabilité Viabilité Viabilité Viabilité(%) 50% 25% 60% 40% 2 C/min 1 C/min 0% LYBHI-4 C LYBHI-25 C LYBHI-37 C PBS-25 C Condition de réhydratation Condition de réhydratation 20% 0% Cinétique de congélation Trehalose(5%) Glycerol(1%) Trehalose(5%) Glycerol(1%) 4% viabilité 50% viabilité ph du milieu de lyophilisation Concentration en tréhalose 16 30% 20% 10% 0% Trehalose ph:4.85% Trehalose ph:6.410% Tréhalose + PBS 5% (1/1) 30% 20% 10% 0% 2,50% 5% 10% 20% Concentration en tréhalose
Composition des différents tampons (recommandé par la pharmacopée européenne) 30 min 37 C Estomac ph 1,8 Jéjunum proximal ph 6,4 NaCl HCl KH 2 PO 4 NaOH Pepsine Pancréatine Sels biliaires Pectinase Mortalité totale dans l estomac Témoin Jéjunum distal ph 6,8 Sensible aux sels biliaires Iléum distal ph 7,4 Côlon ph 6 0 5 Viabilité (Log 10 UFC/ml) 17 La bactérie présente une forte sensibilité à l acidité stomacale ainsi qu aux sels biliaires. La conception d une gélule gastro-résistante est indispensable.
Encapsulation Stabilisation Ingestion Production de la bactérie F.prausnitzii Conditions Colonisation dans le colon : stressante Action sur les maladies intestinales chroniques Estomac : ph 1.8 + pepsine + O 2 (Au moins 30min) Petit intestin : ph 6.4 6.8 Sels biliaires (5 10 h) Gros intestin : ph 7.2 7.4 18 18
Challenges Initialement Aujourd hui Production 10 8 CFU/mL Production de biomasse x4000 2.10 9 CFU/mL 10mL 2L Séchage Survie après séchage 0.1% Survie x600 Survie après séchage 50% Survie après stockage Aucune valeurs Survie à l état sec 4 mois à 25 C Survie après stockage 10% Préservation de la fonctionalité Tested in-vitro Modèle d'inflammation intestinal murin Fonctionalité in-vivo des bactéries sèches
L équipe de l INRA de Jouy-en-Josas : Sylvie Hudault, Sylvie Miquel, Rebeca Martin Rosique, Véronique Robert, Chantal Bridonneau, Florian Chain, Luis Bermudez, Jean- Marc Chatel, Muriel Thomas, Philippe Langella Biovitis : Tony Pouply, Laurent Rios Merck Medication Familiale : Severine Le Roy, Stéphanie Courau, Pascal Molimard Welience : Alexandre Charriau, Élise Perrette, Marie- Pierre Montaron UMR-PAM : Laurent Beney, Patrick Gervais
Merci de votre attention