24/02/16 (10-11h) ROUX Alexandra L2 CR : BOUÉ Kévin AIH Pr. Vicky MERHEJ 10 pages Anatomie, physiologie, taxonomie et génétique bactérienne Plan : A. Introduction : bactérie B. Anatomie : structure cellulaire I. La membrane cytoplasmique II. La paroi bactérienne III. La capsule bactérienne IV. Les endospores V. Les appendices bactériens externes VI. Le génome bactérien C. Physiologie : division cellulaire I. Les nutriments II. Les conditions environnementales III. Les milieux de culture D. Taxonomie bactérienne : délimitation et groupes de microorganismes E. Génétique bactérienne I. Les mutations II. Les transferts latéraux de matériel génétique A. Introduction : bactérie Les bactéries sont des êtres unicellulaires (procaryotes) dont le noyau est mal limité, inexistant, contrairement aux cellules eucaryotes. Ce sont des organismes de petite taille allant de 0,1μm à 10μm en moyenne, invisibles à l œil nu. C'est pour cette raison qu'on a commencé à définir les bactéries et à comprendre leur biologie quand on a découvert le microscope optique. Mais aujourd'hui on découvre que cette notion de petite taille n'est pas toujours valable parce qu'il existe des bactéries géantes de l'ordre de 750μm (Thiomargarita namibiensis), mais aussi des nanobactéries de l'ordre de 25 à 200 nm (Epilopiscium fishelsoni). Il existe deux formes principales de bactéries : coccis (forme ronde) et bacille (forme allongée). Les bactéries sont de morphologie très variable : vibrions, spirales, mycélium Elles peuvent se retrouver en MO soit isolées, soit regroupées selon un arrangement caractéristique en : paire (deux bactéries) tétrade (quatre bactéries) chaînette (caractéristique des Steptocoques) grappe (caractéristique des Staphylocoques) Ces éléments permettent de définir en partie la bactérie. 1/10
B. Anatomie : structure cellulaire AIH - Anatomie, physiologie, taxonomie et génétique bactérienne Les bactéries sont composées d'un cytosol entouré d'une membrane cytoplasmique, et d'une paroi. La capsule, les endospores, les flagelles, les pili (au singulier : pilus), le nucléoide, les ribosomes, les inclusions et vésicules sont des éléments bactériens qui ne sont pas présents chez toutes les bactéries. La membrane cytoplasmique est une limite mécanique, une barrière perméable sélective qui permet à la bactérie de survivre. Elle assure également les fonctions de processus métaboliques, de transport d'éléments et de chimiotactisme. La paroi assure la forme de la bactérie (cocci, bacille), elle est plus rigide et protège la bactérie. La capsule est une forme de résistance à la phagocytose et assure la faculté d adhérence des bactéries. Les endospores permettent la résistance aux milieux extrêmes. Les pili ou fimbriae permettent l' attachement aux surfaces et les processus de conjugaison bactérienne. Ce sont des appendices externes. Le flagelle assure la mobilité. Le nucléoide est le matériel génétique. Les vacuoles gazeuses, ribosomes, inclusions, sont trouvés dans le cytosol. I. La membrane cytoplasmique La membrane cytoplasmique est une limité mécanique, une barrière perméable et sélective (si tout pouvait renter, on aurait un phénomène d'osmose et de lyse), qui permet à la bactérie de survivre. Elle assure également des processus métaboliques, le transport d'éléments et le chimiotactisme. Elle sépare la bactérie de son environnement. Elle est présente chez toutes les bactéries. La membrane plasmique est une mosaïque fluide composée d'une bicouche phospholipidique semi-perméable. C'est une structure identique chez les eucaryotes mais la particularité est qu'on ne retrouve ni stérols ni lecithine chez les bactéries. 2/10
II. La paroi bactérienne AIH - Anatomie, physiologie, taxonomie et génétique bactérienne La paroi est rigide, elle enveloppe la membrane et assure la protection et l'intégrité de la bactérie en évitant les phénomènes de lyse. Elle est responsable des formes rondes (cocci), allongées (bacilles), ou mixte (coccobacille). Elle est absente des mycoplasmes. La paroi bactérienne est différente en fonction des bactéries. En particulier, la paroi sert à définir les bactéries Gram positif et Gram négative. Le composant commun aux parois est le peptidoglycane. Composition de la paroi des bactéries à Gram positif (coloration en bleu/violet au MO) : Peptidoglycane : très épais (20 à 80 nm) Acides teichoïques (charge +) Acides lipoteichoïques (charge -) Polysaccharides neutres Protéines et enzymes Composition de la paroi des bactéries à Gram négatif (coloration en rose au MO) : Peptidoglycane (3 nm, moins importante que chez les bactéries à gram+) Particularité : une membrane externe ou feuillet externe de 7 8 nm contenant le lipopolysaccharide (LPS) aussi appelé endotoxine, qui est un facteur de virulence et qui induit de très nombreuses maladies. L'espace située entre la membrane externe et la couche de peptidoglycane est appelé périplasme. La coloration de Gram permet d'observer ces bactéries au microscope optique. Elle consiste à ajouter de façon séquentielle des colorants dans un ordre bien précis en respectant des temps bien définis. Cette coloration est composée de plusieurs étapes : Coloration au cristal violet (aniline) colore toutes les bactéries en violet, quelle soit Gram+ ou Gram- Insolubilisation au lugol (iode) Décoloration à l'alcool/acétone décoloration des bactéries Gram- uniquement, car la couche plus importante de peptidoglycannes dans la paroi des bactéries Gram+ les rend plus résistances à cette décoloration par l'alcool. Recoloration à la fushine/safranine coloration des bactéries Gram- en rose, et les bactéries Gram+ restent colorées en violet Lecture au microscope optique (x1000) Donc : Bactéries Gram+ : bleu/violet Bactéries Gram- : rose Une autre propriété très importante de la paroi bactérienne est sa perméabilité aux antibiotique. Ainsi, les antibiotiques s'attaquant à la synthèse du peptidoglycane empêche la formation de la paroi des bactéries, ce qui entraînera la lyse de la bactérie (antibiotiques bactéricides), car la paroi assure l'intégrité de la bactérie. Par exemple, la pénicilline est un antibiotique de la famille des β-lactamines qui ont cette propriété. Chez les mycobactéries, dans la paroi, le peptidoglycane est accompagné de cires (acides mycoliques et arabinogalactanes). Ces cires sont résistantes à l'environnement acide et alcoolique et sont peu perméables, les colorants de Gram ne passent pas, on utilise donc une autre coloration : la coloration de Ziehl-Nielsen. 3/10
III. La capsule bactérienne AIH - Anatomie, physiologie, taxonomie et génétique bactérienne La capsule est en fait un réseau de polysaccharides structuré et dense appelé glycocalyx. Elle n'existe pas chez toutes les bactéries, et elle est inconstante dans une même souche de bactérie. Cette structure n'est donc pas importante pour la survie de la bactérie, en revanche elle joue un rôle dans la virulence. Si la capsule est présente dans une colonie bactérienne, la culture bactérienne prend un aspect muqueux, lisse et brillant sur le gel. Au contraire, lorsqu'il n'y a pas de capsule, la colonie a un aspect ruguex. Pour mettre en évidence la capsule, on peut réaliser une coloration particulière à l'encre de Chine : la bactérie se colore en blanc, et la capsule en noir. Au microscope électronique, les bactéries apparaissent noires entourées d'un halo blanc. On peut utiliser l'encre de Chine en urgence sur un échantillon de LCR en cas de suspicion d'une méningite. On peut aussi utiliser des anticorps anti-capsules. En effet les capsules sont des antigènes qui peuvent être utilisées pour le phénotypage des bactéries ou l'élaboration de vaccins. La capsule assure une protection de la bactérie contre les conditions de l'environnement, et notammenet à la dessiccation (milieu sec). Si les conditions de l'environnement sont favorables, la capsule peut disparaître, elle est réversible. De plus, elle joue un rôle dans la virulence, en favorisant l'apparition de certaines maladies, dans l'adhésion aux muqueuses, grâce à sa riche en polysaccharides, et dans la résistance aux défenses de l'hôte (notamment à la phagocytose), par exemple, c'est le cas de Streptococcus pneumoniae (pneumocoque). IV. Les endospores Les endospores sont des structures reproductives très résistantes à l'environnement : chaleur, UV, désinfectant, froid, dessiccation, vide... Ils ermettent donc la survie en milieu extrême. Les endospores sont une structure qui déforme la bactérie. Ils sont visibles en microscopie optique avec le bleu de méthylène. A la coloration de Gram, ils correspondent à des zones incolores à l'intérieur des bactéries ou un peu bombées. Les spores peuvent être non déformante (donc non observable au MO). Toutes les bactéries ne font pas de spores. On parle de bactéries sporulées lorsqu'elles en font. Il y a un problème majeur lorsqu'il s'agit de la stérilisation des prélèvements, qui se s'effectue principalement grâce à des températures élevées (autoclave.). C'est le cas pour certaines espèces qui sont dangereusement pathogènes comme Baccilus anthracis qui provoque la maladie de charbon, entraînant des amputations. 4/10
V. Les appendices bactériens externes AIH - Anatomie, physiologie, taxonomie et génétique bactérienne Les appendices bactériens externes sont fixés aux membranes et à la paroi bactériennes, ils ne sont jamais essentiels et sont donc inconstants, comme les endospores et la capsule. a) Les flagelles Les flagelles assurent la mobilité de la bactérie, sont visibles en microscopie optique après coloration. Ils sont longs et forment de fins filaments de 20 nm de diamètre pour 15 à 20 µm de long. Ils sont composés essentiellement d'une protéine qui est la flagelline. C'est aussi un facteur antigénique, on peut donc utilisés des anticorps anti-flagelline dans les vaccins. b) Les pilis Il y a deux grands types de pilis : Les pili sexuels sont présents sur certaines bactéries et permettent de faire passer une information, de la bactérie «mâle» vers la bactérie «femelle». Les pili classiques (fimbriae) : nombreux sur les bactéries à Gram négative Mobilité saccadée (P. aeruginosa, N. gonorhoeae, E. coli) : les infections urinaires causées par E. coli sont due à leurs pili qui leur permettent de remonter les voies urinaires. Mobilité par glissement (myxococcales) Adhésion sur un support solide (colonisation) VI. Le génome bactérien Le génome bactérien est le support de l'information génétique. On distingue deux structures : le chromosome bactérien (constant) et les plasmides (inconstants) a) Le chromosome bactérien Le chromosome bactérien est en général unique et circulaire. Il est visible en microscopie électronique. L'ADN bicaténaire forme un nucléoïde, il s'agit du chromosome super-enroulé, associé à des protéines, de l'arn et des enzymes, donc le chromosome avec les outils de transcription et réplication. Il est constant. b) Les plasmides Les plasmides sont le plus souvent circulaires (parfois linéaires), avec une taille réduite. C'est l'adn extrachromosomique. Sa réplication est autonome. Il n'est pas indispensable à la survie de la bactérienne. Il peut être en nombre élevé de copies ou en copies limitées (le nombre de copies est contrôlé par la bactérie). Une bactérie ne peut pas comporter deux plasmides similaires (incompatibilité). C'est un élément inconstant. 5/10
Leurs fonctions sont particulièrement intéressantes en clinique. Ils sont porteurs de gènes de virulence qui codent pour la résistance aux antibiotiques, pour des toxines, des pili sexuels Une bactérie qui a un plasmide a des capacités de résistance à son environnement. C'est donc généralement d'un mauvais pronostic. Ils sont très utiles en microbiologie pour l'étude génétique car on peut les utiliser pour faire du clonage, des transferts de gènes On utilise généralement le plasmide d'e.coli dans lequel on insère des gènes, puis on le transfecte dans la bactérie. C. Physiologie : division cellulaire Les bactéries se divisent en 3 phases : phase C : réplication chromosomique avec synthèse d'adn, la molécule mère donne 2 molécules filles. phase G : phase de latence ou ségrégation/séparation des chromosomes phase D : division, la bactérie mère donne 2 bactéries filles La croissance des bactéries est exponentielle. Pour croître la bactérie a besoin de nutriments. Le temps de dédoublement peut varier d'une bactérie à l'autre. Exemple : la population d'e.coli dédouble en 20min, tandis que les mycobactéries dédoublent en plusieurs heures. Plusieurs conditions de croissance sont nécessaires à la multiplication des bactéries : nutriments (oses, acides aminés...), conditions environnementales (température, ph, pression osmotique, pression partielle en oxygène). Ces conditions dépendent des bactéries et cela permet de définir des milieux et conditions de culture indispensables à connaître en laboratoire en fonction des bactéries étudiées. I. Les nutriments Ils sont directement assimilables et nécessaires à l'entretien et la croissance. Les besoins élémentaires sont : C, H, O, N, S, P, Fe, Ca, Mg, K Les bactéries hétérotrophes nécessitent du carbone organique. Les bactéries autotrophes et lithotrophes utilisent directement les composés minéraux (CO 2...) Les besoins spécifiques de certaines bactéries (facteurs de croissance) : Les bactéries auxotrophes ont besoins d'apport extérieur de vitamines, acides aminés, fer Les bactéries prototrophes n'ont pas de besoins spécifiques Les besoins énergétiques (utilisation du glucose le plus souvent) : Les bactéries chémotrophes utilisent l'oxydoréduction, métabolisme aérobie Les bactéries phototrophes utilisent la photosynthèse, métabolisme anaérobie II. Les condition environnementales a) La température Les bactéries thermophiles vivent à des températures > 40 C Les bactéries mésophiles vivent à des températures comprises entre 20 et 40 C (pathogènes pour l'homme, ce sont les bactéries que l'on retrouve en médecine) Les bactéries psychrophiles vivent à des températures < 20 C 6/10
Les bactéries cryophiles vivent à des températures aux alentours de 4 C (ex : Listeria monocytogenes se développe même dans les aliments placés au frigo, les individus sensibles à cette bactérie sont les femmes enceintes et les personnes immunodéprimées) Quand on veut détruire des bactéries on utilise la température d'inactivation des bactéries : c'est la stérilisation. Il existe plusieurs méthodes de stérilisation : Ébullition (inefficace sur les bactéries avec endospores) Autoclavage (121 C à forte pression, pendant plus de 20 minutes) Pasteurisation (71,7 C pendant 15 secondes) UHT : (lait soumis à +135 C pendant 2 à 5 secondes) Flamme (bec bunsen) b) Le ph Le ph optimum est en général neutre ou légèrement alcalin les plus souvent (ph de 7,5) Les bactéries acidophiles vivent dans des milieux acides (yaourts ) Les bactéries alcalinophiles vivent dans des milieux alcalins (vibrion cholérique ) c) La pression osmotique La pression osmotique correspond à la tolérance aux sels : Les bactéries halophiles vivent en milieux hypertoniques, riches en NaCl Les bactéries hyperhalophiles vivent en milieux très riches en NaCl (ex : staphylococus aureus) d) La pression partielle en oxygène Les bactéries qui supportent l'oxygène peuvent posséder une enzyme appelée la super oxyde dismutase SOD (détruit l'effet néfaste de l'oxygène). Si elles n ont pas cette enzyme, les bactéries sont dites anaérobie stricte. Elles peuvent être détruites par exemple lors du prélèvement, il faut donc y être vigilant. Comportement des bactéries face à l'oxygène : L'oxygène peut être nécessaire à la bactérie : aérobie stricte. L'oxygène peut ne pas être nécessaire : anaérobie facultative. L'oxygène peut ne pas avoir de toxicité pour les bactéries : aérobies aéro-anaérobies facultatives anaérobies possédant une superoxyde dismutase (SOD) (aérotolérantes) L'oxygène peut avoir une toxicité pour les bactéries : anaérobies strictes (sans SOD) microaérophiles Le comportement des bactéries face à l'oxygène dépend de leur métabolisme. Une bactérie aérobie fait de la respiration. Une bactérie anaérobie fait de la fermentation. Si je place mes bactéries dans un milieu nutritif et dans un environnement adéquat, j'observerai au bout d'un temps variable (dépendant du temps de dédoublement de la bactérie) des colonies. Une colonie contient au minimum 10 6 bactéries. Une colonie jaune se forme lorsque c'est un S.aureus. 7/10
III. Milieux de culture Un milieu de culture peut être un milieu liquide ou un milieu solide. Ce sont : Des milieux d'enrichissement Des milieux d'isolement : le but des milieux d'isolement c'est d'isoler les colonies. Ils peuvent être non sélectifs (ex : gélose de sang) ou sélectifs (ex : milieu Chapman, riche en NaCl, qui est sélectif des S.aureus car ils sont hyperhalophiles). On peut également avoir des conditions respiratoires particulières pour identifier des bactéries aérobies/anaérobies. Des milieux d identification : Drigalski (sels biliaires + cristal violet + lactose + indicateur de ph) : identification de Salmonella Milieu de Chapman (hypersalé) Exemle du milieu Drigalski : Une personne qui a des diarrhées, dans son prélèvement on identifie des E.Coli, ce qui est normal car ce sont des bactéries commensales, mais également des colonies vertes de Salmonella pathologiques. D. Taxonomie bactérienne : délimitation de groupes de micro-organismes Actuellement, le génome bactérien sert de base à la taxonomie bactérienne. La taxonomie est la «délimitation de groupes de micro-organismes». Elle permet de donner des noms aux bactéries, de les regrouper. La plupart des noms sont en latin. Exemple : genre (Streptococcus) + espèce (pneumonia) = streptococcus pneumonia Il y a deux types de taxonomie : La taxonomie phénotypique Caractères culturaux (streptocoques en chaîne, staphylocoques en grappe ) Caractères microscopiques (Gram+/- ) Métabolisme : recherche d'enzymes, assimilation ou fermentation de sucres, recherche de métabolites intermédiaires La taxonomie génotypique : elle s'appuie sur l'adn de la bactérie. Par convention, deux individus, pour appartenir à deux espèces différentes doivent avoir un génome différent à au moins 70% Elle peut se faire par séquençage des gènes, comme le gène 16s qui permet de séparer les bactéries en groupes de micro-organismes par PCR, suivi d'un séquençage automatisé. E. Génétique bactérienne Le génome bactérien est définie par sa séquence d'adn et son pourcentage en GC (GC%). Il possède une origine unique de réplication (ori) et est capable d'auto-réplication. Le génome bactérien a ses propres éléments de traduction au niveau du nucléoïde. Dans ce génome les gènes sont organisés sous forme d îlot ou regroupement de gènes de fonctions apparentées. Les gènes sont orientés dans le sens de la réplication pour les gènes les plus transcrits. Les variations génétiques qui interviennent dans le génome bactérien peuvent être de deux types : par mutation ou par transfert latéral de matériel génétique. 8/10
I. Les mutations Les mutations sont spontanées ou provoquées par un agent mutagène. Il y a des agent physiques (rayon X, UV ) et chimiques (agents intercalant) appelés agents mutagènes qui provoquent des mutations héréditaires (stables), brusques (discontinues), ou rares (sauf cas de résistance aux antibiotiques qui sont fréquentes) et indépendantes des caractères de la bactérie. La probabilité pour une bactérie de subir deux mutations simultanément est le produit des probabilités individuelles de ces mutations. A l'échelle moléculaire les modifications peuvent être : La perte L'addition Le remplacement S'il s'agit d'une base on parle de mutation ponctuelle, s'il s'agit d'une séquence de bases, on parle de remaniement génomique. Les mutations ponctuelles peuvent être des accidents de copie survenus au cours de la réplication de l'adn, du remaniement ou de la réparation de L'ADN. Les différents types de mutation sont : Substitution Délétion Insertion Inversion II. Les transferts latéraux de matériel génétique C'est le transfert d'une information génétique dans une bactérie, sous la forme d'un fragment d'adn d'une autre origine que celle-ci, on parle de transfert horizontal. On distingue 4 mécanismes : la transformation, la conjugaison, la transduction et la transposition. a) La transformation Il s'agit d'un transfert en solution. L'ADN est libérée dans le milieu par la lyse d'une bactérie donatrice, puis il se fixe à la bactérie réceptrice (il faut néanmoins que la bactérie soit en état de compétence). La bactérie réceptrice va alors intégrer l'adn (exogénote) à son génome par recombinaison homologue. C'est Griffith qui a montré ça pour la première fois en 1928. Il injecte des pneumocoques (Streptococcus pneumoniae) capsulés à une souris, ce qui entraîne la mort de celle-ci. Il montre que s'il détruit les pneumocoques avant de l'injecter il ne se passe rien. Avec deux pneumocoques non capsulés, donc non pathogènes, il ne se passe rien non plus. Dans la dernière expérience, il mélange en solution un pneumocoque non capsulé et vivant et un pneumocoque capsulé mais tué préalablement. Il l'injecte à la souris, puis elle meurt. Il isole ensuite des organes de pneumocoques capsulés. L'ADN de la souche capsulé morte a été acquis par la souche non capsulée encore vivante, devenant ainsi capsulée et donc pathogène. 9/10
b) La conjugaison Il faut un contact entre deux bactéries de sexe différent. La «femelle» est la bactérie réceptrice et le «mâle» et la cellule donatrice qui possède un pilus sexuel. Il s'établit un pont entre les deux bactéries, ce qui permet le transfert unidirectionnel du plasmide de la cellule donatrice vers la bactérie réceptrice. L'ADN sera ensuite intégré dans le génome de la bactérie. C'est un transfert sexué, qui se fait sous la dépendance de facteurs sexuels, le facteur F, qui permet le codage du pilus. L'ADN du plasmide qui gagne la bactérie réceptrice peut contenir un gène qui code pour le pilus sexuel. Elle change alors de sexe, devient «mâle», et capable de transférer son ADN à d'autres bactéries. Elle peut aussi transmettre des gènes de virulence. Ces transferts se font la plupart du temps au sein d'une même espèce mais aussi entre des bactéries d'espèces différentes voire de genres différents. C'est un mécanisme très important et notamment dans l'acquisition de résistance aux antibiotiques. Sur le plasmide transféré, on peut avoir la résistance à plusieurs antibiotiques différents. A l'hôpital, on peut entrer, être mis sous antibiotiques et tout à coup avoir des infections à des bactéries résistantes (les souches résistantes peuvent passer d'un patient à l'autre et les bactéries du patient peuvent devenir résistantes). c) La transduction C'est un transfert d'adn par l'intermédiaire d'un bactériophage (virus infectant des bactéries). Les bactériophages entrent dans une bactérie via un récepteur, récupèrent certains gènes, sortent de la bactérie, puis vont aller incorporer l'adn volé dans une autre bactérie. On retrouve donc de nouveau le système bactéries donatrice/réceptrice. Le phage s'accroche à la surface de la bactérie, injecte de l'adn grâce à un tube. Le phage s'intègre au génome de la bactérie. Les bactéries d'une même espèce peuvent donc avoir des pathogénicités particulières, acquises par l'infection du phage. Ce sont très souvent des toxines. Il peut aussi y avoir des transferts de gènes situés à proximité du gène. Ce phénomène est d'une importance capitale dans l'acquisition des toxines (botuliques, diphtériques, gigatoxines, E.Coli se transmettent principalement par transduction). d) La transposition C'est l'intégration directe d'une séquence d'adn au sein d'un génome (chromosomique ou plasmidique) en l'absence d'homologie de séquence nucléotidique, c'est donc une recombinaison illégitime, et non pas une recombinaison homologue. Les gènes sont transposables et s'organisent en structures appelées transposons. e) Conclusion Le chromosome bactérien augmente de taille en acquérant des gènes par le transfert horizontal en subissant des phénomènes de transformation, transduction, conjugaison et transposition, et il diminue de taille en subissant des mutations, délétions, et réarrangements génomiques. On parle de plasticité du génome bactérien. 10/10