1.1.3 Fonctions biologiques des protéines

1.1.3 Fonctions biologiques des protéines 1. Protéines globulaires: Ces protéines, solubles dans l eau, possèdent une forme sphérique et compacte avec des cavités et des protubérances sur leur surface. D autres biomolécules peuvent s insérer dans les cavités et se fixer aux protubérances par un mécanisme semblable à celui d une clé et d une serrure. Par leurs motifs de surface, les protéines globulaires interagissent de façon spécifique avec d autres molécules. (D après A. Manz,. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 36 Exemples: (i) enzymes- catalyseurs de réactions biologiques (ii) anticorps- reconnaissance moléculaire (iii) éléments de transportation et d entreposage (iv) hormones- messagers chimiques 2. Protéines fibreuses: Ces protéines, insolubles dans l eau et de forme allongée, possèdent une force élastique et une stabilité mécanique élevée. Elles apportent un support structural aux tissus. Exemples: le collagène (peau, os, dents et tendons) et la kératine (cheveux, ongles) 37

1.2 Acides ucléiques Les acides nucléiques sont des macromolécules biologiques (masses moléculaires allant jusqu à plusieurs millions de Daltons) impliqués dans la conservation, transmission et expression de l information génétique. Les deux types d acides nucléiques: - l acide désoxyribonucléique (AD) - l acide ribonucléique (AR) L AD est la molécule d hérédité responsable de la conservation du code génétique, tandis que l AR transcrit et traduit cet information génétique lors de la synthèse des diverses protéines d une cellule. 38 1.2.1 Structure des acides nucléiques L AD et l AR sont constitués de nucléotides, reliés entre eux par un lien phosphodiester. Un nucléotide est constitué de: -unebase hétérocyclique -un monosaccharide -un acide phosphorique base hétérocyclique P C 2 4' 1' 3' 2' AD: 2-désoxy-D-ribose P C 2 4' 1' 3' 2' liaison β-glycosidique AR: D-ribose 39

Structures des bases hétérocycliques purine 2 Adénine (A) 2 Guanine (G) 2 3 C pyrimidine Cytosine (C) Thymine (T) Uracile (U) 40 Structures des nucléosides 2 2 C 2 Adénine C 2 2 -Désoxyadénosine Adénosine C 2 2 Guanine C 2 2 2 -Désoxyguanosine Guanosine 41

2 Cytosine 2 C 2 C 2 2 -Désoxycytidine Cytidine 3 C Thymine Uracile C 2 C 2 2 -Désoxythymidine Uridine 42 Comparaison des nucléotides de l AD et AR AD AR ucléobases Purines Pyrimidines Adénine Guanine Thymine Cytosine Adénine Guanine Uracile Cytosine Monosaccharides 2-désoxy-Dribose D-ribose Phosphate monophosphate monophosphate 43

omenclature des principaux nucléotides Base Acide desoxyribonucléique Acide ribonucléique Code Adénine Désoxyadénosine-5 - phosphate (damp) Adénosine-5 - phosphate (AMP) A Guanine Désoxyguanosine-5 - phosphate (dgmp) Guanosine-5 - phosphate (GMP) G Cytosine Désoxycytidine-5 - phosphate (dcmp) Cytidine-5 -phosphate (CMP) C Thymine Désoxythymidine-5 - phosphate (dtmp) - T Uracile - Uridine-5 -phosphate (UMP) U 44 1.2.2 Structure de l acide désoxyribonucléique 1. Structure primaire: La séquence des bases de la chaîne d AD définit sa structure primaire. La séquence des bases est établie en utilisant des techniques basées sur des hydrolyses enzymatiques sélectives. Formation d une liaison phosphodiester 3 5 entre 2 nucléotides: 2 P C 2 3' désoxyadénosine- -phosphate 2 + 2 P C 2 3' désoxythymidine- -phosphate - 2 0 2 P C 2 3' P 2 C 3' dinucléotide A-T 45

extrémité 2 5 A - P C 2 2 P - 3' 3 C T P C 2-3' G P C 2 2-2 3' P C 2-3' A T G C C 3' 3' 3' 3' ATGC extrémité 3 46 2. Structure secondaire: La structure secondaire de l AD est représentée par le modèle en double hélice à rotation droite proposé par Watson et Crick en 1953. Deux chaînes anti-parallèles d acides nucléiques sont liées l une à l autre par des ponts hydrogène entre les paires de bases situées sur les brins opposés. Sillon majeur 12 Å de large Sillon mineur 6 Å de large ~20 Å 3 5 Squelette de glucides et de phosphates Les caractéristiques de l hélice régulière: - environ 10 paires de bases par tour complet - pas de l hélice est de 34 Å - diamètre extérieur est de 24 Å 3 5 Paires de bases 47

(D après G. Solomons & C. Fryhle, Chimie organique, 7é éd., Modulo, 2000) 48 Règles de complémentarité Pour des raisons stériques, l appariement des bases par des ponts hydrogène intermoléculaires ne se produit que d une certaine façon: - Adénine (A) avec thymine (T) - Cytosine (C) avec guanine (G) 3 C Thymine Adénine Cytosine Guanine Dû à l appariement spécifique des bases (A-T et C-G), la séquence des bases des deux brins de l hélice est complémentaire. 49

C1 C1 (D après G. Solomons & C. Fryhle, Chimie organique, 7é éd., Modulo, 2000) C1 C1 50 1.2.3 Propriétés physico-chimiques de l AD Si on chauffe une solution d AD, à une certaine température, les ponts d hydrogène qui assurent la cohésion des deux brins appariés se rompent et les deux brins se séparent. L AD est dénaturé. n parle de la dénaturation de l AD caractérisée par la température de dénaturation (ou T d ). La température de dénaturation varie selon l AD étudié. Elle augmente lorsque le % des bases G et C augmente (3 ponts hydrogène). La dénaturation de l AD s accompagne de modifications physico-chimiques: - augmentation de l absorption UV-vis - diminution de la viscosité - augmentation de la densité. (D après A.W. Peterson, thèse de doctorat, Boston University, 2003) 51

1.2.4 Structure de l acide ribonucléique Comme l AD, l AR est constitué de nucléotides reliés entre eux par une liaison phosphodiester 3 5. Comparé à l AD, on retrouve dans l AR le ribose comme glucide (vs. le désoxyribose) et l uracile (U) comme base (au lieu de la thymine). Dû au groupement du ribose, il y a une contrainte stérique trop grande pour la formation d une structure à double brins. L AR existe donc en chaînes individuelles. Une chaîne d AR peut se replier pour former des boucles et des hélices via l appariement intramoléculaire des bases (A-U et C- G) dans certaines régions du brin. 3' G G G U G G G A C C C C U U C U C G U C C U G G G G U C 52 1.2.5 Synthèse biologique des protéines Étapes générales: transcription traduction AD AR protéine 1 ère étape: Le double hélice d AD se déroule et dans le processus de «transcription», le code génétique est transcrit en une chaîne complémentaire d AR, appelé AR messager (ou ARm). L ARm est synthétisé le long d une partie cruciale d un des deux brins d AD exposé par appariement des ribonucléotides avec les bases d AD. Les ribonucléotides du ARm sont enchaînés par l enzyme AR-polymérase. Après avoir été synthétisé dans le noyau de la cellule, l ARm migre vers le cytoplasme où il sert de matrice pour la synthèse de protéines dans les ribosomes. 53

(D après G. Solomons & C. Fryhle, Chimie organique, 7é éd., Modulo, 2000) 54 2 è étape: l AR de transfert (ARt) assure le transport des acides α- aminés à des endroits spécifiques de l ARm se trouvant sur le ribosome. La séquence d un groupe de 3 bases de l ARm détermine quel acide aminé doit être ajouté au peptide croissant. Ce processus est appelé «traduction». Avant même qu elle soit terminée, la chaîne polypeptidique commence à acquérir ses structures secondaire et tertiaire. En suite, la chaîne entière se replie et des enzymes mettent en place des liens disulfures. (D après J.W. ill & D.K. Kolb, Chemistry for Changing Times, 10è éd., 2004) 55

Code génétique de l ARm (D après G. Solomons & C. Fryhle, Chimie organique, 7é éd., Modulo, 2000) 56 Exemple 1.4: Transcription et traduction d une séquence génétique C (D après A. Manz,. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 57

1.3 Limitations de la chimie analytique classique pour l analyse des biomolécules L analyse des acides nucléiques peut être divisée dans les étapes suivantes: (i) isolation et purification de l AD (ii) quantification et amplification (iii) séquençage des bases L analyse des peptides et protéines peut être divisée dans les étapes suivantes: (i) isolation et purification (ii) quantification (iii) détermination de la masse molaire (iv) séquençage des acides aminés 58 Limitations de méthodes analytiques classiques pour l analyse des biomolécules: Méthodes de séparation: chromatographie gazeuse (GC) et chromatographie liquide (LC). La GC nécessite que l analyte soit volatile et thermiquement stable, des propriétés qui sont rarement associées avec les acides nucléiques, polypeptides et protéines. Spectrométrie de masse: Les biomolécules ayant des masses élevées sont fortement fragmentées par les méthodes conventionnelles d ionisation, rendant l analyse de leurs masses moléculaires impossible. Méthodes spectroscopiques: Le grand nombre de noyaux possédant des spins, surtout des protons, dans une seule molécule d AD ou de protéine donne lieu à un nombre énorme de signaux; ceci rend l élucidation structurale difficile ou impossible. Le grand nombre de fonctions chimiques et de chromophores retrouvé dans les acides nucléiques et protéines rend leur identification impossible par la spectroscopie d absorption et la spectroscopie infrarouge. 59

Comparaison des méthodes analytiques classiques et des méthodes bioanalytiques (D après A. Manz,. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 60