RL: Anna Radzik Cours : 10/01/09 Transfert de gènes chez les procaryotes.

RT: Mathieu Battelier Pr Claire Poyart RL: Anna Radzik Cours : 10/01/09 Transfert de gènes chez les procaryotes. Rappel sur la phylogénie bactérienne : Sur la base d un certain nombre de gènes, et notamment des gènes de ménage (très conservés), il est possible de classer les bactéries (classement phylogénétique), on utilise un opéron qui code pour l ensemble des ARN ribosomaux et plus particulièrement l ARN 16S pour effectuer ce classement. L analyse des séquences a permis de faire une phylogénie des différentes espèces bactériennes. On différencie aussi les bactéries d une façon phénotypique simple par la coloration de Gram. On distingue les bactéries à Gram positif (G+) et les bactéries à Gram négatif (G-), qui se différencient par la structure de leur paroi: _ Les bactéries G+ ont une paroi avec un peptidoglycane qui est très épais _ Les bactéries G- ont une paroi avec un peptidoglycane très fin et surtout une membrane externe. On peut distinguer les Bactéries G+ en fonction de leur contenu en GC : _ BAS GC%, bactéries d intérêt médical avec : le staphylocoque, l entérocoque, le streptocoque de type B, L. monocytogenese, B. subtilis, les mycoplasmes (qui n ont pas de peptidoglycane et pas de paroi). _ HAUT GC% (55-60%) : M. tuberculosis, C. diphtériae, les streptomycètes (pas pathogènes mais principaux producteurs d antibiotiques). Chez les Bactéries à G-, on distingue : _ Entérobactéries, avec E. Coli, Salmonelle, Y. pestis (agent de la peste) _ Les Hémophiles, avec H. influenzae, N. gonorrhoae (le gonocoque est très proche (du point de vue des ARN 16S) du méningocoque), des bacilles non fermentaires (bactéries que l on trouve dans l environnement, elles sont multi-résistantes et elles constituent le principal agent d infections nosocomiales). _ Hélicobacterpylori, phylogénétiquement proche des bactéries à G+, ce qui va permettre des transferts de gènes à partir de bactéries à G+ vers les souches d H. pylori (agent de l ulcère gastrique) ou C. Coli (agent de diarrhée infectieuse). On a essentiellement étudié la résistance aux antibiotiques pour analyser les transferts de gènes, et comprendre comment une bactérie peut devenir résistante à un antibiotique lorsqu elle est soumise à une pression sélective et d où vient cette résistance. Un certain nombre de gènes de résistance qui sont initialement présents et qui ont été décrits chez les bactéries à G+ vont conférer une résistance à des G-, ce sont des gènes de résistance acquis. Exemple: _ alpha3, gène de résistance à la kanamycine, que l on va retrouver, alors qu il est spécifique des bactéries à G+, chez C. Coli ou H. pylori. _ De même, ermb qui confère la résistance à l erythromycine (macrolide principalement actif chez les bactéries G+), est présent chez des entérobactéries, notamment K pneumoniae, et chez E. Coli. _ Les gènes tetm qui confèrent la résistance à la tétracycline, présents chez les bactéries à G+ se trouvent également chez H. influenzae et chez le gonocoque. Les barrières d espèce limitent les transferts de gènes entre les bactéries mais 1

on retrouve quand même une mixité des gènes de résistance chez tous les procaryotes. On voit apparaître de nouvelles souches de bactéries avec de nouvelles résistances du fait de la pression sélective exercée par l excès de prescription des antibiotiques. On observe également des transferts horizontaux de gènes de virulence qui sont plus difficiles à mettre en évidence puisqu'on n'a pas de marqueur phénotypique de la virulence excepté la découverte d'une souche particulière qui devient pathogène. Evolution de la résistance acquise aux antibiotiques On observe 3 grands mécanismes : - Modification quantitative du génome bactérien, : sous une pression de sélection, on sélectionne des mutations qui confèrent à la bactérie la résistance aux antibiotiques donnés. - Modification qualitative du génome bactérien,: acquisition de nouveaux gènes par transfert d information génétique. Modification quantitative et qualitative du génome bactérien, : les gènes transférés vont subir des mutations par pression de sélection. Epidémiologie de la résistance aux antibiotiques On cherche à étudier ces transferts d information et à les recréer in vitro et in vivo. Lors de la découverte d une nouvelle résistance, on cherche à découvrir l élément génétique qui la véhicule (analyse statique) et à reproduire ces transferts (analyse dynamique). Expression hétérologue On a vu précédemment que les transferts se faisaient à partir de bactéries G+ en direction de bactéries G- et non l inverse. Ceci est dû au fait que -Les promoteurs des bactéries à Gram positif à bas GC % sont généralement actifs chez les bactéries à Gram négatif, alors que l inverse est rarement vrai. Le contenu en GC ne permet pas l expression et la traduction des gènes de bactéries G- chez les bactéries G+. -Les sites de fixation du ribosome (RBS) des bactéries à Gram positif à bas GC % sont fonctionnels chez les bactéries à Gram négatif alors que l inverse est rarement vrai. En résumé: - Les gènes de résistance des bactéries G+ à bas GC% peuvent parfaitement s exprimer chez les bactéries G- - Les gènes de résistance des bactéries G- ne peuvent pas s exprimer chez les bactéries G+ après transfert. - Les gènes de résistance des bactéries G+ à haut GC% ne peuvent être exprimés par les bactéries G+ à bas GC%. En revanche, l expression des gènes de résistance des bactéries G+ à bas GC% est possible chez les bactéries G+ à haut GC%. - Il peut y avoir des transferts de gènes entre G+ haut GC% et G- (dans les deux sens), mais cela reste plutôt hypothétique. Tous les transferts de gènes retrouvés sont des transferts horizontaux des G+ vers les G-. Ceci est important dans la pratique chez les bactéries multi-résistantes, notamment chez les Coli, qui synthétisent des beta-lactamases à spectre étendu qui vont hydrolyser les céphalosporines de 3eme génération actives chez les G+. Si ces β- lactamases étaient présentes chez les G+, on aurait des souches de méningocoques et de pneumocoques pour lesquelles on n'aurait plus de traitement. Pour l instant, 2

l implication des transferts de gènes est limitée, la plupart des gènes de résistance sont chez les G- et on ne les trouve pas chez les G+. Les transferts d information génétique Il y a 3 grands mécanismes de transfert de l information génétique qui dépendent de vecteurs différents. La Transduction, dont le vecteur est un phage (bactériophage). Le spectre d hôte est restreint (le phage a une spécificité d hôte), le transfert se fait intra-espèce. L efficacité de transfert est très importante et la distribution est ubiquitaire, c est à dire qu il y a des bactériophages pour la quasi-totalité des différentes espèces bactériennes. La Transformation. Le vecteur est l ADN, les bactéries sont capables, par des mécanismes particuliers, d incorporer au sein de leur cytoplasme de l ADN environnemental. Le transfert est intra ou inter-espèces proches : l ADN doit pouvoir s intégrer donc il faut que les bactéries soient phylogénétiquement proches. L efficacité est très importante (si la bactérie est compétente), cependant seulement quelques espèces bactériennes sont capables d acquérir de l ADN par ce mécanisme. La Conjugaison bactérienne, mécanisme le plus fréquent. Le vecteur est un plasmide (molécule d ADN circulaire extra-chromosomique parfois intégrée), le spectre d hôte peut être beaucoup plus grand, l efficacité est variable et la distribution est ubiquitaire. I-LA TRANSDUCTION La Transduction _ Définition : Transfert d'adn bactérien d'une bactérie à une autre par l'intermédiaire d'un bactériophage. _ Les bactériophages sont dits «transducteurs». _ Particules transductrices : les particules phagiques qui contiennent de l'adn bactérien.( soit elles ont remplacé leur ADN viral par de l ADN bactérien, soit elles ont mélangé les deux) _ Processus essentiellement intra-espèce, au sein d'une même espèce bactérienne. _ Deux types de transduction : La transduction généralisée et la transduction spécialisée. Cycle de multiplication d un bactériophage virulent Tous les bactériophages ne sont pas virulents et tous les bactériophages intégrés dans un génome ne vont pas entrainer la lyse de la cellule. Un certain nombre de régulations permet d avoir une transduction abortive et simplement l intégration du bactériophage dans le génome. Un bactériophage virulent se fixe au niveau d un récepteur spécifique, il intègre son génome. L expression de cet ADN dans la cellule infectée permet la synthèse des protéines phagiques, la reformation de bactériophages par assemblage et la lyse de la cellule lors de leur libération. La transduction généralisée C est un transfert qui concerne n importe quelle partie du génome bactérien, la bactérie est lysée et une partie du génome bactérien va être encapsidée. Les phages transducteurs à ADN chez Coli sont T4 et P1, et chez Salmonella typhimurium c est P22 3

Le mécanisme de la transduction généralisée : -Fragmentation du génome bactérien au cours de la réplication virale à l aide de nucléases virales spécifiques ou non. -1 particule (=1 nouveau bactériophage) sur 100 va encapsider de l'adn bactérien. -On a formation de particules transductrices infectieuses capables d'injecter l'adn bactérien dans une autre cellule. Expression des gènes traduits ssi une recombinaison est possible dans la bactériehôte Si cet ADN présente des homologies avec l ADN de la bactérie, il y aura recombinaison. La transduction, en fonction des différentes espèces, peut être abortive s'il n'y a pas de possibilité d'intégration (pas d'homologie), ou on peut avoir un double crossing-over avec l intégration du génome bactérien et donc un transcrit stable. La Transduction spécialisée A peu près la même chose donc je n y reviens pas (dixit la prof). Conversion lysogénique Définition : C est l acquisition par une bactérie d un caractère somatique particulier déterminé par le génome d un prophage spécifique. Son expression dans toutes les bactéries est liée à l état lysogène. Il disparaît avec la perte de celui-ci. Les bactériophages vont s intégrer et rester latents : ils ne vont pas s exprimer (pas de lyse). Cependant ces bactériophages ont dans leur génome un gène qui va pouvoir s exprimer chez les espèces bactériennes. Exemple: _ La présence du gène codant la toxine du bacille diphtérique est liée à l'existence d'un bactériophage, sans le bactériophage intégré, la souche est non pathogène et n entraine pas la diphtérie. _ De la même façon chez le streptocoque de groupe A, agent responsable de l angine et de la scarlatine (qui commence par une angine suivie d une éruption). La scarlatine est due à la toxine érythrogène, toutes les souches du groupe A n ont pas cette toxine donc toutes les souches n entraineront pas de scarlatine, seules les bactéries contenant le bactériophage synthétisant cette toxine donneront une angine suivie d'une scartlatine. _ De même pour des cytotoxines chez E. Coli (toxines de coli entéropathogènes) _ Des facteurs antigéniques chez la Salmonelle sont portés par des bactériophages. Ainsi le transfert de gènes ne permet pas seulement une résistance aux antibiotiques, mais peut également entrainer des phénomènes physiopathologiques différents. La transduction a un potentiel limité aux espèces très proches, mais c'est un processus extrêmement efficace car : - dans un certain nombre de cas, l'adn est protégé dans les particules virales : il est protégé par des nucléases car il est encapsidé. - il y a un système de délivrance très performant : si un phage s attache à une bactérie, il injecte son ADN. - les phages sont très abondants, en milieu aquatique on trouve entre 10 3 et 10 8 phages / ml. (Les 10 8 phages / ml correspondent à 1/3 de la population bactérienne sujette à une attaque virale par 24 h.) 4

Dans l environnement, les bactéries coexistent en permanence avec des bactériophages et sont donc soumises en permanence à leurs agressions. Cependant, on a peu de preuves concernant l'importance réelle de ce phénomène dans l'acquisition de nouvelles fonctions. Toutefois on sait que c est un mécanisme impliqué dans l acquisition de la toxine erythrogénique chez les Streptocoques de groupe A et dans la variation antigénique. On sait aussi que bon nombre des «îlots de pathogénicité» des bactéries correspondent en fait à des prophages intégrés dans les chromosomes bactériens (notamment pour le choléra, il y a eu une nouvelle souche apparue il y a une dizaine d années dont la virulence est liée à l acquisition d un bactériophage) peu différents de phages transducteurs spécialisés. II-LA TRANSFORMATION La Transformation naturelle Définition : Pénétration dans une cellule bactérienne, naturellement transformable, d'adn nu. Expérience : on fait une séparation biochimique des différents constituants du pneumocoque (les protéines, les carbohydrates, les acides nucléiques, ), et on les injecte chez des souris saines en même temps que des bactéries non virulentes ou que des bactéries virulentes. On observe que les souris ayant reçu les acides nucléiques et les bactéries non virulentes meurent. Si celles-ci reçoivent des nucléases avec les acides nucléiques (expérience contrôle), elles ne développent pas de pathologie. Les bactéries qui étaient non virulentes n avaient pas de capsule et celles qui étaient virulentes en avaient une, c est ce qu on appelle les colonies rough (R) et les colonies smooth (S). Quand on injecte des colonies S, les souris meurent, quand on injecte des colonies R elles ne meurent pas, mais si on injecte en plus de l ADN, les gènes permettent la transformation des bactéries en S ETAT DE COMPETENCE 1. Etat de compétence Etat où la bactérie est capable de recevoir de l'adn exogène. Cet état est sous- tendu par des mécanismes différents en fonction des espèces. 2. Les principales étapes de la transformation a. L'ADN : bicaténaire, avec une origine de réplication variable b. 1ère étape : Fixation covalente de l'adn à un complexe protéique membranaire : le "Transformasome" c. 2ème étape : Fragmentation de l'adn (nucléases) d. 3ème étape : Entrée de l'adn simple brin dans la bactérie e. 4ème étape : Devenir de l'adn simple brin transformant dans la bactérie, conditionné par les homologies entre l ADN entrant et celui existant (il peut y avoir intégration). Les trois grandes espèces chez lesquelles il y a une importante implication du transfert génétique par le mécanisme de transformation sont : le pneumocoque avec une efficacité de 3/100 bactéries, le méningocoque et H. influenzae. D autres espèces sont susceptibles d être soumises au transfert génique grâce au mécanisme de transformation mais de façon moins efficace. En fonction de la croissance bactérienne, les différentes espèces ne sont pas compétentes à tout moment. Pour le pneumocoque, les bactéries peuvent acquérir de l ADN pendant la 1ere partie de leur phase exponentielle de croissance et en phase stationnaire il ne se passe plus rien. Pour H. influenzea, N. gonorrhoea et le 5

méningocoque, les bactéries sont capables d'acquérir de l'adn en fin de phase exponentielle de la croissance. B. subtilis(en vert) est capable de récupérer de l ADN pendant toute la phase de croissance, même pendant la phase stationnaire. (Schéma de l entrée d ADN diapo 23) seul un brin d ADN pénètre dans la cellule. Pour la légende du schéma Sb:simple brin et Db: double brin Devenir de l'information génétique échangée par transformation naturelle - Intégration par un processus de recombinaison homologue : il faut de larges homologies entre l'adn exogène et endogène. Si l homologie de l ADN entrant ne couvre pas exactement la même partie que l ADN déjà présent alors on aura délétion, au contraire s'il y a de l ADN supplémentaire, cela aboutira à une insertion, enfin s il y a une mutation ponctuelle ou un changement de séquence alors on aura un remplacement allélique. Pour le pneumocoque c est ce mécanisme qui entraine la résistance aux β-lactamines, notamment à la pénicilline. Diapo 30: Vous avez ici un pneumocoque sensible et vous savez que les cibles des β- lactamines chez le pneumocoque sont ce que l on appelle les PLP( Protéine Liant la Pénicilline) ou PBP (pour Penicillin binding proteins). Il y a différentes PLP chez le pneumocoque, la plus importante est la PLP2B. Donc un pneumocoque sauvage a un gène codant pour la PLP sauvage qui présente une affinité très importante pour les β- lactamines. Le pneumocoque est une bactérie naturellement transformable et donc elle va pouvoir acquérir de l ADN. Cet ADN va rentrer et s intégrer dans le gène de la PLP2B (il est représenté en orange), et le pneumocoque va devenir intermédiaire. Donc on a une acquisition et un remplacement allélique avec une modification du gène, ce qui va aboutir à un gène mosaïque. Quand il y a plusieurs acquisitions, le niveau de résistance va pouvoir augmenter. Ces gènes PLP viennent de bactéries phylogénétiquement proches du pneumocoque, comme les streptocoques oraux que l on va retrouver dans la flore oro-pharyngée. Ces streptocoques ne sont pas pathogènes mais leurs gènes codants pour les PLP sont différents : ils ont une moindre affinité pour les β-lactamines. On aboutit donc à une transformation du gène codant pour la PLP qui passe d une forte à une faible affinité pour les β-lactamines. Les pneumocoques ont acquis, grâce à ce mécanisme, des résistances durant ces 15 dernières années. On se retrouve avec des souches résistantes à la pénicilline définies par une CMI (concentration minimale inhibitrice)> 1, ce qui va contre indiquer l utilisation de la pénicilline pour le traitement de l infection liée à ces pneumocoques. Donc le processus de transformation est un processus durable. En règle générale, l ADN provient de la même espèce bactérienne ou d une espèce bactérienne proche. D un point de vue génétique, la transformation va induire un remplacement allélique, et on va avoir des mutations ponctuelles qui vont entrainer : _ Une variation antigénique chez le gonocoque _ L acquisition de la résistance à la pénicilline et aux sulfamides chez le méningocoque _ La résistance aux pénicillines chez le pneumocoque Transformation artificielle Le principe c est de rendre les bactéries compétentes donc aptes à recevoir de l ADN. Il y a différentes méthodes: 6

_ il y a longtemps, on fragilisait la paroi bactérienne en la traitant à froid avec des solutions contenant des cations divalents (notamment du chlorure de calcium). Dans ce cas là, E. coli était transformable. La grande différence par rapport à la transformation naturelle c est que l ADN va rentrer sous forme d ADN double brin. Ce sont des techniques qui vont permettre de faire rentrer des plasmides dans les cellules bactériennes et les cellules transformées vont exprimer les gènes contenus dans les plasmides. Ceci n'est efficace que si l ADN est capable de réplication autonome donc localisé sur un réplicon (=localisé sur le plasmide). Cette technique est encore utilisée aujourd'hui. _ on peut faire rentrer l ADN par d autres techniques qui sont largement utilisées : par électroporation, c est-à-dire que l on fait subir un choc électrique à la bactérie, on fragilise de manière extrêmement éphémère la paroi bactérienne et l ADN va pouvoir rentrer. On reconstitue de manière très rapide la structure de leur paroi en les faisant repousser dans un milieu ad hoc (=adéquat). Devenir de l ADN nu dans les environnements terrestre et aquatique Il y a de l ADN dans les environnements terrestre et aquatique, donc un peu partout. Cet ADN extracellulaire provient des chromosomes et éventuellement des plasmides des bactéries. Cet ADN peut : être dégradé s absorber sur les solides être protégé de la dégradation par certaines structures être pris en charge par des cellules compétentes. Ces cellules seront transformées et elles pourront donner de l ADN à une cellule acceptrice. Donc on observe que les échanges qui ont lieu dans les flores de l homme peuvent aussi avoir lieu dans un environnement terrestre ou aquatique. Diapo 33: Transformation artificielle Donc à droite on a le chromosome, à gauche le plasmide. Le vecteur est un ADN : on a mis le gène d intérêt sur un plasmide qu'on introduit dans la bactérie, cela permet la synthèse de protéines codées par le gène. III-LA CONJUGAISON BACTERIENNE La conjugaison Définition : Processus spécialisé qui implique un transfert unidirectionnel d ADN d une cellule donatrice à une cellule réceptrice, par un mécanisme requérant un contact spécifique. Il existe deux classes de véhicules : principalement les plasmides, mais aussi les transposons (appelés transposons conjugatifs lorsqu'ils sont responsables de conjugaison). On observe souvent une synergie entre les véhicules, en particulier il y a des plasmides qui ont intégré des transposons, ces plasmides quand il sont conjugatifs vont pouvoir véhiculer les transposons. Limites du transfert par conjugaison: _ pour les plasmides, le transfert est conditionné par la réplication et l'expression des fonctions de transfert qui ne peuvent pas toujours se faire.. _ pour les transposons le transfert est conditionné par l'expression des fonctions de 7

transfert qui ne peut pas toujours avoir lieu. De façon générale, le transfert et l expression des fonctions de transfert sont très finement régulés, vraisemblablement afin de limiter la charge biosynthétique liée à ce processus (les plasmides représentent une charge importante pour la bactérie car ce sont presque des mini-chromosomes). 1.Les Plasmides a)caractéristiques générales des plasmides: _ Molécules d'adn bicaténaire circulaire _ Extrachromosomiques _ Réplication autonome, indépendante de la réplication du chromosome bactérien _ Ils sont transmis de façon stable au cours des divisions cellulaires _ Non indispensables à la bactérie-hôte _ Confèrent à la bactérie-hôte une grande souplesse génétique car en acquérant un plasmide, la bactérie va acquérir de nouveaux gènes _ Présents chez la plupart des espèces bactériennes _ Très différents les uns des autres _ Taille variable entre 2 à 400 kb (les plus grands font le double d un chromosome de mycoplasme~ 200kb ), il y a aussi de petits plasmides utilisés comme vecteurs pour faire du génie génétique. b)propriétés des plasmides: les plasmides sont des associations modulaires de gènes regroupés en unités fonctionnelles. Parmi ces gènes, certains sont impliqués dans la réplication Un plasmide est un réplicon, il possède donc un système de réplication autonome, lui permettant de se maintenir à un taux constant dans les cellules au cours des divisions successives. Il y a un système de régulation qui est à l'origine du phénomène d'incompatibilité (=deux plasmides dans une même bactérie hôte sont dits incompatibles s'ils ne se retrouvent pas ensemble dans les bactéries des générations suivantes) et du contrôle du nombre de copies plasmidiques dans la cellule bactérienne. En temps normal, on a 4 à 5 copies par cellule, lorsque ce système est dérégulé, on obtient des plasmides à haut nombre de copies (avec 200 à 300 copies pour un chromosome bactérien). Rappel: un plasmide a une origine de réplication des gènes impliqués dans la réplication des gènes codant pour les propriétés fonctionnelles qui permettent de faire véhiculer le plasmide. Revenons au modèle initial de résistance aux antibiotiques : on teste une bactérie qui n a pas de plasmide. On remarque qu'elle est sensible aux sulfamides, à un métal lourd (le mercure), ainsi qu à la gentamycine et à la tobramycine. Si on intègre un plasmide, on voit qu elle devient résistante à toutes ces substances. Donc un plasmide qui contient plusieurs gènes de résistance va pouvoir conférer à une bactérie une résistance multiple. C'est ce qui se passe dans la nature : les bactéries possèdent souvent plusieurs plasmides qui leur confièrent des gènes de résistance (donc des propriétés supplémentaires). 8

Un peu d histoire au Japon dans les années 1955-60 : Isolement d entérobactéries multi résistantes (Shigelles) responsables de diarrhées. Ces bactéries sont très proches d'e.coli. Les gènes de virulence conférant la pathologie sont localisés sur un plasmide, si on met ce plasmide en présence de E.coli on transforme E. coli en Shigelle. En fait, ces Shigelles résistantes aux β-lactamines et à la tétracycline. Par ailleurs il y avait existence simultanée dans les selles des malades de souches d E.coli avec le même phénotype de multi résistance. On a montré que la multi résistance était transférable : si l'on met des souches sensibles de E. coli avec des Shigelles multi résistantes, on obtient des E.coli multi résistantes. Le transfert se fait à des fréquences variables (10^-5-10^-7) et on a qualifié le plasmide de RTF = Resitance Transfert Factor. On a retrouvé des gènes de résistance véhiculés par des plasmides dans toutes les espèces bactériennes où on les a cherchés, à l'exception de Streptococcus pneumoniae. (pneumocoque). Il n y a pas de plasmide qui confère une résistance aux pneumocoques, ce sont des mécanismes particuliers qui sont à l'origine de la résistance: soit l acquisition d ADN soit à l acquisition d éléments transposables appelés transposons conjugatifs pour les autres antibiotiques d intérêt majeur comme les macrolides ou les aminosides. La résistance plasmidique concerne la quasi-totalité des antibiotiques : presque tous les gènes de résistance vont être localisés sur ces plasmides de résistance, qui sont de loin le support génétique le plus fréquent de la résistance aux antibiotiques. On retrouve les plasmides dans la quasi-totalité des Gram+ à l exception du pneumocoque et chez tous les Gram- (diapos 41 avec la liste des gram- et +). Ces plasmides vont aussi véhiculer des gènes de virulence (tout comme les bactériophages). Les facteurs de virulence Etudiés surtout chez les entérobactéries (Escherichia coli, Shigella, Yersinia, Salmonella), mais également chez les G+ (Staphylococcus Aureus ou staphylocoque doré, Bacillus anthracis ou anthrax). Il y a un plasmide responsable de toute la pathologie de l anthrax : il existe une bactérie cousine de l anthrax ne possédant pas ce plasmide, elle n est donc pas virulente, elle est simplement responsable d une infection mais pas de charbon (=infection majeure). Les plasmides qui portent ces gènes de virulence sont de grande taille : > 200 kb. Exemples : Le plasmide de virulence de Shigella code pour des protéines permettant à la bactérie de se multiplier dans les cellules de la muqueuse digestive. Certaines hémolysines qui sont des facteurs de virulence sont localisées sur des plasmides, ainsi que des toxines entérotoxinogènes LT ou ST chez E. coli et des gènes qui vont conférer des propriétés adhésives et invasives aux bactéries. Comme n'importe quel type de gène peut être véhiculé on a aussi transfert de facteurs 9

métaboliques. Les facteurs métaboliques Ce sont des facteurs non indispensables à la vie de la bactérie, mais qui peuvent l'aider à s adapter à un milieu hostile. Elle va donc pouvoir, par exemple, dégrader certains nutriments qui vont l'aider à survivre. Cela va être une source d'erreur lorsqu'on va vouloir identifier les souches. Les facteurs métaboliques sont d'un grand intérêt sur le plan biotechnologique, car ils permettent à la bactérie de pouvoir dégrader des produits chimiques après une modification en laboratoire. c) Plasmides conjugatifs Ce sont des structures qui sont autotransférables : ils sont capables de promouvoir leur transfert d une bactérie à une autre de façon indépendante. Leur taille est généralement supérieure à 20 kb, et leur nombre de copies est faible (inférieur à 5 par copie de chromosome bactérien). Ils se présentent avec une origine de réplication, des gènes de réplication et l ensemble des fonctions de transfert qui sont regroupées sous forme d un opéron appelé opéron tra. Le Plasmide F Le plasmide F est le prototype des plasmides conjugatifs, il a été très largement étudié en génétique bactérienne. Sous forme d ADN circulaire double brin, il se réplique chez E. coli et Salmonella typhimurium, et il se trouve habituellement en situation extra chromosomique. Lorsqu elles hébergent ce plasmide, les bactéries sont définies en génétique bactérienne comme des bactéries males et notées F+. Parfois ce plasmide va pouvoir se trouver en situation intra chromosomique (intégré dans le chromosome), on appelle les bactéries qui l'hébergent Hfr. On obtient des bactéries F+ avec un seul plasmide F, et chaque bactérie qui reçoit ce plasmide devient F+. Pour les bactéries Hfr, l'adn chromosomique étant transféré en dernier, seules les bactéries qui auront acquis le plasmide deviendront Hfr. (Ce n'est pas expliqué très clairement) Diapo 48: on voit la structure d un opéron tra qui fait en moyenne 40 kb, on observe un certain nombre de gènes. Le processus conjugatif est complexe, il va nécessiter une régulation (il y a des gènes impliqués dans la régulation). La formation d appendices protéiques que l on va appeler des pili va permettre des contacts intimes entre la bactérie donatrice et la bactérie réceptrice. Ce sont des structures protéiques complexes qui sont codées par un certain nombre de gènes. Il y a aussi des structures qui vont stabiliser le couple bactérie donatrice-bactérie réceptrice, d autres qui sont impliquées dans la métabolisme de l ADN : dans la sortie de l'adn, dans son clivage, dans l'activation de l origine de transfert, on a notamment des endonucléases qui vont cliver cette origine de transfert. Puis on a des structures qui permettent une exclusion de surface : une fois que l ADN est transféré elles permettent aux deux bactéries de se séparer. Diapo 49 : ceci est une photo présente dans de nombreux ouvrages et souvent mal interprétée. On a dit qu'elle présentait un transfert d'adn à distance entre deux bactéries. Or cela n existe pas car il faut impérativement un contact intime entre les deux bactéries, et un pore pour que l ADN puisse passer. Les deux bactéries doivent être collées, il faut même une fusion des membranes. La structure qui pourrait être 10

confondue avec un tunnel d échange n est en réalité qu un pili. Diapo 50: le shéma n est pas à retenir mais il faut retenir les étapes. _ les cellules donatrices sont piliées (dixit le prof), ces pili vont servir à l adhésion. Une fois que les bactéries sont accrochées il y a rétractation du pilus, formation d un complexe de conjugaison qui va être stabilisé, et c est uniquement lorsque les bactéries sont accolées, qu il y a transfert de l information génétique. Puis l exclusion de surface permet la séparation des deux bactéries Diapo 52: c est la structure du pili. Chez le plasmide F, il est essentiellement formé par une protéine appelée Tra A, qui est l équivalent d une piline, on verra chez le méningocoque qu il y a aussi des pilines qui vont permettre l'accrochage aux cellules endothéliales. NB: le pilus est constitué de la répétition d'une sous unité de base : la piline. On pense qu'au bout du pilus il y a une protéine qui joue le rôle d une adhésine. Ces structures piliées sont très largement décrites chez les G- et elles ont été récemment décrites chez la quasi-totalité G+. Systèmes de transfert conjugatif à large spectre d hôte ( pour les G-) Il existe des plasmides conjugatifs (ou systèmes de transfert conjugatif) à large spectre d hôte, notamment chez les bactéries à G- (leur nom n est pas à retenir). Plasmides du groupe IncP: Ce sont des plasmides qui vont pouvoir conjuguer et se répliquer entre chaque barrière d'espèce qui existe chez les bactéries à G- (il y a transfert et réplication entre les bacilles et les coques à G-). Ces plasmides peuvent se transférer chez les G+ mais ils ne se répliquent pas car l origine de réplication est différente chez les G- et chez les G+. Mais si on intègre une origine de réplication G+ dans ce plasmide, il y aura réplication après transfert. Donc le transfert de gènes de G- vers G+ est possible. On voit aussi que le transfert est possible vers un eucaryote (une levure) mais ils n y a pas de réplication Ce type de plasmide a été utilisé pour transférer des gènes dans des cellules eucaryotes dans un but thérapeutique (comme dans certaines thérapies géniques pour la mucoviscidose). Plasmide Inc Q : plasmide capable de se répliquer chez les bacilles et coques à G- La notion de mobilisation: on a un plasmide qui n est pas véritablement conjugué. Un plasmide mobilisateur c est une structure qui ne possède que l origine de transfert et il partage cette origine de transfert avec le plasmide conjugatif. Dans la cellule hôte, on a un plasmide conjugatif, le plasmide F, qui va être transféré. Le plasmide qui va être mobilisé profite de la conjugaison du plasmide F pour être également transféré au cours de la machinerie de conjugaison, c est-ce que l on appelle la mobilisation plasmidique. Le plasmide IncQ va pouvoir être mobilisé et va se répliquer dans les bacilles et coques à G- et dans les bacilles à G+ à bas GC%. Les plasmides mobilisateurs sont des vecteurs capables de transférer des gènes de résistance. On a aussi un plasmide( plasmide Ti), présent chez les plantes. Il y a une symbiose entre la bactérie agro bacterium et les plantes. Agro bacterium va injecter les gènes lui permettant de métaboliser l azote à la plante, ce qui va permettre la croissance de la plante. Ces gènes sont portés par le plasmide Ti, et c est seulement cette symbiose qui va permettre à la plante de métaboliser l azote. 11

Les plasmides répondeurs aux sex-pheromones Il y a des plasmides présents uniquement chez les entérocoques qui répondent à un signal de l environnement, que l on appelle une sex phéromone. Quand la sex phéromone est synthétisée par la cellule donatrice qui héberge ce plasmide, il va y avoir aggrégation des entérocoques et transfert de ce plasmide car le plasmide sécrète des substances favorisant l'aggrégation. La cellule donatrice va sécréter la sex pheromone, il y a accolement de la bactérie réceptrice à la bactérie donatrice et il va pouvoir y avoir un transfert conjugatif. Donc ce plasmide est l équivalent des plasmides F chez les bactéries à gram +, avec des fréquences de transfert très importantes. Cela pose un problème en matière de résistance. En effet l efficacité de transfert d'un plasmide sex phéromone est très importante : si ce plasmide est présent dans une souche bactérienne en contact avec des entérocoques, il va contaminer tous les entérocoques. Cela est problématique si le plasmide porte des gènes de résistance (maintenant on a chez certains entérocoques une résistance à la vancomycine). Limites: Les limites du mécanisme de transfert d un plasmide et du transfert de gènes de résistance lorsqu il sont localisés dans un plasmide sont : la réplication de ce plasmide dans la cellule qui le reçoit. La réplication conditionne la dissémination du plasmide dans la souche bactérienne. l expression: _ Transcription : la reconnaissance ou non des signaux de démarrage et de terminaison conditionne l'expression des gènes de résistance _ Traduction : reconnaissance des signaux de démarrage et de terminaison et usage des codons. Systèmes de transfert conjugatif à large spectre d hôte ( pour les G+) Il y a également des systèmes de transfert et de réplication de plasmides chez tous les G+ (bacilles et coques). Le transfert peut se faire des entérocoques vers E.coli, mais il n y a pas de réplication sauf si on ajoute une origine de réplication pour les G-. 2)les transposons Sur les plasmides, il peut y avoir des éléments transposables (transposons). Ce sont des structures qui ne vont pas se répliquer mais qui vont pouvoir s intégrer à un plasmide présent chez des G-, ce qui explique les transferts horizontaux entre les bactéries à G+ et les bactéries à G-. Les systèmes de capture de gènes La divergence entre les séquences qui empêche la recombinaison est une limite à l'intégration après la transformation. Les systèmes de capture : Si l ADN ne peut pas s intégrer on va avoir des structures qui vont capter cet ADN en présence d une pression de sélection. Il y a deux structures de ce type qui vont 12

permettre de s'affranchir de la recombinaison : Transposons (Tn) Composites : Des gènes flanqués d'une IS (séquence d'insertion) de chaque côté deviennent mobiles et peuvent s'intégrer en utilisant la machinerie de l'is. Les intégrons : Système de capture qui transforme un fragment d'adn en cassette en lui ajoutant une structure de reconnaissance qui va permettre à un système de recombinaison spécifique de site de le reconnaitre. Le dernier mécanisme de transfert est la transposition La transposition: Elle va créer des transposons qu l'on classe en fonction de leur structure en différentes familles: - Les séquences d insertion (IS) et les transposons composites - Les transposons de la famille Tn3 (même s ils sont différents ils ont une structure commune) - Transposons conjugatifs a) Caractéristiques générales de la transposition - Evénement rare (10^-5 à 10^-6 par bactérie). - Absence de nécessité d'homologie entre les ADN qui intéragissent contrairement à la recombinaison homologue : les transposons vont s'intégrer n'importe où dans le génome bactérien. - La transposition est indépendante des fonctions de recombinaison de la bactérie-hôte (et notamment de la protéine RecA). Les souches qui n ont pas de capacité de recombinaison dites Rec- peuvent très bien accepter des transposons. - Le transposon peut s'intégrer n'importe où en théorie. Cependant certaines régions riches en A+T entraînent une certaine conformation de l'adn-cible et constituent donc des points chauds d'insertion. Diapo 66: Le transposon va générer au niveau de l ADN cible des coupures décalées grâce à des endonucléases, ce qui lui permet de s intégrer. On caractérise ces éléments transposables par le fait qu'au site d'intégration, il y a presque toujours une duplication de l ADN cible. La longueur de la duplication de l'adn cible est caractéristique d un élément transposable donné. Diapo 67: Donc le transposon intégré dans un chromosome va pouvoir se réintégrer dans un autre endroit du chromosome ou sur un plasmide, on va ainsi avoir plusieurs copies d un élément transposable dans un même génome bactérien. b)séquence d insertion et transposons composites Séquence d insertion La structure de ces éléments transposables est appelée séquence d insertion. Elle est spécifique des procaryotes. La structure d'insertion de base comporte des séquences inversées répétées (IR) encadrant un gène qui va coder une protéine que l on appelle transposase. Cette protéine va permettre la mobilité et l intégration de ces éléments dans différents endroits du chromosome. Ces éléments transposables sont très répandus chez les bactéries à Gram négatif et à Gram positif. On a souvent plusieurs copies intégrées dans le chromosome ou dans un plasmide. Quand on a deux séquences d insertion qui encadrent un fragment d ADN on a un 13

transposon composite. Quand le fragment d'adn est un gène de résistance aux antibiotiques, on a un transposon qui véhicule un gène de résistance. Les transposons peuvent aussi véhiculer des gènes de virulence. Diapo 70: La protéine Rec de la bactérie peut provoquer des recombinaisons entre le transposon et le chromosome bactérien. On va avoir une plasticité du génome bactérien avec des gènes localisés à des endroits différents du génome pour une même espèce de bactérie. Les séquences d'insertion peuvent être spécifiques d une espèce de bactéries donnée, et servir de marqueur d'identification de cette espèce (on peut les utiliser pour amplifier le génome). c)la famille Tn3 Transposons de type Tn3 Il y a aussi des séquences IR aux extrémités, un gène qui va coder pour une transposase, mais le mécanisme de transposition est différent de celui des transposons composites et des séquences d insertion. Le gène tnpr code pour une résolvase et le gène bla, qui est un gène de résistance aux antibiotiques, code pour des β-lactamases. Les β-lactamases sont très repandues chez les entérobactéries. Dans la quasi-totalité des cas, les pénicillinases d'e. coli sont localisées sur des transposons de type Tn3. Il existe des β-lactamases à large spectre qui sont dérivéss du gène bla par des mutations au niveau du site catalytique. Ces mutations permettent d étendre leur spectre d action au céphalosporines de troisième génération. Ces transposons sont intégrés sur des plasmides conjugatifs, ce qui explique la diffusion mondiale et l émergence quasi inéluctable de multi résistances chez les entérobactéries. Ces structures existent aussi chez les G+ : chez les entérocoques résistants à la vancomycine, la résistance est véhiculée par des transposons de type Tn3. d)les transposons conjugatifs Transposons conjugatifs Ils sont différents dans la mesure où il sont capables de promouvoir une un transfert par un processus conjugatif entre une bactérie donatrice et une bactérie réceptrice. A l inverse des autres structures, il n y a pas de véritables IR aux extrémités. Le processus d intégration de ces éléments est complètement différent. Le transposon conjugatif a structure proche de celle d'un bactériophage de G- : il comporte un gène xis codant une excisionase et un gène int codant une intégrase. On a aussi un ensemble de gènes qui vont promouvoir le transfert par conjugaison bactérienne de ces structures d une bactérie à une autre. Ce transposon est retrouvé uniquement chez les bactéries à G+. C est le principal véhicule de la résistance à la tétracycline chez les G+, et c est le principal véhicule de la résistance chez les pneumocoques (il n y a pas de plasmide de résistance chez le pneumocoque). Tous ces transposons conjugatifs ont le gène de résistance à la tétracycline, le gène tetm. Ces transposons sont capables de promouvoir le transfert de G+ à G-, ce qui explique que l on retrouve ces marqueurs de résistance chez les entérobactéries. Diapo 74: C est uniquement sous la forme d intermédiaire circulaire que le transposon (qui ne se réplique pas car ce n'est pas un plasmide) est transféré. Cet intermédiaire va 14

-soit se réintégrer à un plasmide -soit se réintégrer à un autre endroit du chromosome -soit être le substrat du transfert lors de la conjugaison. Dans la bactérie réceptrice, pour pouvoir exister, le transposon doit s'intégrer dans le chromosome bactérien. On n a pas besoin d homologie entre les ADN qui interagissent. Le transposon est un véhicule très efficace pour transporter de l information génétique (gènes de résistance) Le prototype des transposons conjugatifs est le transposon Tn916 : _ spectre d hôte large, on peut le transférer à : Bacilles et cocci à Gram positif E. coli P. fluorescens _ il confère la résistance à la tétracycline (grâce au gène tetm) _ existence de variants contenant des marqueurs additionnels (ermb, apha-3) conférant une résistance à d'autres antibiotiques. _ le transfert conjugatif induit par la tétracycline, in vitro et in vivo (X 10²). En effet tous les transposons conjugatifs ont le gène de résistance à la tétracycline. En présence de tétracycline, on active le processus de conjugaison et l ensemble des gènes de transfert. Quand on a une pression de sélection induite par la tétracycline, on va favoriser le transfert des éléments du transposon à d autres bactéries pour qu elles deviennent résistantes. Donc c'est un très bon outil pour permettre la dissémination des gènes de résistance. Plus il y a de transposons sur le chromosome et plus on augmente le potentiel de transfert de la bactérie donatrice, il peut alors y avoir transfert à de très nombreuses espèces. 3)les intégrons : uniquement chez les bactéries à G- Les systèmes de capture de gènes: les intégrons Les intégrons ne sont présents que chez les bactéries à G-. L intégron est une structure qui permet à des gènes de résistance de s intégrer et de s exprimer. Il contient un gène codant pour une intégrase et un promoteur (en 5 du gène codant pour l'intégrase). Celui-ci permet la transcription de tous les gènes situés en aval de ce promoteur: c est une «station-service complète» pour les gènes cassettes de résistance. Cela veut dire que les gènes de résistance en aval du promoteur vont pouvoir s'exprimer même s'ils n'ont pas de promoteur propre. Plus le gène est proche du promoteur, plus il va s'exprimer. Par un mécanisme de recombinaison, et d intégration site spécifique, au niveau d un site que l on appelle att pour site d attachement, on va pouvoir avoir l intégration d'une cassette de résistance. Donc en fonction de la pression de sélection les bactéries sont capables d adapter à la carte leur mécanisme de résistance. De multiples gènes peuvent s associer dans les intégrons et être traduits ensemble. La présence d un intégron au sein d un transposon est un mécanisme fréquent particulièrement efficace pour accélérer l évolution Conjugaison et transposition Ce sont des mécanismes complémentaires. Un transposon va pouvoir être transféré sur un plasmide conjugatif qui ne peut pas se répliquer, mais cela va permettre au transposon de s intégrer et on va avoir expression des gènes de résistance. 15

Antibiotiques et mobilité génétique En présence d antibiotique on va pouvoir favoriser la transposition et notamment si on met de l'érythromycine avec un transposon Tn917 qui contient un gène de résistance, la transposition va être multipliée par un facteur 100. La présence d'antibiotiques entraine une sélection des bactéries résistantes, et une sélection des véhicules qui permettent le transfert de ces gènes de résistance. CONCLUSION Les gènes de resistance qui sont localisés soit sur des transposons conjugatifs soit sur des plasmides conjugatifs ont pu être transférés de façon très efficace vers les bactéries à gram négatif. La plasticité du génome bactérien, c est l imagination des bactéries pour trouver des solutions à des pressions de sélection environmentales La formidable diversité des mécanismes d adaptation du génome explique l adaptabilité des bactéries et leur évolution mais rend peu probable la découverte d un antibiotique sans résistance Enfin elle permet de multiples applications en biotechnologie. 16