Activation de la protéine p53 par l irradiation laser dans l ultraviolet lointain Catherine Chapel 1, Evelyne May 2, Monique Vacher 3 et D. Courant 1 1 DSV/DRR/SRBF, CEA, Fontenay aux Roses 2 CNRS UPR 9045, Institut André Lwoff, Villejuif 3 Laboratoire de Radiobiologie de l ADN, DSV/DRR, CEA, Fontenay aux Roses, 1
Le rayonnement à 193 nm émis par le laser à excimères ArF est utilisé en ophtalmologie pour la chirurgie de la réfraction (PKR, et LASIK). La photoablation élimine ou endommage : L épithélium cornéen et la membrane basale Le stroma cornéen et les kératocytes Les cellules endothéliales Données partielles voire contradictoires Coupe histologique de cornée humaine keratocytes anterior posterior Epithelium Stroma Endothelium 2
Objectif La photoablation par laser UV 193 nm expose les cellules viables, autour de la zone traitée, à des doses sub-ablatives d un rayonnement constitué de photons de haute énergie (6.4 ev) 0 150 400 1800 2500 J.m -2 cette étude Fréquence 5 Hz Fluence seuil Zone de photoablation En chirurgie réfractive Fréquence 10-20 Hz 3
L absence de p53 augmente la sensibilité à l irradiation Laser Cellular Type D37 Laser 193 D37 254 nm nm H1299 62,1 J. m -2 12,6 J. m -2 RKO 174,5 J. m -2 28,1 J. m -2 p53 statut absence Wild type L absence de p53 induit une réduction de la capacité à former des colonies après irradiation. Observé après UVC 254 nm, corrélé à une diminution des mécanismes de réparation. Smith et al., 2000 D37 : Dose at which 37% of surviving cells H1299 : Human non-small lung carcinoma cells RKO: Human colorectal carcinoma cells 60 J.m -2 4
La protéine P53 P53 Arrêt du cycle cellulaire G1 ou G2/M UV, rayonnements ionisants, agents chimiques, LASER? Stratégies possibles P53 Antisens inhibiteur (PFT) ou Activation non possible Réparations cycle Apoptose P53 réponse P53 5
Approche expérimentale ± Pifithrine cyclique t -1 24 h t 0 t 24 h t 48 h t 72h 6 Cycle/ P53 Prolifération cellulaire Cycle Prolifération cellulaire Marquage de l apoptose Immunomarquages Cycle Immunomarquages Irradiation Laser 193 nm (ou UVC 254 nm) Mise en culture
La pifithrine : un inhibiteur réversible de p53 La pifithrine est un inhibiteur réversible de la p53. Komarov et al., 1999 Pifithrin-α permet de démontrer l implication de p53 suite à un stress Gammes utilisées : 10-50 µm Forme cyclique utilisée plus stable Dans notre étude : Non toxique pour les cellules (WST-1 et BrdU) Pifithrin cyclique 2-(4-methylphenyl)imidazo[2,1-b]-5,6,7,8- tetrahydrobenzothiazole,hbr Calbiochem 7
Activation de la P53 après irradiation Laser 1/2 Non irradiées 40 30 KH KH+PFT % P53 20 10 Laser 60 J. m -2 0 0 60 Irradiation Laser (J/m²) Marquage P53 24 heures après irradiation Laser (n=500) Ac: Anti p53 DO7 Gift from E. May 8
Activation de la P53 après irradiation Laser 2/2 45 40 Non irradiées avec ou sans PFT 60J/m² % noyaux marqués P53 35 30 25 20 15 10 non irradiées 60 J.m-2 5 0 6h 24h 48h 72h Marquage P53 72 heures après irradiation Laser Protocole selon Bassi et al., 2002 Mesure de l activation par cytométrie de flux Cinétique d expression de p53 après irradiation Laser Immunofluorescence 300<Nb noyaux analysés<1000 9
L irradiation Laser entraîne une augmentation des phases S et G2 Non irradié 60 J/m² 100% 80% 60% 40% 20% G2/M S G0/G1 Number 0 200 400 600 Debris Aggregat Apoptosis Dip G1 Dip G2 Dip S 0 30 60 90 120 150 Channels (FL3-A) Number 0 90 180 270 360 0 30 60 90 120 150 Channels (FL3-A) 0% 0 0+PFT 60 60+PFT Irradiation Laser (J/m²) Pourcentage des différentes phases du cycle cellulaire des kératocytes humains 72h après irradiation Laser 10
L irradiation Laser à 193 nm déclenche la mort cellulaire Marquage TUNEL 24 heures après irradiation Laser (n=500) 11
Cytotoxicité du rayonnement Laser : Apoptose Mock irradiated % subg1 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 subg1 0 0+PFT 60 60+PFT Irradiation Laser (J/m²) Number 0 90 180 270 360 0 30 60 90 120 15 Channels (FL3-A) C. Chapel Pourcentage de sub-g1 72h après irradiation Laser Cytométrie de flux CEA/DSV/DRR 12
La protéine p21 La protéine p53 se lie avec le promoteur du gène WAF1 / Cip1 (pour Wild Type p53-activated fragment et cdk2 inhibiting protein) codant pour la protéine p21 La liaison de la protéine p21 aux kinases cdk2, inhibe leur activité et bloque le cycle cellulaire Rôles clé dans la croissance et la réponse cellulaire aux dommages de l ADN 13
Cinétique d expression de p21 après irradiation Laser Immunofluorescence 40 35 non irradiées 60 J.m-2 % noyaux marqués P21 30 25 20 15 10 5 Nb noyaux analysés>1000 Ac: Anti WAF1 (Ab6) 0 6h 24h 48h 72h 14
Conclusion LASER UV-C 193 nm Accumulation de P53. Arrêt en phases S et G2/M. Augmentation de l apoptose. Accumulation de P21. LASER 193 nm + Inhibition de p53 Augmentation plus importante de l arrêt en phase G2/M. Apoptose plus élevée. Accumulation de P21 autres voies d activation? 15
193 nm 193 nm 193 nm 193 nm 193 nm Membrane cellulaire Dommages de l ADN P21 TNF-α FAS Caspases P73, P63* ROS MMP apoptose Photovieillissement Survie cellulaire 16
Présence des protéines de la famille P53 P73 P63 Activation après irradiation à 30 J.m -2 UV-C 254 nm 17