Biotech Acides aminés. BIOCHIMIE STRUCTURALE Biotech 1. Chapitre 3 Les acides aminés

BIOCHIMIE STRUCTURALE Biotech 1 Chapitre 3 Les acides aminés 1

SOMMAIRE 1. Généralités sur les protéines 2. Les acides aminés : éléments de base des protéines 2.1. Structure et activité optique des acides aminés 2.1.1. Formule générale 2.1.2. Les acides aminés sont des ions dipolaires 2.1.3. Activité optique : rappels 2.2.1. 9 acides aminés non polaires ou hydrophobes 2.2.2. 11 acides aminés polaires 2.2.3. Ionisation des acides aminés 2.2.4. Les 21ème et 22ème acides aminés standards 2.2.5. non constitutifs des protéines ou précurseurs de composés actifs 2.3. Méthodes de séparation et d analyse des acides aminés 2.3.1. Chromatographies 2.3.2. Électrophorèses 2

1. GÉNÉRALITÉS SUR LES PROTÉINES PROTÉINES : - 1 des 4 classes de macromolécules biologiques - à l origine d un haut degré de complexité et d organisation de la cellule - constitués d une ou plusieurs chaînes linéaires d unités de base : les acides aminés NH2 aa aa aa aa aa COOH séquence protéique : déterminée par l information génétique présente dans les gènes ordre d incorporation des acides aminés dicté par la séquence de l ARNm lors de la traduction transcription traduction repliement ADN ARNm (poly)peptide protéine enchaînement d acides aminés structure 3D - structure fonction - activités intracellulaires - maladies si anormale! la séquence en acides aminés d une protéine conditionne sa structure tridimensionnelle, indispensable à l activité biologique 4

1. GÉNÉRALITÉS SUR LES PROTÉINES - TOUTES les activités cellulaires impliquent directement ou indirectement des protéines - la structure est responsable de la fonction - compréhension de la structure développement de stratégies thérapeutiques (beaucoup de maladies génétiques liées à un fonctionnement anormal d une protéine) Transformer enzymes : catalysent l essentiel des réactions chimiques du vivant Créer et maintenir une structure - protéines du cytosquelette - protéines des tissus de soutien Bouger / se déplacer - protéines à fonction motrice - protéines des mouvements intracellulaires Reconnaître et se défendre immunoglobulines Transporter - transporteurs de petites molécules (dont O2) - transporteurs trans-membranaires Informer / signaler - récepteurs et leurs ligands - interrupteurs moléculaires 5

2.1. Structure et activité optique des acides aminés 2.1.1. Formule générale acides aminés = classe de molécules diverses mais structure commune : - un carbone central, appelé carbone α (Cα) portant : - un atome d hydrogène - un groupement acide carboxylique (α-cooh) - un groupement amine (souvent primaire α-nh2, éventuellement secondaire α-nh) - une chaîne latérale (ou radical R) variable, caractéristique de l acide aminé carbone α COOH = fonction acide carboxylique (pk 1 = 2) COOH H C NH 2 NH 2 = fonction amine primaire (pk 2 = 9)! R R = chaîne latérale variable - masse moyenne : 110 Da (de 75 à 200 selon la nature de R) 1 dalton (Da) = unité de masse des protéines = masse d un atome d hydrogène 7

2.1. Structure et activité optique des acides aminés 2.1.1. Formule générale carbone α COOH COOH = fonction acide carboxylique (pk 1 = 2) H C NH 2 NH 2 = fonction amine primaire (pk 2 = 9) R R = chaîne latérale variable - tous les acides aminés sont relativement solubles dans l eau - existent à l état libre - rôle spécifique : métabolique, médiateurs ou précurseurs de médiateurs - 20 à 22 acides aminés dans la composition des protéines = acides aminés protéinogènes structure conservée, des archéobactéries à l homme 8

2.1. Structure et activité optique des acides aminés 2.1.2. Les acides aminés sont des ions dipolaires RAPPELS SUR LES COUPLES ACIDO-BASIQUES selon Brönsted : - acide = entité capable de libérer un proton H + en solution - base = entité capable d accepter un proton en solution Ka AH A - + H + Ka = [A ].[H + ] [AH] un couple acido-basique AH/A - est caractérisé par : - sa constante d acidité Ka - un pka associé (souvent noté pk) tel que pka = -log Ka = ph de demi-neutralisation (ou demi-dissociation) la moitié des groupements sont dissociés 9

2.1. Structure et activité optique des acides aminés 2.1.2. Les acides aminés sont des ions dipolaires carbone α COOH COOH = fonction acide carboxylique (pk 1 = 2) H C NH 2 NH 2 = fonction amine primaire (pk 2 = 9) R R = chaîne latérale variable au moins 2 groupements ionisables sur le Cα : - acide carboxylique α-cooh : couple acido-basique COOH/ (pk1 2,1) - amine α-nh2 (α-nh pour la proline) : couple acido-basique NH3 + /NH2 (pk2 9) - un 3ème couple acido-basique selon la nature de la chaîne latérale de l acide aminé pkr spécifique! valeur pk dépend de : - température - force ionique - micro-environnement de la fonction peut varier légèrement d un acide aminé à un autre on retient pk1 2,1 et pk2 9 10

2.1. Structure et activité optique des acides aminés 2.1.2. Les acides aminés sont des ions dipolaires acides aminés = espèces amphotères (ou ampholytes) = peuvent se comporter comme des acides ou comme des bases grâce à leurs 2 couples acido-basiques! carbone α COOH COOH = fonction acide carboxylique (pk 1 = 2) H C NH 2 NH 2 = fonction amine primaire (pk 2 = 9) R R = chaîne latérale variable - état d ionisation global dépend de l état de chacune des fonctions ionisables en fonction du ph - milieux biologiques (aqueux, ph physiologique) : acides aminés libres toujours ionisés - acide aminé libre = non engagé dans des liaisons peptidiques - dans peptides ou protéines : fonctions α-cooh et α-nh2 engagées dans des liaisons peptidiques ne sont plus ionisables (sauf extrémités) 11

2.1. Structure et activité optique des acides aminés 2.1.3. Activité optique : rappels - tous les acides aminés, sauf glycine : Cα asymétrique molécules chirales 2 énantiomères de chaque acide aminé (et 2 n stéréoisomères avec n = nombre de C*) - acides aminés naturels de la série L (α-nh2 à gauche en projection de Fischer) représentation de Ficher COOH COOH H 2 N Cα R H H Cα NH 2 R gauche (left) série L droite série D molécule chirale activité optique (= pouvoir rotatoire) (d, +) ou (l, -) = classification empirique, aucune application courante pour les acides aminés 12

- 20 acides aminés naturels entrent dans la composition des protéines = acides aminés protéinogènes - répartition en 3 classes selon la nature de la chaîne latérale (forme, charge, capacité à former des liaisons hydrogène, réactivité chimique ) - 9 acides aminés apolaires dans protéines, chaînes latérales orientées vers l intérieur - 6 acides aminés polaires neutres à ph physiologique - 5 acides aminés polaires chargés à ph physiologique dans protéines, chaînes latérales orientées vers l extérieur Rappel : polarité : due à un déséquilibre du nuage électronique dans la liaison chimique pôle électronégatif δ - sur un atome pôle électropositif δ + sur l autre atome possibilité d établir des liaisons H 13

20 ACIDES AMINÉS PROTÉINOGÈNES - 9 acides aminés apolaires - à chaîne aliphatique : glycine, alanine, valine*, leucine*, isoleucine* - à chaîne soufrée : méthionine* - à chaîne cyclique : proline - à chaîne aromatique : phénylalanine*, tryptophane* - 6 acides aminés polaires neutres à ph physiologique - à fonction alcool : sérine, thréonine*, tyrosine - à fonction soufrée : cystéine - à fonction amide : glutamine, asparagine - 5 acides aminés polaires chargés à ph physiologique - à fonction acide : acide glutamique, acide aspartique - à fonction basique : histidine (*), lysine*, arginine (*) * acides aminés indispensables (ou essentiels) : ne peuvent pas être synthétisés, doivent être apportés par l alimentation 14

20 ACIDES AMINÉS PROTÉINOGÈNES codes à 3 lettres ou à 1 lettre utilisés pour écrire les séquences protéiques! glycine Gly G méthionine Met M cystéine Cys C phénylalanine Phe F alanine Ala A proline Pro P glutamine Gln Q tryptophane Trp W valine Val V sérine Ser S asparagine Asn N histidine His H leucine Leu L thréonine Thr T acide glutamique Glu E lysine Lys K isoleucine Ile I tyrosine Tyr Y acide aspartique Asp D arginine Arg R 15

20 ACIDES AMINÉS PROTÉINOGÈNES synthèse des acides aminés difficile (à cause fonction -NH2) certains acides aminés proviennent exclusivement de l alimentation et ne peuvent être synthétisés = acides aminés indispensables (ou essentiels) - essentiels : leucine, thréonine, lysine, tryptophane, phénylalanine, valine, méthionine, isoleucine - semi-essentiels (indispensables chez l enfant) : histidine et arginine À retenir : (Hystérique), le très lyrique Tristan fait vachement méditer Yseult (en Argentine) (His) Leu Thr Lys Trp Phe Val Met Ile (Arg) 16

2.2.1. 9 acides aminés non polaires ou hydrophobes chaîne latérale : - peut être impliquée dans interactions hydrophobes - généralement orientée vers l intérieur des protéines 2.2.1.1. 5 acides aminés non polaires à chaîne latérale aliphatique aliphatique = non aromatique = pas de délocalisation d électrons (cf cours de chimie pour les définitions) + H 3 N + H 3 N + H 3 N + H 3 N glycine Gly, G alanine Ala, A valine * Val, V leucine * Leu, L isoleucine * Ile, I encombrement hydrophobicité - seul acide aminé optiquement inactif (pas de C*) - très peu encombrant grande flexibilité - C* supplémentaire (Cβ) Remarque : représentation des acides aminés à leur état d ionisation à ph physiologique 17

2.2.1. 9 acides aminés non polaires ou hydrophobes 2.2.1.2. 1 acide aminé non polaire soufré S - donneur de méthyle par réduction de la fonction thioéther (-S-) en fonction thiol (-SH) méthionine * Met, M 2.2.1.3. 1 acide aminé non polaire cyclique H N - α-amine engagée dans un cycle avec radical cycle pyrrolidine - seul acide aminé à ne pas posséder de fonction amine primaire (= amine secondaire) proline Pro, P - structure cyclique, pas de libre rotation autour de la liaison Cα-N très grande rigidité dans les chaînes peptidiques, angulation 18

2.2.1. 9 acides aminés non polaires ou hydrophobes 2.2.1.4. 2 acides aminés non polaires à chaîne aromatique + H 3 N + H 3 N NH phénylalanine * Phe, F tryptophane * Trp, W - cycles aromatiques : électrons π délocalisés forte absorption dans l UV à 280 nm - phényl dans phénylalanine : R = benzyle (= CH2 + phényl) hydrophobe - phénol dans tyrosine (cf acides aminés polaires) - indole dans tryptophane dosage des protéines en solution par spectrophotométrie, évaluation de la contamination d une solution d acides nucléiques par des protéines 19

2.2.2. 11 acides aminés polaires 2.2.2.1. 2 acides aminés polaires acides (chargés négativement à ph physiologique) acides aminés chargés : - très hydrophiles - impliqués dans des liaisons ioniques dans la structure 3D des protéines O pk R = 4,0 O - O O - pk R = 4,3 acide aspartique Asp, D acide glutamique Glu, E - acides aminés acides : fonction -COOH supplémentaire dans la chaîne latérale - acides plus faibles que α-cooh mais chargés négativement à ph physiologique charge nette négative de l acide aminé 20

2.2.2. 11 acides aminés polaires 2.2.2.2. 3 acides aminés polaires basiques (chargés positivement à ph physiologique) - fonction amine basique supplémentaire dans la chaîne latérale - chargée positivement à ph physiologique charge nette positive de l acide aminé NH N NH + HN NH fonction guanidinium H 2 N NH 2 + arginine lysine * Arg, R Lys, K pk R = 12,8 pk R = 10,8 NH 3 + histidine * His, H pk R = 6,0 ph 5,0 - à ph physiologique, His pas chargée sur sa chaîne latérale mais fonction amine ionisable - His : noyau imidazole très réactif, pkr très proche de ph physiologique état d ionisation varie en fonction environnement 21

2.2.2. 11 acides aminés polaires 2.2.2.3. 2 acides aminés polaires neutres à fonction amide O NH 2 O NH 2 asparagine Asn, N glutamine Gln, Q - dans glycoprotéines : Asn peut subir une modification post-traductionnelle = N-glycosylation (= ajout de sucre sur un atome N) - Gln à l état libre : rôle de transport et de mise en réserve de l ammoniac (déchet du métabolisme des acides aminés), très toxique pour l organisme 22

2.2.2. 11 acides aminés polaires 2.2.2.4. 3 acides aminés polaires neutres à fonction alcool ou phénol OH HO OH (pk R = 10,9) sérine Ser, S (alcool primaire) thréonine * Thr, T (alcool secondaire) tyrosine Tyr, Y (phénol) - Thr : C* supplémentaire (Cβ) Thr et Ile sont les seuls acides aminés naturels à posséder 2C* - Tyr : pkr = 10,9 non ionisée à ph physiologique - Tyr : aromatique absorbe dans l UV à 280 nm - dans les protéines, fonction alcool peut subir des modifications posttraductionnelles : - Ser et Thr : O-glycosylation (= ajout de sucre sur un atome O) - Ser, Thr et Tyr : phosphorylation 23

2.2.2. 11 acides aminés polaires 2.2.2.4. 3 acides aminés polaires neutres à fonction alcool ou phénol - phosphorylation = ajout d un groupement phosphate, catalysé par une protéine kinase groupement phosphate OH ATP ADP O O P O - kinase O - fonction alcool libre fonction alcool phosphorylée - déphosphorylation = retrait du groupement phosphate, catalysé par une phosphatase groupement phosphate O O P O - OH O O - phosphatase - O + P O - O - fonction alcool phosphorylée fonction alcool libre phosphate inorganique (Pi) phosphorylation / déphosphorylation régulation de très nombreuses protéines impliquées dans des voies de signalisation! 24

2.2.2. 11 acides aminés polaires 2.2.2.5. 1 acide aminé polaire neutre à fonction thiol (-SH) très réactive oxydation - OOC S S NH 3 + SH cystéine Cys, C (pk R = 8,3) SH HS réduction cystine - tous les acides aminés standards sont de configuration (2S) sauf cystéine (à cause numéro atomique) - pkr fonction thiol = 8,3 non ionisée à ph physiologique - fonction thiol très réactive formation de pont disulfure par oxydation de 2 fonctions thiol de 2 cystéines cystine pont disulfure S-S : - liaison covalente, forte - relie 2 chaînes ou parties de chaînes peptidiques participe au maintien de la structure 3D de certaines protéines - peuvent être rompus par des agents chimiques réducteurs : β-mercaptoéthanol 25

2.2.3. Ionisation des acides aminés 2.2.3.1. Rappels sur les couples acido-basiques - couple acido-basique caractérisé par une constante d acidité Ka : Ka AH A - + H + Ka = [A ].[H + ] [AH] - passage aux logarithmes décimaux : log Ka = log [H + ] + log [A ] [AH] ph = -log [H + ] pka = -log Ka - équation d Henderson-Hasselbach : proportion des différentes espèces en solution ph = pka + log [A ] [AH] Rappel : pka = ph de demi-neutralisation 26

2.2.3. Ionisation des acides aminés 2.2.3.1. Rappels sur les couples acido-basiques domaines de prédominance : proportion des différentes espèces en solution ph = pka + log [A ] [AH] ph < pka pka ph > pka ph log [A ] [AH] < 0 log [A ] [AH] = 0 log [A ] [AH] > 0 [A ] < [AH] [A ] = [AH] [A ] > [AH] 27

2.2.3. Ionisation des acides aminés 2.2.3.2. Notion de phi - acides aminés = espèces amphotères : - groupement acide α-cooh/α- pk1 2,1 - groupement basique α-nh3 + /α-nh2 pk2 9 H COOH C NH 2 R pk 1 = 2,1 pk 2 = 9 K 1 COOH + H + K 2 NH 3 + NH 2 + H + pk 1 = -log K 1 pk 2 = -log K 2-7 acides aminés protéinogènes possèdent un groupement ionisable supplémentaire sur leur chaîne latérale pkr associé - pour chaque fonction ionisable : - forme protonée pour ph < pk - forme déprotonée pour ph > pk prédiction de l état d ionisation en fonction du ph : domaines de prédominance sur échelle de ph 28

2.2.3. Ionisation des acides aminés 2.2.3.2. Notion de phi ACIDE AMINÉ À CHAÎNE LATÉRALE NON IONISABLE COOH H C NH 3 + H C NH 3 + H C NH 2 charge globale R R pk 1 pk 2 cation 2,1 zwitterion 9 anion + 0 - R ph - ph physiologique (7,4) : acides aminés doublement ionisés, sous forme de zwitterion zwitterion = forme neutre qui possède autant de charges positives que de charges négatives α-amine protonée, chargée positivement (NH3 +, ph < pk2) α-acide déprotoné, chargé négativement (, ph > pk1) 29

2.2.3. Ionisation des acides aminés 2.2.3.2. Notion de phi ACIDE AMINÉ À CHAÎNE LATÉRALE NON IONISABLE COOH H C NH 3 + H C NH 3 + H C NH 2 charge globale R R pk 1 pk 2 cation 2,1 zwitterion 9 anion + 0 - R ph - ph isoélectrique phi (ou point isoélectrique pi) = LE ph pour lequel la molécule a une charge électrique globalement nulle = somme algébrique de ses charges nulle = 1/2 somme des pk qui entourent la forme neutre phi = pk 1 + pk 2 2 acides aminés non ionisables 30

2.2.3. Ionisation des acides aminés 2.2.3.2. Notion de phi ACIDE AMINÉ À CHAÎNE LATÉRALE ACIDE : EXEMPLE DE L ACIDE ASPARTIQUE COOH H 2 N O O O O OH OH O - O - charge globale pk 1 pk R pk 2 + 2,1 0 4,1-9 2- forme zwitterion pour : - α-amine protonée, chargée positivement (NH3 +, ph < pk2) - α-acide déprotoné, chargé négativement (, ph > pk1) - acide chaîne latérale protonée et neutre (COOH, ph < pkr) phi = 1/2 somme des pk qui entourent la forme neutre phi = pk 1 + pk R 2 acides aminés acides 31

2.2.3. Ionisation des acides aminés 2.2.3.2. Notion de phi ACIDE AMINÉ À CHAÎNE LATÉRALE BASIQUE : EXEMPLE DE L ARGININE COOH H 2 N H 2 N NH NH NH NH H 2 N NH 2 + H 2 N NH 2 + H 2 N NH 2 + H 2 N NH charge globale 2+ pk 1 2,1 pk 2 pk R + 9 0 12,5 - forme zwitterion pour : - α-amine déprotonée et neutre (NH2, ph > pk2) - α-acide déprotoné, chargé négativement (, ph > pk1) - amine chaîne latérale protonée et chargée positivement (N +, ph < pkr) phi = 1/2 somme des pk qui entourent la forme neutre phi = pk 2 + pk R 2 acides aminés basiques 32

2.2.3. Ionisation des acides aminés 2.2.3.2. Notion de phi CAS SIMPLES : RÈGLE DES PK DOMINANTS - cas simples = acides aminés libres, peptides comprenant peu de fonctions ionisables molécules acides : phi = 1/2 somme des pk les plus faibles molécules basiques : phi = 1/2 somme des pk les plus forts! - cas plus complexes : dessiner échelle de ph et déterminer les domaines de prédominance des différentes espèces 33

2.2.3. Ionisation des acides aminés 2.2.3.3. Courbes de titration - obtenue par dosage des fonctions acides : ajout d équivalents HO - basiques ou dosage des fonctions basiques par ajout de H + (rarement utilisé en biochimie) - chaque acide aminé possède sa courbe de titration spécifique allure générale de la courbe pour un acide aminé non ionisable sur sa chaîne latérale : 2 fonctions ionisables Z = zwitterion A + = forme cationique A - = forme anionique 2-1 fonction ionisable 1 palier, pk au milieu du palier - phi = ph à l équivalence, point d inflexion - si fonction ionisable sur chaîne latérale 3ème palier (pour ph = pkr) 1 34

2.2.3. Ionisation des acides aminés 2.2.3.4. Pouvoir tampon - solution tampon = même quantité d acide faible et de sa base conjuguée - pourvoir tampon = capacité d une solution tampon à maintenir son ph à peu près constant, malgré l ajout d une quantité modérée d ions HO - ou H + - pouvoir tampon maximal à ph = pka 2.2.3.5. Solubilité dans l eau - tous les acides aminés possèdent α-, α-nh3 + polaires tous solubles dans l eau - chaînes latérales hydrophobes, aliphatiques encombrées (Leu et Ile) solubilité - solubilité dépend de l état d ionisation (donc du ph) : si charge, solubilité solubilité minimale pour ph = phi (charge nulle) utilité pour séparer et précipiter des protéines 35

2.2.4. Les 21ème et 22ème acides aminés standards - résidus rares découverts récemment - incorporés dans les protéines lors de la traduction, possèdent leur propre ARNt HSe O - - OOC H N N O NH 3 + O sélénocystéine Sec, U pyrrolysine Pyl, O - cystéine modifiée : S remplacé par Se - codon UGA - retrouvée chez tous les mammifères (site actif de la glutathion peroxydase) - décrite chez certaines archéobactéries 36

2.2.5. non constitutifs des protéines ou précurseurs de composés actifs - rôle important à l état libre, mais n entrent pas dans la composition des protéines - ornithine et citrulline : acides aminés libres qui participent à la synthèse de l urée (H2N-CO-NH2, forme d élimination de l azote chez l homme) - acides aminés biogènes = molécules biologiquement actives, beaucoup sont obtenues par décarboxylation (= perte de CO2) d acides aminés - exemples : - histamine impliquée dans réactions allergiques = décarboxylation de l histidine sur son Cα N H N histamine NH 2 37

2.2.5. non constitutifs des protéines ou précurseurs de composés actifs NH 3 + - tyrosine = précurseur du DOPA (ajout phénol) qui donne la dopamine par décarboxylation du Cα C H CH 2 C H CH 2 CO 2 CH 2 CH 2 dopamine psychoses dopamine maladie de Parkinson OH OH OH OH OH tyrosine DOPA dopamine NH 3 + OH C H CO 2 C H C H CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 - acide glutamique = précurseur du GABA Glu acide γ aminobutyrique (GABA) neuromédiateur GHB drogue des violeurs GHB = anesthésiant utilisé en milieu hospitalier depuis 40 ans 38

Séparation selon la charge Biotech 1-2016-2017 Séparation selon la taille 2. LES ACIDES AMINÉS Séparation par adsorption spécifique 2.3. Méthodes de séparation et d analyse des acides aminés 2 grandes techniques de séparation des acides aminés en solution : - chromatographie - électrophorèse 2.3.1. Chromatographies - sur colonne ou papier, même principe 9-2 phases : - phase stationnaire (gel, résine, silice, papier, ) l'extrémité inférieure de la colonne. - phase mobile (liquide, gaz) Un détecteur enregistre l'absorbance de la solution en sortie de colonne à u déterminée. Il permet de détecter les protéines : un profil laquelle d'élution eston le plus choix des phases en fonction de la propriété physico-chimique selon temps réel sur un enregistreur. cherche à séparer (charge, masse, polarité, affinité) Chromatographie échangeuse d! ions échantillon : ± adsorbé sur phase stationnaire ± entraînée le long de la phase stationnaire par la phase mobile colonne de chromatographie tampon d élution Tampon mobile) d élution (phase (phase mobile) échantillon échantillon billes Billes fonctionnalisées fonctionnalisées (phase (Phase fixe) fixe) Chromatographie de filtration sur gel = séparation basée sur différence d affinité vis-à-vis de Les trois grands types de chromatographie l une ou l autre des 2 phases 6 5 4 3! 2 1 utilisés pour purifier les protéines 6 5 4 3 2 1 39 T ( é

2.3. Méthodes de séparation et d analyse des acides aminés 2.3.1. Chromatographies CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE SUR COUCHE MINCE = SÉPARATION SELON POLARITÉ - échantillon déposé sur phase stationnaire polaire (silice greffée ) bonne affinité des acides aminés polaires, s accrochent - phase mobile = mélange de solvants plus ou moins apolaires entraîne les acides aminés apolaires lors de son déplacement par capillarité le long de la phase stationnaire - molécules polaires : bonne affinité pour phase stationnaire peu entraînées par phase mobile - molécules apolaires : moins d affinité pour phase stationnaire très entraînées par phase mobile 40

Séparation selon la charge Biotech 1-2016-2017 Séparation selon la taille 2. LES ACIDES AMINÉS Séparation par adsorption spécifique 2.3. Méthodes de séparation et d analyse des acides aminés 2.3.1. Chromatographies CHROMATOGRAPHIE ÉCHANGEUSE D IONS = SÉPARATION SELON LE PHI (CHARGE) - phase stationnaire : groupements chargés retiennent les molécules de charge opposée, les autres sont éluées 9 - élution en faisant varier le ph les molécules qui atteignent leur phi deviennent non chargées et sont éluées - l'extrémité inférieure de la colonne. Un détecteur enregistre l'absorbance de la solution en sortie de colonne à une lon ou élution en augmentant la force ionique de l éluant déterminée. Il permet de détecter les protéines : un profil d'élution est le plus souven déstabilisation des interactions entre molécules et la colonne temps réel surles un enregistreur. Chromatographie échangeuse d! ions chromatographie échangeuse de cations : - chargée négativement - retient les cations - séparation selon les phi croissants colonne de chromatographie tampon d élution Tampon mobile) d élution (phase (phase mobile) échantillon échantillon billes Billes fonctionnalisées fonctionnalisées (phase (Phase fixe) fixe) chromatographie échangeusechromatographie d anions : de filtration sur gel - chargée positivement - retient les anions Les trois grands types de chromatographie - séparation selon les phi décroissants 6 5 4 3 2 1! utilisés pour purifier les protéines 6 5 4 3 2 1 Tampon d é (phase mob 41 échantillon

2.3. Méthodes de séparation et d analyse des acides aminés 2.3.2. Électrophorèses - support solide fibreux ou poreux (papier, gel) imprégné d un tampon à ph donné - migration sous l effet d un champ électrique à ce ph donné : - acides aminés chargés (+ ou - selon nature de l acide aminé) migrent vers la borne de charge opposée si ph < phi : charge apparente positive migration vers la cathode si ph = phi : charge apparente nulle pas de migration si ph > phi : charge apparente négative migration vers l anode dépôt + - Anode 1 2 3 4 Cathode 1 = Asp 2 = Val 3 = His 4 = Arg À retenir : lors d une électrophorèse - les anions migrent vers l anode (borne +) - les cations migrent vers la cathode (borne -) 42