TECHNIQUE ET UTILISATION DES DIFFERENTS TYPES DE MICROSCOPES Le microscope en champ clair est le microscope optique le plus courant et le plus ancien. TECHNIQUE DU MICROSCOPE EN CHAMP CLAIR Le microscope en champ clair, à l opposé du microscope à fond noir, permet de recueillir la lumière de la source directement dans les objectifs, après avoir été transmise par l échantillon. Celui-ci est éclairé par-dessous et observé par-dessus. Bien que la préparation des échantillons soit peu contraignante, cette technique est limitée par un faible contraste et une faible résolution. On peut améliorer l observation en colorant les échantillons. UTILISATION DU MICROSCOPE EN CHAMP CLAIR Ce microscope peut être utilisé pour visualiser des objets vivants variés (bactéries, unicellulaires ) ou fixés (coupes histologiques ). Le microscope en fluorescence fait partie de la grande famille des microscopes optiques. TECHNIQUE DU MICROSCOPE EN FLUORESCENCE La fluorescence est la propriété que certains corps ou molécules ont à émettre une lumière après avoir été excités avec une lumière d énergie supérieure. Ainsi, un objet excité par une longueur d onde émettra une fluorescence à une longueur d onde supérieure. La technique du microscope en fluorescence est donc la même qu un microscope optique, sauf que la lumière utilisée n est pas blanche, mais possède une gamme définie de longueur d onde. Toutefois, en général, la lumière arrive sur l échantillon par le haut (épi-fluorescence) et non par-dessous. À l émission, on peut alors utiliser des lasers possédant une longueur d onde unique ou des filtres d excitation ne laissant passer que la lumière de longueur d onde désirée sur l échantillon. Après excitation de l échantillon, celui-ci émet à son tour une lumière d une longueur d onde différente. On peut utiliser des filtres permettant de n observer que la longueur d onde désirée, c'est-à-dire les photons d émission, et bloquer les photons d excitation. 1
Utilisation du microscope en fluorescence Le microscope en fluorescence permet de visualiser des objets qui sont naturellement fluorescents (chlorophylle...), ou des molécules rendues fluorescentes pour mieux les observer (protéines couplées à la GFP, DAPI pour l ADN, fluorochromes ). Des techniques utilisant cette microscopie ont été développées : immunofluorescence (marquage à l'aide d'un anticorps couplé à un fluorochrome) ; FISH ou hybridation fluorescente in situ pour marquer des séquences nucléotidiques grâce à des oligonucléotides couplés à des fluorochromes ; MICROSCOPE EN LUMIERE POLARISEE Le microscope en lumière polarisée est un microscope optique, surtout utilisé pour observer les minerais. TECHNIQUE DU MICROSCOPE EN LUMIERE POLARISEE Le microscope en lumière polarisée est un microscope optique dont la technologie repose sur l utilisation d un faisceau de lumière polarisée (des ondes vibrant dans un seul plan). Pour assurer la polarisation de la lumière, un polarisateur est placé après la source de lumière, avant l échantillon. Le deuxième polarisateur, appelé l analyseur, est placé perpendiculairement au premier et ne peut donc pas laisser passer la lumière premièrement polarisée. Par contre, un échantillon placé entre les deux polarisateurs perturbe le faisceau lumineux qui va adopter de nouvelles vibrations dont certaines vont pouvoir traverser l analyseur. Suivant la particularité de la lumière reçue, il est possible de déterminer la composition de l échantillon observé. UTILISATION DU MICROSCOPE EN LUMIERE POLARISEE Le microscope en lumière polarisée permet d observer et d identifier des minéraux de roche. La préparation du minéral consiste en la section d une tranche fine et d un polissage pour atteindre une épaisseur d environ 30 micromètres. MICROSCOPE INVERSE Le microscope inversé est un microscope optique dont l échantillon est illuminé par le dessus et observé par en dessous. 2
TECHNIQUE DU MICROSCOPE INVERSE À l inverse de la microscopie optique classique où la lumière arrive sur l échantillon par le bas et où l observation se fait par le dessus, pour le microscope inversé la source de lumière est placée au-dessus de l échantillon et les objectifs en dessous. Cette configuration non-standard d observation peut être adaptée à toutes les méthodes de microscopie (fluorescence, contraste de phase ). UTILISATION DU MICROSCOPE INVERSE Ce microscope est beaucoup utilisé pour l observation de cellules en culture in vitro, mais peut l être en général pour observer des objets épais ou situés sur le fond de boîtes de pétri. MAINTENANCE Les opérations les plus importantes pour maintenir un microscope en bon état de fonctionnement sont, entre autres : 1. Vérifier l ajustement de la platine mécanique (platine porte-objet). 2. Elle doit se déplacer selon les deux axes X et Y et garder la position choisie par l opérateur. Tester le mécanisme de mise au point. Le foyer choisi par l opérateur doit rester stable. La hauteur doit rester celle choisie par l opérateur. 3. Vérifier le fonctionnement du diaphragme. 4. Nettoyer tous les éléments mécaniques. 5. Lubrifier le microscope selon les recommandations du fabricant. 6. Vérifier l ajustement des clips porte-lames. 7. Vérifier l alignement optique. PRECAUTIONS Eviter de nettoyer les éléments optiques avec de l éthanol car cela les endommagerait. Ne pas non plus nettoyer la base de la platine avec du xylène ou de l acétone. 2. Ne pas utiliser du papier ordinaire pour nettoyer les lentilles car cela pourrait les rayer. 3. Pour éviter de laisser des traces de doigts, ne pas toucher les lentilles avec les doigts nus. 3
4. Ne pas nettoyer les lentilles des oculaires ou des objectifs avec du tissu ou du papier car cela pourrait endommager le revêtement protecteur de ces éléments optiques. Nettoyer ces surfaces avec un pinceau en poil de chameau ou en soufflant de l air avec une poire en caoutchouc ou un mouche-bébé. 5. Eviter de laisser le microscope sans les oculaires. Mettre les capuchons de protection de ces derniers pour empêcher la poussière et les particules de pénétrer dans la tète binoculaire. 6. Ne pas laisser le microscope range dans une boite lorsque l environnement est humide. 7. Eviter d appuyer l objectif contre les lames car cela pourrait endommager la lamelle couvre-objet ou la lentille frontale de l objectif. Faire la mise au point lentement et soigneusement. 8. Faire en sorte que la platine reste propre. 9. Ne pas démonter les éléments optiques car cela pourrait fausser l alignement. Les surfaces optiques doivent être d abord nettoyées avec un pinceau en poil de chameau puis avec une peau de chamois ou un papier optique. 10. Utiliser les deux mains pour soulever le microscope, l une tenant le bras du microscope et l autre son socle. 11. Eviter de toucher l ampoule avec les doigts lors de son remplacement. Les traces de doigts diminuent l intensité lumineuse. 12. Vérifier que la tension d alimentation est correcte, afin de prolonger la durée de vie de l ampoule. Si possible, utiliser la plus faible intensité lumineuse nécessaire pour faire les observations. 13. Raccorder le microscope a un stabilisateur de tension si le voltage n est pas stable ENTRETIEN COURANT DU MICROSCOPE Fréquence : tous les jours (après utilisation) 1. Nettoyer l huile a immersion de l objectif 100X. Utiliser du papier optique ou, a défaut, du coton hydrophile. 4
2. Nettoyer la platine porte-objet. 3. Nettoyer le condenseur. 4. Mettre le rhéostat de réglage de l intensité lumineuse sur le minimum et éteindre le système d éclairage. 5. Couvrir le microscope d une housse (en plastique ou en tissu). S assurer que le microscope se trouve dans un endroit bien ventile, ou la température et l humidité sont contrôlées. 5