N.N. Maxime Brice I am the author of this document 07/11/13 11:57:50 Plan du devoir Introduction I- Action du ph sur la catalyse enzymatique II- Influence du ph sur la cinétique enzymatique III- Cas de ph extrêmes Conclusion Références 1
INTRODUCTION La cinétique enzymatique a pour objet d'identifier et de décrire les mécanismes des réactions biochimiques, catalysées par les enzymes (réaction enzymatique), en étudiant leur vitesse c'est-à-dire leur évolution en fonction du temps. La réaction se déroulant toujours dans un milieu (l eau habituellement), celui-ci est susceptible d influencer la réaction par les substances qu il renferme (effecteurs), mais aussi par ses caractéristiques que sont la température et le ph. Ces conditions liées au milieu agissent sur les paramètres cinétiques faisant varier la vitesse de la réaction, et donc l activité enzymatique. Dans le cadre notre étude,nous allons nous limiter à l étude de l influence du ph sur la cinétique enzymatique. 2
I- Action du ph sur la catalyse enzymatique Dans une réaction enzymatique, le ph peut agir sur plusieurs facteurs : l'ionisation du substrat et / ou du produit la structure des protéines : donc la stabilité de l'enzyme la liaison du substrat à l'enzyme l'activité catalytique de l'enzyme Ceci explique que, expérimentalement, les réactions doivent se faire en milieu tamponné, donc avec un ph constant pendant toute l'expérience. Le ph peut aussi jouer sur l'ionisation du substrat et/ou du produit. Dans ce cas, une étude préalable s'impose si l'état d'ionisation modifie les caractéristiques spectrales du composé que l'on dose lors de la cinétique. En d'autres termes, lorsque l'on utilise un composé chromophore, il faut, au préalable à toute mesure cinétique, savoir s'il y a ou non modification du coefficient d'absorption moléculaire (ε) du composé avec le ph. Quant à la stabilité de l'enzyme en fonction du ph, elle est évaluée dans une expérience contrôle qui consiste à pré incuber l'enzyme seule dans des solutions tampons de ph différents, puis elle est incubée dans la solution tampon d'étude en présence cette fois du substrat : cette expérience contrôle permet de voir les inactivations irréversibles de l'enzyme. I- Influence du ph sur la cinétique enzymatique Les mesures de nombreuses activités enzymatiques en fonction du ph donnent des courbes qui passent par un maximum, montrant ainsi l'existence d'un ph optimum. On peut schématiser tous ces résultats sous une forme régulière idéalisée de courbe en cloche comme dans la figure ci-dessous. Courbe de vitesse en fonction du ph 3
Cette forme de courbe est reliée à l'état d'ionisation de certains résidus d'acides aminés qui se trouvent dans un état d'ionisation précis indispensable à l'activité enzymatique. Au sommet de la courbe en cloche, l'enzyme a une activité maximale : elle est à son ph optimum de catalyse. La théorie simplifiée qui permet d'expliquer l'existence d'une activité enzymatique qui passe par un maximum en fonction du ph de la solution est la suivante : il existe dans le site catalytique de l'enzyme, deux acides aminés ionisables qui participent à la catalyse. Pour qu'il y ait catalyse, il faut que ces deux acides aminés se trouvent dans des états d'ionisations inversés : un protoné l'autre déprotoné. Ce modèle implique que l'enzyme existe sous trois formes, en ne considérant que ces deux acides aminés. Les charges ne sont pas représentées car les groupements ionisables peuvent aussi bien être des acides carboxyliques que des bases azotées protonées: EH 2 : les deux acides aminés sont protonés E : les deux acides aminés sont déprotonés EH : un acide aminé est protoné, l'autre déprotoné C'est dans la forme EH que les deux acides aminés se trouvent dans des états d'ionisations inversés : un protoné et l'autre déprotoné. C'est la forme active de l'enzyme. Le schéma réactionnel est le suivant : Schéma réactionnel en fonction du ph Seule la forme EH est capable de lier le substrat et de le transformer en produit. K 1 et K 2 sont les constantes d'acidité des chaines latérales des acides aminés impliqués dans la catalyse. En fait, expérimentalement, pour étudier le comportement catalytique d'une enzyme en fonction du ph, nous travaillons essentiellement avec une concentration saturante en substrat. On mesure donc un V M app : c'est un V M mais qui n'est qu' apparent,: c'est la vitesse la plus grande mesurable au ph considéré. 4
Equations utilisées : Conservation de l enzyme : ( E ) T = ( E ) + ( EH ) + ( EH 2 ) (1) Constante de formation de EH K 1 = ( EH ) ( H + ) / ( EH 2 ) (2) K 2 = ( E) ( H + ) / ( EH ) (3) Expression de V M V M = k 2 ( E ) T (4) cette valeur n'est en fait jamais atteinte puisque l'enzyme n'est jamais totalement sous sa forme EH: EH<( E )T Expression de la V M apparente V Mapp = k 2 ( EH ) (5) Résolution des Equations : D après (2) on tire ( EH 2 ) = ( EH ) ( H + ) / K 1 D après (3) on tire ( E) = ( EH ) K 2 / ( H + ) D après (1) on tire ( E ) T = { 1+[ ( H + ) / K 1 ] + [K 2 / ( H + ) ] } ( EH ) En remplaçant dans (5) on obtient: V Mapp = [ k 2 ( E ) T ] / { 1 + [ ( H + ) / K 1 ] + [ K 2 / ( H + ) ] } Soit: Que l'on peut exprimer aussi par: Afin de déterminer la valeur du ph optimum, nous devons regarder la courbe : le ph optimum de catalyse se trouve au sommet de la courbe : elle passe par un maximum donc sa 5
dérivée première s annule en ce point. Nous allons dériver l expression ci dessus par rapport à la concentration en protons : d(v M / V Mapp ) / d ( H + ) = ( 1 / K 1 ) - [ K 2 / ( H + )² ] = 0 ( H + )² = K 1 K 2 ph opt = ( pk 1 + pk 2 ) / 2 du ph optimal quand 2 groupes sont ionises. Pour la plus part des enzymes, le ph optimal se situe entre 6 et 8, il s'agit Au ph optimum, l'activité est maximale. Pour la plus part des enzymes, le ph optimal se situe entre 6 et 8, il s'agit du ph. Toutefois il existe certaines enzymes comme qui on leur ph optimum acide (comme la pepsine, entree 2 et 3) ou basique (comme la phosphatase alcaline, entre à 10). De plus, Il est possible de déterminer les valeurs du pk d'une enzyme en portant le pk M (= log K M ) de l'enzyme en fonction du ph (Fig.3) Figure 3. Variation du pkm en fonction du ph. Le sommet de la courbe correspond au ph optimal. 6
II- Cas particulier des ph extrêmes Pour avoir une idée, même approchée, de la nature des acides aminés impliqués dans la catalyse, dont la dissociation doit être inverse l'un de l'autre, il est intéressant de connaitre les valeurs des pk des chaînes latérales. Pour comprendre comment opérer, prenons des valeurs de pk 1 et pk 2 différentes. Supposons que: pk 1 = 6 et pk 2 = 8 soit K 1 = 10-6 M et K 2 = 10-8 M Donc: ph optimum = ( pk 1 + pk 2 ) / 2 = 7 Nous allons envisager deux conditions extrêmes : le cas des ph très acides (où nous allons démontrer que la forme E est négligeable devant les autres formes) et le cas des ph très basiques (où c'est la forme EH 2 qui est négligeable) Aux ph très acides : ph < 6 donc ( H + ) > 10-6 M; 10-5 M par exemple K 2 / ( H + ) = 10-3 D'où : K 2 / ( H + ) << 1 et ( E - ) << ( EH ) ( H + ) / K 1 = 10 D'où : ( H + ) / K 1 >> 1 A ph très acides, le rapport des vitesses s'écrit : V M / V Mapp = ( H + ) / K 1 et: log V Mapp = ph + log K 1 + log V M En traçant log ( V Mapp ) = ph, on doit obtenir une droite de pente +1 et d'intercept = logk 1 V M Avec un raisonnement similaire aux ph très basiques, nous trouverons l'équation : log V Mapp = - ph - log K 2 + log V M En traçant log ( V Mapp ) = ph, on doit obtenir une droite de pente -1 et d'intercept = log V M / K 2 7
En utilisant les des deux intercepts de ces droites ainsi que l'équation générale au ph optimum, il est facile d'en déduire les valeurs individuelles de K 1 et K 2. Il faudra, par la suite, vérifier ces résultats en utilisant par exemple des réactifs covalants de ces acides aminés et voir si l'addition de ces réactifs, dans le milieu réactionnel, inhibe l'activité catalytique de l'enzyme. 8
Conclusion La cinétique enzymatique est tres dépendante des conditions du milieu, et notamment du ph. En effet, le ph en agissant sur l ionisation du produit ou du substrat, sur la stabilité de l enzyme, influence l activité catalytique de l enzyme, modifiant donc ainsi la cinétique de la réaction. L activité de l enzyme varie avec la valeur du ph. Pour la plus part des enzymes, il y a dénaturation et précipitation au ph très acides, dénaturation sans précipitation au ph très basiques. L activité de l enzyme est maximale à un ph précis. C est le ph optimal. Le ph optimal varie d une enzyme à l autre mais ce situe pour la plus part entre 6 et 8. 9
Références 1- www-lemm.univ-lille1.fr/biologie/biochim/co/ch2_04.html 2- fr.wikipedia.org/wiki/cinétique_enzymatique 3- fdanieau.free.fr/cours/bts/a2/.../actiondelatemperatureetduph.pdf 4- btsbiochimie.free.fr/cours/mod.doc 10