Compte-rendu réunion WP 2.7.2 Mardi 30/06/2015 de 10h à 16h30 Organisateurs/Coordinateurs: Guy Perrière et Claudine Médigue Participants (22) GENOSCOPE : Sébastien Faye, Quentin Cadarec, Eric Pelletier MICROSCOPE : Stéphane Cruveiller, Marine Séjourné, Alexandra Calteau, Claudine Médigue PRABI : Christine Oger, Jean François Taly, Guy Perrière PACA_Bioinfo : Damien Desmarais, Olivier Poirot CBiB : Aurélien Barre LIRMM : Vincent Lefart, Anne-Muriel Chifolleau MetaGenoPolis : Nicolas Pons, Ndeye Aram, Amine Ghozlane INRIA/Irisa: Dominique Lavenier, Gaetan Benoit MIGALE: Jean François Gibrat GeneOuest/Roscoff: Christophe Caron (après midi) Introduction Tour de table Contenu de la journée (C. Médigue) Exposé 1 Metagenomics: Building a taxonomic markers collection Jean François Taly (PRABI) Au cours de la première tranche de CDD accordée par France Génomique, François Bartolo (IE) et Clément Lionnet (étudiant M1) ont développé un prototype de pipeline d assignation taxonomique qui a été présenté au cours de la réunion de l année dernière. Ces développements ont constitué le point de départ des travaux de l actuel CDD, Jean-François Taly. Dans un premier temps, présentation de lebibi QBPP, un système d identification taxonomique dédié aux bactéries et aux archées et fondé sur l utilisation de critères phylogénétiques (https://umr5558-bibiserv/lebibi/lebibi.cgi). Ce système permet de construire des phylogénies «à la volée» à partir de différents marqueurs (ARNr 16S, rpob, reca, etc.) et il s affranchit donc de l utilisation d une banque de données contenant des séquences préalignées. Les étapes sont : i) une recherche de similarité au moyen de BLAST ; ii) la récupération d un sous-ensemble de séquences homologues puis leur alignement au moyen de MAFFT ; iii) la construction d une phylogénie au moyen de FastTree. Le séquence requête est affectée à la séquence ou au groupe de séquences le plus proche du point de vue de la distance patristique (Diapo. 5). Il est possible d utiliser le service sur données provenant d un séquenceur de type MiSeq (7 sec. pour une identification, les accès disques constituant la partie limitante du processus). Objectif du travail Construction d une base de données de référence qui soit représentative de la diversité taxonomique des procaryotes puis utilisation des développements déjà réalisés qui seront encapsulés dans Galaxy. Une bonne assignation taxonomique dépend en effet 1
de la représentativité de la base de données utilisée. Une base de départ peut être représentée par la banque taxonomique du NCBI. Le problème est que le code de nomenclature utilisé par le NCBI contient un certain nombre d erreurs ou d incohérences. Le bilan, en termes d espèces recensées, est de 13 625 pour les bactéries, (seulement) 533 pour les archées et 312 932 pour les eucaryotes! Par ailleurs, le problème avec les séquences provenant de GenBank est qu une proportion importante d entre elles contiennent des annotations erronées, en particulier au niveau taxonomique. C est ainsi qu une séquence annotée comme appartenant au genre Streptococcus dans GenBank s est en fait avérée provenir d un Psychrobacter selon lebibi QBPP. Pour indiquer les problèmes éventuels, GenBank utilise le tag UNVERIFIED au niveau du nom d espèce / de souche. Le caractère permanent des erreurs d annotations taxonomique est en particulier lié au fait que seules les personnes ayant effectué le dépôt d une séquence dans GenBank ont le droit d effectuer des corrections et ceci depuis la mise en place de cette collection. Une solution est d utiliser la banque RefSeq dans laquelle les erreurs d assignation sont corrigées et ou une séquence représentative pour chaque type de souche est définie. Le problème est que RefSeq ne couve qu une petite partie des séquences de GenBank. Mise en place d une banque de données d ARNr 16S Pour l instant, les différentes banques d ARNr 16S utilisée par lebibi QBPP sont mises à jour tous les six mois et l objectif est de parvenir à automatiser suffisamment le processus afin d avoir une MàJ par semaine. En effet, lebibi QBPP utilise non pas une mais plusieurs banques construites en fonction de la «stringence» taxonomique. La banque la plus stringente contient ainsi une seule séquence (séquence «type») par espèce. Dans le pipeline de construction en cours de développement, les séquences sont sélectionnées dans GenBank et RefSeq à l aide du système ACNUC. Le programme CD-HIT est ensuite utilisé en deux temps pour : i) effectuer une déréplication des séquences ; puis ii) pour construire des clusters à 80 %. Les séquences de chaque cluster sont ensuite alignées avec MAFFT et un arbre est construit avec FastTree. Chaque arbre est ensuite parsé afin de créer des groupes. Un nœud de l arbre constitue un groupe si la médiane des distances patristiques séparant les différentes feuilles de l arbre est < 0,01 (distance GTR+ 4 ) et si le support alrt > 0,90. Dans le cas de séquences qui ne se placent dans aucun groupe, l hypothèse la plus parcimonieuse est que ce sont des erreurs de séquençage. Exemple : Streptococcus agalactiae, séquence JX154576 qui «part à l ouest» car annotation du taxon erronée (il s agit en fait d une Psychrobacter). Conclusions Perspectives Il faut désormais en théorie moins d une nuit pour mettre à jour la base de données de taxonomie. D un autre côté, les annotations ne sont pas toujours mises à jour aussi régulièrement (besoin de développer une procédure automatique). Il est envisagé d utiliser le cloud IFB pour réaliser une partie des calculs car le cluster n est pas approprié du fait de la façon dont sont gérées les files d attente. Enfin, il reste de nombreux problèmes concernant la taxonomie du NCBI pour les eucaryotes (notamment chez les champignons). 2
Exposé 2 Assignation taxonomique et détection de chimères dans les données génomiques complexes et les métagénomes: prototype d'un outil interactif Damien Desmarais (IGS/PACA-Bioinfo) Développement d un outil de fouille de données métagénomique permettant de détecter des chimères afin de corriger les erreurs d assignation taxonomique. Problématique Porte sur l analyse de données de séquençage de cellules uniques bruitées et de métagénomes. Dans le premier cas, exemple d une séquence de virus géant du lac Washington aux USA faussement annotée comme une séquence d archée. Pipeline et interface graphique Suit une description du pipeline de traitement des données permettant d effectuer une assignation taxonomique sur l ensemble des contigs analysés pour application aux microbiomes environnementaux. A partir des contigs : i) prédiction de gènes avec MetaGeneMark, ou l option «Virus» de GeneMark ; ii) recherche de similarités avec BLASTP ; iii) assignation taxonomique. Le pipeline est écrit écrit en Perl, avec de nombreuses bibliothèques appelées et des liens entre les langages de programmation utilisés pour les différentes briques. Utilisation du format SVG pour les graphiques. Sont ensuite présentées des captures d écran montrant les différentes étapes de la réalisation d une analyse. Question : pourquoi passer par la séquence protéique pour faire de l assignation taxonomique (plus rapide MAIS moins sensible que le nucléique)? Conclusions Le traitement des données prend 25 min pour annoter les 505 ORFs. Réflexion en cours pour la mise à disposition de ce service : TGCC ou Cloud IFB? Uniquement en local? Exposé 3 Simka: méthode rapide pour estimer la similarité entre de nombreux échantillons métagénomiques Gaëtan Benoit (IRISA, ANR Hydrogen) Le point de départ de Simka c est une matrice de similarité entre deux échantillons métagénomiques: un clustering est présenté sous forme de dendogramme pour voir quel échantillon est proche de quel autre. TARA : 200 sites plusieurs profondeurs 4000 échantillons au total. Problématique Comment estimer la similarité entre deux échantillons à partir de l ensemble des lectures de chaque métagénome? Avec 100 millions de lectures une approche de type BLAST mettrait des mois pour calculer l intersection. L outil, publié en 2014, utilise sur les k-mer et calcul les intersection en quelques heures. La taille des mots utilisés doit être k 30 au minimum pour que ce soit pertinent. Simka Le programme utilise une fonction basée sur les k-mers partagés et les mesures de similarités proposées sont la Jaccard similarity et l abondance based Jaccard similarity. Pour le comptage des k-mers sur N échantillons, utilisation de KMC2 (Deorowicz et al., 2014). Puis mesure de présence absence en transformant en 3
booléen. Le test sur 21 échantillons de TARA nécessite 4h de calcul avec Simka (valeur pour la présence/absence de k-mers et pour l abondance des k-mers). Questions Problème de validation car on ne sait pas vraiment quels résultats on doit avoir. Tout ce que l on sait pour l instant est que ça colle en général avec ce que l on connaît des échantillons (leur provenance?) Une possibilité serait de passer par des simulations. Les seuils sont très stringent donc on voit des parties très fortes du signal. Beaucoup de configurations ont été testées au niveau de la longueur des k-mers (on retrouve partout des k-mers de trop petites tailles). Comparaison des matrices : pas de formules mathématiques pour l instant c est visuel. Simka tourne au CCRT. Remarque sur le fait que la bibliothèque GATB est aussi très efficace. Perspectives Quelques k-mers par read devraient suffire pour avoir les mêmes résultats. Exposé 4 BigData accelerated computing in R : an application in metagenomics Ndeye Aram GAYE (MetaGenoPolis) Qu est-ce que le big data? Cette appellation, à la fois ambiguë et vague, implique des concepts variés touchant au volume, la vélocité (fréquence de production), la variété, la véracité, la complexité. Il existe des solutions aussi bien au niveau matériel (tout ce qui touche au High Performance Computing HPC) que logiciel (Message Passing Interface MPI, Hadoop, Spark). Les données en génomique sont désormais du big data. Un exemple : une matrice de comptage sur un catalogue de gènes peut comprendre 10 000 gènes et 1000 ou plus individus et 3000 échantillons de ce type peuvent être produits par an, soit 200 Tb de données. Pour traiter les données de génomique, il existe des bibliothèques R, qui est un langage répandu et relativement facile à utiliser mais qui est interprété et donc lent. La bibliothèque MetaOMiner a ainsi été développée à MetaGenoPolis. Cette bibliothèque comprend deux niveaux : un pour le préprocessing (normalisation, etc) et un pour le processing (comptage de gènes, clustering, etc.) des données. Les demandes des utilisateurs, sont donc de faire des analyses big data sous R sans changer les habitudes, mais ce langage n est pas fait pour ça! Une première solution trouvée pour répondre aux besoins des utilisateurs a consisté en le développement d un langage de programmation spécifique au domaine de la métagénomique : DSL. Par ailleurs, mise en place du projet Mach (Massive calculations on heterogeneous systems). Il s agit d un projet européen de trois ans dont l objectif est de transformer du code R en binaire exécutable. Plusieurs cibles architecturales sont envisagées (Clusters de calcul, Cloud computing, etc.) Parmi les développements en cours figure la mise en place de la bibliothèque R Megapack, codée en C. Par ailleurs, la bibliothèque PARConnector permet de faire du HPC facilement via la soumission à un scheduler. Enfin, la bibliothèque gpustat est consacrée à la distribution des données sur des systèmes à base de GPU. 4
Exposé 5 Développements bioinformatiques pour l'analyse de données métagénomiques AMALGAM, vers un outil d'assemblage automatique Stéphane Cruveiller et Marine Séjourné (LABGeM/PF MicroScope) Tout d abord un point est fait sur le pipeline DIGEST déjà présenté en 2014. L objectif de ce pipeline est de compléter les gènes partiels (soit 56 %) du catalogue du microbiome intestinal humain à partir des données de séquence de capture. Un rappel est effectué sur la stratégie de séquençage par capture ainsi que sur la stratégie d analyse du pipeline développé (Diapos. 7 à 10). Suit une présentation des résultats obtenus à l issue du départ du premier CDD (Arnaud Felten). L analyse de sept individus (sur les 50 de départ) a permis de compléter plus de deux millions de gènes du catalogue soit 25 % des gènes initialement incomplets. Le pipeline est fonctionnel, déployé au CCRT, et disponible à la communauté. L analyse des 43 individus restants devrait être réalisée dans le courant de l année 2016. Travailler aussi avec les assemblages initiaux aussi pour s affranchir des chimères. La deuxième partie de l exposé est tout d abord consacrée à la présentation d un état de l art sur les assembleurs de génomes et de métagénomes. A la première place en termes de nombre de citations, on trouve Velvet et son complémentaire MetaVelvet, dédié aux métagénomes (trois publication en 2008, 2012 et 2015). En deuxième position se trouve ABySS (publication en 2009). Lorsque l on regarde les approches utilisées par les différents programmes il apparaît que l assemblage brut des données de métagénomes est très difficile car les données sont hétérogènes. Suit une présentation d AMALGAM (Automatic MicrobiAL Genome Assembler), un pipeline développé au LABGeM et basé sur l assembleur commercial Newbler de 454 Roche LifeSciences). Ce système permet d améliorer la finition du génome grâce à l utilisation de l outil GapCloser provenant de la bibliothèque SOAP. Qui plus est, il permet de réaliser des statistiques d assemblage via QUAST (Quality Assessment Tool for Genome Assemblies). Une comparaison de ABySS et Newbler montre que ce dernier est plus long mais propose des résultats nettement meilleurs. Le problème est que Newbler est un produit commercial. Pour finir la plateforme SynBioWatch dédiée à la détection détecter et l identification des agents pathogènes dans un échantillon métagénomique est présentée. Cette plateforme permet non seulement de faire de l assignation taxonomique mais aussi de détecter des gènes de résistance aux antibiotiques et de virulence et/ou des toxines. SynBioWatch a été déployée au sein du cloud IFB sous la forme d une Machine Virtuelle. Exposé 6 Méthodes d analyses à grande échelle des métatranscriptomes eucaryotes dans le projet TARA Océans Quentin Carradec (Genoscope) L approche métatranscriptome permet d assembler les données de séquence plus facilement, et la prédiction de gènes n est pas nécessaire. Le but de l analyse présentée consiste en la création d un catalogue d unigènes (beaucoup de gènes sont fractionnés). Une fois ce catalogue établit, on calcule les occurrences des unigènes pour avoir une idée de l abondance de chaque gène par échantillon. 5
Analyse de quatre stations marines avec concentration en chlorophylle différente qui ont montré l existence d une corrélation avec taux de fer dans l eau. Au total, assemblage de 7,9 milliards de lectures en 16 millions de contigs ayant permis l identification de 9,4 millions d unigènes dont 19 % seulement possèdent un match dans Pfam. Pour étudier l impact du fer sur la prolifération d un stramenopile, analyse d une espèce donnée (Pelagomonas calceolata) dont on a trois transcriptomes de référence. Etude des fonctions Pfam moins exprimées dans la station avant bloom (absence de fer) que pendant le bloom (présence de fer). Les fonctions impliquées dans la photosynthèse mais aussi dans la production d acides aminés et la traduction ont ainsi des activités plus important pendant le bloom. Une fonction est par contre plus exprimée avant le bloom que pendant, il s agit du gène de flavodoxine impliquée dans la photosynthèse (tout comme la ferredoxine, mais l enzyme n utilise pas de fer comme co-facteur). L organisme utilise la ferredoxine quand il y en a dans le milieu, c est-à-dire pendant le bloom. La glycolyse est également impactée ce qui montre une adaption de P. calceolata à l absence de fer. Perspectives Faire ce genre d analyse sur l ensemble des échantillons de toutes les stations afin d avoir une description globale du transcriptome des eucaryotes présent dans les métagénomes des stations séquencées. Quid des 80% de données qui n ont pas de match Pfam? pour Eric l exploitation des données avec les modules de KEGG pose des problèmes lié à la taille des fragments. Exposé 7 Travaux et problématiques en métagénomique bactérienne au CBiB Aurélien Barre (CBiB) Trois thématiques en métagénomique sont abordées dans le groupe : Virus de plantes (classsification), Santé (CHU de bordeaux pour la polyartrite rhumatoïde) et paléométagénomique. Les questions posées sont classiques en métagénomique : i) obtention de listes d espèces ; ii) comparaison d échantillons ; et iii) fonctionnement du milieu (établissement d un catalogue de gènes). Classification Question du déterminisme de la polyartrite rhumatoïde en terme de phylogénie (existe-t il un déséquilibre des populations bactériennes responsables de l inflammation?) Analyses d échantillons métagénomiques avec des patients sains et des malades puis, en fonction de la population bactérienne, détermination du traitement approprié. La classification des lectures se fait en utilisant la la banque GreenGenes et le système Tango (phases 1 et 2) puis utilisation d un autre outil pour passer dans l espace de nommage du NCBI. Une alternative est l utilisation du système Phylosift qui fait de l assignation taxonomique après un mapping réalisé au moyen de BWA (phase 3). Utilisation de Cytoscape pour intégrer les résultats d analyse et effectuer une représentation sous forme de graphes d espèces sur-représentées chez les malades => est ce que cela peut expliquer l apparition de la maladie? (travail en cours) Pour l analyse comparative, utilisation du pipeline d origine canadienne MetagenAssist. 6
Un workflow éventuellement intégrable sous Galaxy est également en cours de développement. Ce workflow serait dans l esprit de MetagenAssist mais il servirait également à effectuer des assignations taxonomiques et permettrait de visualiser les résultats d une phylogénie. Métagénomique Fonctionnelle Projet Biomines avec IFP Energie Nouvelles. L objectif de ce projet est de déterminer un bioprocess (i.e., un ensemble d enzymes) permettant de produire du bioéthanol. Test de la bibliothèque R mmnet (microbiome metabolic network) intégrée dans Bioconductor qui utilise les données KEGG ainsi que les prédictions enzymatiques issues de de MG-RAST pour constuire les réseaux qui peuvent être ensuite comparés. L annotation fonctionnelle est faite en réalisant des prédictions d ORF sur les lectures au moyen de FragGeneScan (remarque de GP sur le fait que Glimmer-MG a une bien meilleure sensibilité que FragGeneScan, aujourd hui obsolète). Les moyens de calcul utilisés sont ceux du CBiB, c est-à-dire le mésocentre de calcul intensif Aquitaine. Exposé 8 Technologies de séquençage et stratégies d'assemblage de novo Faye Sebastien (Genoscope, WP 2.3) L exposé commence par une présentation des différents paramètres pouvant jouer sur le degré de difficulté des analyses (complexité du génome, technologie de séquençage, méthode d assemblage, etc.) La complexité d un génome est estimée par comptage des k-mers pour déterminer : i) ceux qui sont très répétés ; ii) ceux qui sont «uniques» ; et iii) ceux qui sont rares du fait d erreurs de séquençage. Une fois que l on a une idée de la complexité des données on peut choisir la méthode d assemblage (algorithme glouton, OLC ou graphes de de Bruijn). Suit une discussion sur l utilisation et l intégration de méthodes de séquençage permettant d obtenir des lectures longues : PacBio reads (85% identité). Moleculo qualité top (95% identité). Nanopore (longues lectures mais qualité très médiocre). Un assemblage avec des lectures longues est presque indispensable dans le cas de génomes «complexes». Pour des génomes non complexes la technologie de séquençage «short read» est largement suffisante pour obtenir un assemblage solide avec une approche type de Bruijn. Discussion : école d été en métagénomique Présentation par GP d un projet d école d été 2016 sur l analyse de données métagénomique. L appel à projet d écoles thématiques lancé par l INEE et relayé par le GdR de Génomique Environnementale est passé, mais il faudrait tout de même mettre en place cette école le plus rapidement possible car les besoins sont vraiment importants (essentiellement au niveau pratique). Existant Tour d horizon de quelques formations/workshops en Europe et dans le monde : 7
Formation de l EBI organisée par Rob Finn (http://www.ebi.ac.uk/training/course/metagenomics2015). La prochaine édition se tient en septembre 2015 et les diapositives des conférenciers et des travaux pratiques sont disponibles sur le site. Workshop du TGAC, plus basé sur des exposés que des exercices pratiques (http://www.tgac.ac.uk/metagenomics-bench-to-analysis/). Canadian Bioinformatics Workshop Series : voir site du CBW (http://bioinformatics.ca/workshops/2015/analysis-metagenomic-data-2015). Bilan : peu de «training» mais pas mal de workshops avec exposés sur l état de l art. GP mentionne la sortie du livre «La Métagénomique» aux éditions Quae (http://www.quae.com/fr/r4101-la-metagenomique.html) qui pourrait donner quelques idées d intervenants dans la future école. Lieu Proposition initiale d organisation à Evry/Paris par GP. Contre-propositions d organisation en résidentiel. Nicolas Pons a une adresse pas chère et Christophe Caron a aussi testé deux adresses : Organisation Oléron (http://www.caes.cnrs.fr/vacances/nos-villages/la-vieille-perrotine) o Les + : super site (vélo, salles très pratique, piscine, mer pas loin, etc.) Accueil vraiment de qualité (souplesse, etc.). Repas standard mais option dîner ++. Il faut y aller en mai / juin / septembre / octobre. o Les : connexion internet moyenne. Nantes : devis joint de 14 k pour trois jours. o Les + : réseau internet 100 Mbps symétrique ; repas et cadre ; desserte de Nantes ; hôtel + salle sur le même campus. o Les : peut-être le côté hôtel (moins chaleureux que le site d'oléron par exemple même si le cadre est vraiment pas mal). Partie théorique : en amphi pour pouvoir être nombreux. Partie pratique : 30 personnes environ. Pour permettre aux personnes de n assister qu à la partie théorique, il faudra rassembler les exposés sur deux jours, puis passer à la pratique sur les deux derniers jours. Dates et durée En 2016, JOBIM se déreoulera du 28 au 30 juin à Lyon et il faut donc éviter d organiser l école aux alentours de cette date, ceci d autant plus que la coupe d Europe de football se déroulera en France durant le printemps 2016! Proposition d une durée de quatre jours, allant de lundi midi au vendredi midi. La date approximative serait début septembre. Choix des thématiques Nous devons échanger par mail au cours de l automne 2015 afin de définir des thématiques précises sans essayer de tout couvrir. Deux grands domaines : analyses de tag / analyse globale. Une fois les thèmes définis, il faudra établir une liste d intervenants et procéder à leur invitation le plus rapidement possible. 8
Public visé Cette formation doit pouvoir permettre aux personnes y assistant de traiter par la suite des jeux de données en taille «réelle» (c est-à-dire de très grande taille) ce qui semble proscrire l emploi d un outil comme Galaxy. Du fait de ce prérequis, le public visé serait donc plutôt constitué de bioinformaticiens. Actions/décisions Les personnes ayant des informations pour une organisation en résidentielle envoient un mail à CM et GP pour pouvoir décider rapidement du lieu d organisation. CM s occupe de rassembler les informations sur le financement de cette école (via l IFB et France Génomique et éventuellement les tutelles). GP initie un premier mail pour décider des thématiques à aborder et avoir une liste d intervenants étrangers à inviter + intervenants de notre réseau à solliciter. Ce premier canevas d organisation permettra de faire circuler un doodle (au minimum aux intervenants identifiés) afin de statuer rapidement sur les dates auxquelles cette école devrait être organisée. Compte-rendu rédigé par C. Médigue et G. Perrière 9